本發(fā)明涉及一種多環(huán)芳烴降解基因工程菌株、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來(lái)，由雨水徑流導(dǎo)致的城市面源污染受到越發(fā)廣泛的關(guān)注。為了降低徑流中污染物對(duì)城市水體的危害，國(guó)內(nèi)外普遍采用建設(shè)雨水花園的方式對(duì)雨水徑流進(jìn)行收集與凈化。但長(zhǎng)期運(yùn)行過(guò)程中，某些難降解污染物會(huì)在雨水花園內(nèi)部出現(xiàn)富集現(xiàn)象，加重其內(nèi)部及周邊區(qū)域的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。在這類(lèi)污染物中，多環(huán)芳烴(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，簡(jiǎn)稱(chēng)PAHs)因?yàn)榫哂袕?qiáng)烈的致畸、致癌、致突變效應(yīng)，更受到了重點(diǎn)關(guān)注。

目前，未見(jiàn)針對(duì)雨水花園土壤中PAHs污染修復(fù)的系統(tǒng)研究，而傳統(tǒng)修復(fù)方法普遍通過(guò)接種分離自異位原油污染場(chǎng)地得外源PAHs降解菌開(kāi)展。這些菌株雖然有著良好的PAHs降解能力，但能否在理化性質(zhì)及污染特征均有較大差異的雨水花園土壤中形成優(yōu)勢(shì)并發(fā)揮作用有待驗(yàn)證。在原油污染的土壤中，PAHs的濃度會(huì)達(dá)到較高的水平，足以通過(guò)生物抑制作用保證有降解能力的生物形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。而雨水花園中累積的PAHs濃度要比原油污染土壤低3-5個(gè)數(shù)量級(jí)，由于大量可同化有機(jī)物的存在，直接影響到PAHs特異性降解生物對(duì)于PAHs的優(yōu)先利用；同時(shí)PAHs對(duì)其他微生物的抑制作用減小，使得特異性降解生物難以形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，從而降低了生物修復(fù)作用效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有雨水花園中PAHs生物修復(fù)技術(shù)的不足，提供一種多環(huán)芳烴降解基因工程菌株、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。

一種多環(huán)芳烴降解基因工程菌株，該菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年09月19日，保藏編號(hào)：CGMCCNo.13014，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

一種構(gòu)建所述的多環(huán)芳烴降解基因工程菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)土著優(yōu)勢(shì)菌株的篩選與培養(yǎng)

采集接納道路雨水徑流的實(shí)地雨水花園土壤，提取總DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，分析微生物群落，辨識(shí)優(yōu)勢(shì)菌屬；同時(shí)篩選、培養(yǎng)得到土壤樣品中菌落豐度較高的純種菌株，并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、理化特性研究、抗生素抗性試驗(yàn)及16S rRNA序列同源性分析進(jìn)行鑒定并確立其系統(tǒng)發(fā)育地位；對(duì)比群落分析辨識(shí)出的優(yōu)勢(shì)菌屬，挑選出對(duì)應(yīng)的純種菌株作為雨水花園的土著優(yōu)勢(shì)菌株；

2)重組質(zhì)粒pUT-RHDGfp的構(gòu)建

分別以Mycobacterium vanbaalenii PYR-1菌的基因組DNA及pGFPuv(購(gòu)自Clontech公司，日本)質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增環(huán)羥化雙加氧酶編碼基因序列基因RHD與熒光蛋白編碼基因Gfp；隨后采用重疊PCR的方式將RHD基因與熒光蛋白編碼基因Gfp進(jìn)行融合，得到RHDGfp基因；切膠回收后PCR產(chǎn)物并進(jìn)行純化，采用Not I酶進(jìn)行酶切，同時(shí)切割質(zhì)粒pUT-mini Tn5(Km)；連接酶切產(chǎn)物，得到重組質(zhì)粒pUT-RHDGfp；

