本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株松樹內(nèi)生細(xì)菌短小芽孢桿菌LYMC-3及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

松樹萎蔫病是由松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)寄生在松屬樹種體內(nèi)取食營養(yǎng)而導(dǎo)致樹木迅速死亡的一種特大毀滅性病害，屬國際重要檢疫對(duì)象(楊寶君等，2003)，列為森林病蟲害之首，被稱為“無煙的森林火災(zāi)”。該線蟲主要分布在美國、加拿大、墨西哥、日本、韓國、希臘、中國和葡萄牙等多個(gè)國家。我國自1982年在南京發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)已擴(kuò)散到江蘇、浙江、安徽、福建、江西、山東、河南、湖北、湖南、廣東、廣西、重慶、四川、貴州、陜西、香港和臺(tái)灣等地，對(duì)我國造成林業(yè)經(jīng)濟(jì)、森林生態(tài)上的巨大損失和自然景觀的嚴(yán)重破壞，并對(duì)廣大適生區(qū)的松林構(gòu)成嚴(yán)重威脅。在我國，松材線蟲的主要傳播媒介是松墨天牛(Monochamus alternatus)。目前生產(chǎn)上對(duì)該病的防治主要靠加強(qiáng)檢疫和清理林間病死樹，輔以對(duì)松墨天牛的化學(xué)防治和生物防治，而針對(duì)病原松材線蟲的防治，尤其是松材線蟲的生物防治研究的較少。

目前針對(duì)松材線蟲的生防研究主要集中在殺線植物、真菌和放線菌等幾類因子上，而有關(guān)細(xì)菌用作松材線蟲生防因子的報(bào)道較少，植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)松材線蟲的生防研究更是極少。利用內(nèi)生細(xì)菌防治植物病害一直是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。以前絕大多數(shù)植物病害生防菌是從土壤或植物根際土壤微生物中分離篩選得到的。但由于這些土壤微生物易受外界條件的影響，并難于在與土壤、植物根際或葉圍習(xí)居微生物的競(jìng)爭中長期占優(yōu)勢(shì)，因而極大地影響了其實(shí)用價(jià)值(李長松，1992)。而植物內(nèi)生細(xì)菌作為生防因子有很多優(yōu)點(diǎn)：它們分布于植物的不同組織中，有充足的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)受到植物組織的保護(hù)，不受外部惡劣環(huán)境如強(qiáng)烈日光、紫外線風(fēng)雨等的影響，具有穩(wěn)定的生態(tài)環(huán)境(易有金等，2007)。因此，內(nèi)生細(xì)菌相對(duì)于其它細(xì)菌更易發(fā)揮生防作用。利用內(nèi)生細(xì)菌防治植物真菌和細(xì)菌病害的研究很多，而在防治線蟲病害方面研究的很少。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一株松樹內(nèi)生短小芽孢桿菌，滿足使用需求。本發(fā)明的另一目的是提供一株松樹內(nèi)生短小芽孢桿菌的應(yīng)用。

技術(shù)方案：為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一株松樹內