3)基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的構(gòu)建

采用三親結(jié)合的方式將融合基因RHDGfp的重組至Pseudomonas putida GLB3染色體，操作所需菌株如下：受體菌(Pseudomonas putida GLB3)、輔助菌(E.coli DH5α(pRK2073))、供體菌(E.coli DH5α(pUT-RHDGfp))；培養(yǎng)至菌落可見(jiàn)后，通過(guò)菌落PCR及陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后的質(zhì)粒酶切進(jìn)行鑒定，篩選構(gòu)建成功的基因工程菌株。

進(jìn)一步地：

步驟3)中各菌株混合比例為1:2:1，混合體系采用10mM MgSO4溶液，所用平板培養(yǎng)基應(yīng)為含有卡那霉素25mg/L及氯霉素25mg/L的LB平板培養(yǎng)基。

各步驟應(yīng)用的引物序列如下：

一種將所述的多環(huán)芳烴降解基因工程菌株用于雨水花園土壤中PAHs污染修復(fù)的應(yīng)用。

一種將所述的多環(huán)芳烴降解基因工程菌株的構(gòu)建方法用于雨水花園土壤中PAHs污染修復(fù)的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，從原位雨水花園中采集土樣，加入PAHs二氯甲烷溶液，最終濃度10.00mg/kg，自然風(fēng)干，粉碎，混勻；按照質(zhì)量比5％加入所述基因工程菌株菌劑，混合均勻，每7天翻土一次，維持土壤含水量20-50wt％，并檢測(cè)PAHs含量。

進(jìn)一步地，所述基因工程菌株用于接納道路雨水徑流的雨水花園土壤中多環(huán)芳烴的降解，且具有熒光指示降解過(guò)程的功能。

一種針對(duì)所述的應(yīng)用的修復(fù)效果檢驗(yàn)方法，包括以下步驟：

取基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3接種于LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24h，將長(zhǎng)出的單菌落轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素100μg/ml的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃，120rpm搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀值為1；將所得菌液按照體積比5％的比例轉(zhuǎn)接到LB肉湯培養(yǎng)基，28℃，180rpm培養(yǎng)16h，得到Pseudomonas putida GLEB3的發(fā)酵菌液。將其與滅菌的秸稈生物炭按1：2(V：W)混勻后風(fēng)干，制成固體菌劑；

從原位雨水花園中采集土樣，加入PAHs二氯甲烷溶液，最終濃度10.00mg/kg，自然風(fēng)干，粉碎，混勻。按照質(zhì)量比5％加入生物修復(fù)固體菌劑，混合均勻，每7天翻土一次，維持土壤含水量20-40wt％，同時(shí)檢測(cè)PAHs含量，評(píng)價(jià)基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的修復(fù)效果。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果有：

本發(fā)明在原位解析雨水花園中PAHs污染特征及微生物群落結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，以其中篩選出的土著優(yōu)勢(shì)菌種Pseudomonas putida GLB3為受體菌(GenBank accession No.KT804567)，利用外源環(huán)羥化雙加氧酶編碼基因(片段來(lái)源Mycobacterium vanbaalenii PYR-1，GenBank accession No.CP000511)構(gòu)建重組載體，并重組至受體菌基因組，提升原有土著優(yōu)勢(shì)菌種的PAHs降解能力，解決外源PAHs降解菌在雨水花園土壤中無(wú)法形成優(yōu)勢(shì)種群而難以發(fā)揮降解作用的問(wèn)題。

附圖說(shuō)明

圖1是雨水花園與不接納雨水徑流的對(duì)照組土壤中相對(duì)豐度處于前十位的原核微生物菌屬分布圖。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例雨水花園中土壤中所篩選出優(yōu)勢(shì)菌株的基于16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

圖3是本發(fā)明實(shí)施例電泳照片，以RHD-f1和RHD-r1為引物擴(kuò)增RHD片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小2010bp；以Gfp-f2和Gfp-r2為引物擴(kuò)增Gfp片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小743bp；以RHD-f1和Gfp-r2通過(guò)重疊PCR擴(kuò)增RHDGfp片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小2719bp。

圖4是本發(fā)明實(shí)施例電泳照片，以RHD-f1和Gfp-r2進(jìn)行PCR鑒定RHDGfp片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小2719bp。

圖5是本發(fā)明實(shí)施例電泳照片，以Not I酶切pUT-RHDGfp載體，酶切產(chǎn)物大小為7.1kb與2.7kb。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例電泳照片，以RHD-f1和Gfp-r2進(jìn)行菌落PCR鑒定三親結(jié)合重組菌獲得的RHDGfp片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小2719bp。

圖7是本發(fā)明實(shí)施例電泳照片，以RHD-f1和Gfp-r2進(jìn)行PCR鑒定重組菌基因組中的RHDGfp片段，擴(kuò)增產(chǎn)物大小2719bp。

圖8是本發(fā)明實(shí)施例基因工程菌Pseudomonas putida GLEB3對(duì)芘的降解能力及降解過(guò)程中RHDGfp片段的表達(dá)量及熒光強(qiáng)度變化圖。

圖9是對(duì)比基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3與供體菌株Mycobacterium vanbaalenii PYR-1對(duì)雨水花園土壤中PAHs的降解效率，表示出采用不同菌株進(jìn)行生物強(qiáng)化修復(fù)過(guò)程中土壤樣品中芘含量的變化。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例提供一株基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3(保藏號(hào)CGMCCNo.13014)，已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年09月19日，保藏編號(hào)：CGMCCNo.13014保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。

本發(fā)明實(shí)施例的基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的構(gòu)建及效果驗(yàn)證方法，如下：

1、土著優(yōu)勢(shì)菌株的篩選與培養(yǎng)

采集接納道路雨水徑流的實(shí)地雨水花園土壤，提取總DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，分析微生物群落，辨識(shí)優(yōu)勢(shì)菌屬；同時(shí)篩選、培養(yǎng)得到土壤樣品中菌落豐度較高的純種菌株，并通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、理化特性研究、抗生素抗性試驗(yàn)及16S rRNA序列同源性分析進(jìn)行鑒定并確立其系統(tǒng)發(fā)育地位。對(duì)比群落分析辨識(shí)出的優(yōu)勢(shì)菌屬，挑選出對(duì)應(yīng)的純種菌株作為雨水花園的土著優(yōu)勢(shì)菌株。

2、重組質(zhì)粒pUT-RHDGfp的構(gòu)建

分別以Mycobacterium vanbaalenii PYR-1菌的基因組DNA及pGFPuv(購(gòu)自Clontech公司，日本)質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增環(huán)羥化雙加氧酶編碼基因序列基因RHD與熒光蛋白編碼基因Gfp。隨后采用重疊PCR的方式將RHD基因與熒光蛋白編碼基因Gfp進(jìn)行融合，得到RHDGfp基因。切膠回收后PCR產(chǎn)物并進(jìn)行純化，采用Not I酶進(jìn)行酶切，同時(shí)切割質(zhì)粒pUT-mini Tn5(Km)。連接酶切產(chǎn)物，得到重組質(zhì)粒pUT-RHDGfp。

3、基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的構(gòu)建

采用三親結(jié)合的方式將融合基因RHDGfp的重組至Pseudomonas putida GLB3染色體，操作所需菌株如下：受體菌(Pseudomonas putida GLB3)、輔助菌(E.coli DH5α(pRK2073))、供體菌(E.coli DH5α(pUT-RHDGfp))。各菌株混合比例為1:2:1，混合體系采用10mM MgSO₄溶液，所用平板培養(yǎng)基應(yīng)為含有卡那霉素(25mg/L)及氯霉素(25mg/L)的LB平板培養(yǎng)基。培養(yǎng)至菌落可見(jiàn)后，通過(guò)菌落PCR及陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)后的質(zhì)粒酶切進(jìn)行鑒定，篩選構(gòu)建成功的基因工程菌株。

將篩選所得菌株接種至含有芘的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，30℃，120rpm振蕩培養(yǎng)，每隔2小時(shí)取1ml菌懸液測(cè)定芘的濃度；采用引物RHD-fq與RHD-rq對(duì)RHDGfp基因的表達(dá)量進(jìn)行定量；同時(shí)采用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)395nm，發(fā)射波長(zhǎng)509nm，狹縫寬度5nm)。

4、基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的應(yīng)用效果驗(yàn)證

取基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3接種于LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24h，將長(zhǎng)出的單菌落轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃，120rpm搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀值為1。將所得菌液按照體積比5％的比例轉(zhuǎn)接到LB肉湯培養(yǎng)基，28℃，180rpm培養(yǎng)16h，得到Pseudomonas putida GLEB3的發(fā)酵菌液。將其與滅菌的秸稈生物炭按1：2(V：W)混勻后風(fēng)干，制成固體菌劑。

從原位雨水花園中采集土樣，加入PAHs二氯甲烷溶液(最終濃度10.00mg/kg)，自然風(fēng)干，粉碎，混勻。按照質(zhì)量比5％加入生物修復(fù)固體菌劑，混合均勻，每7天翻土一次，維持土壤含水量20-40wt％，同時(shí)檢測(cè)PAHs含量，評(píng)價(jià)基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的修復(fù)效果。

上述各步驟中所用引物名稱(chēng)、序列及作用如下：

實(shí)施例1：土著優(yōu)勢(shì)菌株的篩選與培養(yǎng)

采集實(shí)地雨水花園與不接納道路雨水徑流的對(duì)照組土壤，提取總DNA進(jìn)行高通量測(cè)序，根據(jù)各菌屬的相對(duì)豐度高低辨別出雨水花園土壤中前十位的優(yōu)勢(shì)菌屬(圖1：生物滯留池與對(duì)照組土壤中相對(duì)豐度最高的十種原核微生物菌屬分布)；同時(shí)篩選、培養(yǎng)得到土壤樣品中菌落豐度較高的純種菌株，通過(guò)16S rRNA序列同源性分析確立其系統(tǒng)發(fā)育地位。篩選出屬于優(yōu)勢(shì)菌屬的純菌株作為受體菌。本實(shí)施例中選用一株惡臭假單胞菌菌株P(guān)seudomonas putida GLB3為受體菌(GenBank accession No.KT804567)(圖2：基于16S rRNA基因序列的菌株GLB3的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù))。但本發(fā)明并不局限于此，圖一種所列出的其他菌屬下的菌株均可作為受體菌。

實(shí)施例2：重組質(zhì)粒pUT-RHDGfp的構(gòu)建

以Mycobacterium vanbaalenii PYR-1菌的基因組DNA為模板，使用引物以RHD-f1和RHD-r1為引物擴(kuò)增去除了RHD基因編碼的鐵硫蛋白β亞基終止子并連接有Gfp基因5’端17個(gè)堿基的序列，擴(kuò)增產(chǎn)物大小2010bp；以pGFPuv(購(gòu)自Clontech公司，日本)質(zhì)粒為模板，使用引物Gfp-f2和Gfp-r2擴(kuò)增去除了Gfp基因編碼的綠色熒光蛋白的啟動(dòng)子并連接有RHD基因3’端17個(gè)堿基的序列，擴(kuò)增產(chǎn)物大小743bp；以RHD-f1和Gfp-r2作引物，上述兩條擴(kuò)增片段作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增得到重疊目的片段—RHDGfp融合基因，擴(kuò)增產(chǎn)物大小2719bp(圖3：重疊PCR擴(kuò)增RHDGfp基因，其中M：5000bp DNA Marker，1：RHD基因片段，2：RHDGfp基因片段，3：Gfp基因片段)。RHD基因與Gfp基因的PCR反應(yīng)體系(50μl)：模板DNA1.0μl；HS Premix(寶生工，大連)25.0μl；50μM引物0.5μl；ddH2O 23.0μl；RHD基因與Gfp基因的PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；(94℃預(yù)變性30s—59℃退火5s—72℃延伸90s)×30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

重疊PCR反應(yīng)體系(50μl)：RHD2基因擴(kuò)增產(chǎn)物(50ng/μl)0.5μl；Gfp基因擴(kuò)增產(chǎn)物(50ng/μl)0.5μl；HS Premix(寶生工，大連)25.0μl；50μM引物0.3μl；ddH2O 23.4μl；重疊PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；(94℃預(yù)變性30s—55℃退火7s—72℃延伸150s)×30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。

切膠回收后重疊PCR產(chǎn)物并進(jìn)行純化，采用Not I酶進(jìn)行酶切，同時(shí)切割質(zhì)粒pUT-mini Tn5(Km)。連接酶切產(chǎn)物，得到重組質(zhì)粒pUT-RHDGfp。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coli DH5αλpir中。挑取陽(yáng)性克隆利用引物RHD-f1和Gfp-r2進(jìn)行菌落PCR進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果呈陽(yáng)性(圖4：pUT-RHDGfp載體的PCR驗(yàn)證，其中M：5000bp DNA Marker，1：RHDGfp基因片段)；同時(shí)，對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行Not I酶切，凝膠電泳結(jié)果顯示在7.1kb與2.7kb處附近存在兩條條帶(圖5：pUT-RHDGfp載體的酶切鑒定，其中M：5000bp DNA Marker，1：Not I酶切產(chǎn)物)，分別對(duì)應(yīng)pUT-mini Tn5(Km)質(zhì)粒與RHDGfp基因，證明pUT-RHDGfp重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

序列1為實(shí)施例2中由RHD-f1和Gfp-r2擴(kuò)增得到的RHDGfp序列(去除酶切位點(diǎn)2695bp)。

實(shí)施例3：基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的構(gòu)建

采用三親結(jié)合的方式將融合基因RHDGfp的重組至Pseudomonas putida GLB3染色體，操作所需菌株如下：受體菌(Pseudomonas putida GLB3)、輔助菌(E.coli DH5α(pRK2073))、供體菌(E.coli DH5α(pUT-RHDGfp))。各菌株混合比例為1:2:1，混合體系采用10mM MgSO4溶液，所用平板培養(yǎng)基應(yīng)為含有卡那霉素(25mg/L)及氯霉素(25mg/L)的LB平板培養(yǎng)基。培養(yǎng)至菌落可見(jiàn)后，挑取菌落，采用引物RHD-f1和Gfp-r2進(jìn)行RHDGfp基因的菌落PCR驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果呈陽(yáng)性(圖6：三親結(jié)合重組菌的PCR驗(yàn)證，其中M：5000bp DNA Marker，1-3：RHDGfp基因片段)，表明RHDGfp基因已成功轉(zhuǎn)化入受體菌Pseudomonas putida GLB3，將該重組菌命名為Pseudomonas putida GLEB3(保藏號(hào)CGMCCNo.13014)。在含有氯霉素的LB培養(yǎng)基中增殖重組菌Pseudomonas putida GLEB3，分別提取其基因組DNA與質(zhì)粒DNA，并以此為模板，使用引物RHD-f1和Gfp-r2擴(kuò)增RHDGfp基因。重組菌Pseudomonas putida GLEB3的基因組可以擴(kuò)增出RHDGfp基因片段，而提取的質(zhì)粒DNA則無(wú)法擴(kuò)增(圖7：RHDGfp基因的定位，其中M：5000bp DNA Marke，1：基因組的RHDGfp基因擴(kuò)增，2：提取質(zhì)粒后RHDGfp基因擴(kuò)增)，說(shuō)明RHDGfp基因在重組菌株生長(zhǎng)的過(guò)程中已經(jīng)整合至細(xì)菌基因組。

將篩選所得菌株接種至含有芘的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，30℃，120rpm振蕩培養(yǎng)，每隔2小時(shí)取1ml菌懸液測(cè)定芘的濃度；采用引物RHD-fq與RHD-rq對(duì)RHDGfp基因的表達(dá)量進(jìn)行定量；同時(shí)采用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)395nm，發(fā)射波長(zhǎng)509nm，狹縫寬度5nm)。該菌株對(duì)芘的降解能力，降解過(guò)程中RHDGfp片段的表達(dá)量以及熒光強(qiáng)度變化均表明RHDGfp基因賦予了重組菌對(duì)芘的降解能力及相應(yīng)的熒光指示功能(圖8：基因工程菌Pseudomonas putida GLEB3對(duì)芘的降解曲線(xiàn)與(a)生長(zhǎng)曲線(xiàn)，(b)熒光強(qiáng)度，(c)RHDGfp融合基因表達(dá)量的對(duì)比，(d)熒光強(qiáng)度變化與表達(dá)量比)。

序列2為實(shí)施例3中由RHD-fq和RHD-rq擴(kuò)增得到的RHDGfp序列(208bp)。

實(shí)施例4：基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3的應(yīng)用效果驗(yàn)證

取基因工程菌株P(guān)seudomonas putida GLEB3接種于LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)24h，將長(zhǎng)出的單菌落轉(zhuǎn)接到含有卡那霉素(100g/ml)的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，28℃，120rpm搖床培養(yǎng)至OD600值為1。將所得菌液按照體積比5％的比例轉(zhuǎn)接到LB肉湯培養(yǎng)基，28℃，180rpm培養(yǎng)16h，得到Pseudomonas putida GLEB3的發(fā)酵菌液。將其與滅菌的秸稈生物炭按1：2(V：W)混勻后風(fēng)干，制成固體菌劑。

本發(fā)明利用的受體菌株是在深圳光明新區(qū)低影響示范工程雨水花園土壤中獲得的一株惡臭假單胞菌菌株P(guān)seudomonas putida GLB3為受體菌(GenBank accession No.KT804567)，經(jīng)高通量測(cè)序解析土壤生物群落結(jié)構(gòu)確定該菌株所在屬別為優(yōu)勢(shì)菌屬。供體菌株Mycobacterium vanbaalenii PYR-1(GenBank accession No.CP000511)，購(gòu)自德國(guó)DSMZ菌種庫(kù)，具有良好的PAHs降解效果。本發(fā)明應(yīng)用基因工程手段，將來(lái)自供體菌株的環(huán)羥化雙加氧酶編碼基因重組至受體菌基因組，以達(dá)到提升雨水花園中原有土著優(yōu)勢(shì)菌的PAHs降解能力的目的。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的/優(yōu)選的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，其還可以對(duì)這些已描述的實(shí)施例做出若干替代或變型，而這些替代或變型方式都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

序列表

序列表

<110> 清華大學(xué)深圳研究生院

<120> 一種多環(huán)芳烴降解基因工程菌株、其構(gòu)建方法及應(yīng)用

<130> 16A100484JYC

<160> 2

<210> 1

<211> 2695

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtctattg tcggtaagaa cgacattcag caactggtag cggcgggcca agaaggcctt 60

gctaagggcc gtctgcccgc cgggctggtc gccaacgcag aactccacaa gctcgaagct 120

cagcgagtct tcggccggtg ctggcaattc ctggcccacg agacggagat cccccaggca 180

ggggactacg tggtccgata tctgggtggc ggttcgatca tcgttgtccg cggcgaagac 240

ggcgaagtgc gcgccatggc gaactcgtgt cggcaccgcg gaacaatgct gtgccgcacg 300

gagatgggca acacttcgca cttccgctgc ccctatcacg gctggaccta ccgcaatacc 360

ggaactctgg cgggtgtacc cgcacaaaaa gaggtctatg gggtcgagat ggacaagaac 420

gagtggagtc ttacccaggt tccgcgcctc gagaactacc gcggaatgat attcggttgc 480

ctggacgaga aggcagaacc tctcgttgat tatttgggcg atatggcgtg gtatctggac 540

ctgatcaccc agaagtccaa gggtggactg gaggtgcggg gtgagcccca gcgttggatc 600

atcgactcca actggaagct cggcgcggac aactttgtcg gggacgccta ccacacgttg 660

atgacgcacc gatcggcggt cgagctcggt ctggctccgc ccgatccaaa attcgcgtcg 720

gagccggcgc atatcagtct ctccaacggt cacggcctcg gcgtcctcgg ggtgccgccc 780

gggcaaccga tgccgccctt tatgaactat ccacccgagg tcgtcgatgg actcgcagcg 840

gcttacggcg atcaggaccg cgcagacatg cttcagcgtt cggccttcat tcacggcacg 900

gtctttccca acctgtcgtt cctcaacgtc ctcatcggta gggacaagaa gtcaatgcca 960

gtgccgatgt tgacatttcg gctgtggcgt ccactgtcac acgacacgat ggaagtttgg 1020

tcgtggtttc tcgtcgagaa ggatgccgac gaagagttca aacagcagtc gtatgagacc 1080

tacgtacgaa cgttcggcat ctccggtgtg ttcgaacagg acgacgccga gacttggcgc 1140

tccatcactg cgggaacgca aggcattctc gcaggcagcc agacactcaa cttcgagatg 1200

ggcatgggtg tgctgaccag cgacgacacg tggaaggggc ccggtcgtcc cctgtccagc 1260

gggtacgcgg agcgtaacca acgcgaattc tggggtcgcc tgttggagtt actcaccgac 1320

tcaggcgatg acgccagcga aaccgagccc aaaccccaac tactcgcgca atctcggacc 1380

aatacagacg aggtcgcctg atgaggcatc aggcaactgc ttgtctcaca accacaatca 1440

accaggtcat aaaggatggt gtgccatggt agcgacggtc gagcaacagc ttctgctccg 1500

ctgcgagatg gagaactttc tgttcgaaga ggcggagctg ctgaacgacg gccggtttca 1560

cgactggcta gaactgtgcg ccgaagatat ccactacgtc atcccggtgc gcgtgagcag 1620

agaacgcgcc aacggcgacg gaaattcgac gaccatgacc cactgggatg acgactacgc 1680

aggcttggag ctgcgggtgc tacgtctgga caccgaatac gcatgggcag aagatccgcc 1740

ctcacggatc cgacaccacg tgtcgaatgt gcgggtacgc cccggcgcag ggacggacga 1800

atacgatgtc cgctccaacc ttctcgtgtt ccgcaacagg ggggacagcc cgcagcacga 1860

cctcatctct gcggagcgcc acgatgtcat ccgccgcagt gagatgggcc tgcggttagc 1920

gagccgacgg gtagtgcttg accatgccgt tgtcggcacc cacaatctgg ctaacttctt 1980

cagtaaagga gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt cttgttgaat tagatggtga 2040

tgttaatggg cacaaatttt ctgtcagtgg agagggtgaa ggtgatgcaa catacggaaa 2100

acttaccctt aaatttattt gcactactgg aaaactacct gttccatggc caacacttgt 2160

cactactttc tcttatggtg ttcaatgctt ttcccgttat ccggatcata tgaaacggca 2220

tgactttttc aagagtgcca tgcccgaagg ttatgtacag gaacgcacta tatctttcaa 2280

agatgacggg aactacaaga cgcgtgctga agtcaagttt gaaggtgata cccttgttaa 2340

tcgtatcgag ttaaaaggta ttgattttaa agaagatgga aacattctcg gacacaaact 2400

cgagtacaac tataactcac acaatgtata catcacggca gacaaacaaa agaatggaat 2460

caaagctaac ttcaaaattc gccacaacat tgaagatgga tccgttcaac tagcagacca 2520

ttatcaacaa aatactccaa ttggcgatgg ccctgtcctt ttaccagaca accattacct 2580

gtcgacacaa tctgcccttt cgaaagatcc caacgaaaag cgtgaccaca tggtccttct 2640

tgagtttgta actgctgctg ggattacaca tggcatggat gagctctaca aataa 2695

<210> 2

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacggacgaa tacgatgtcc gctccaacct tctcgtgttc cgcaacaggg gggacagccc 60

gcagcacgac ctcatctctg cggagcgcca cgatgtcatc cgccgcagtg agatgggcct 120

gcggttagcg agccgacggg tagtgcttga ccatgccgtt gtcggcaccc acaatctggc 180

taacttctt 189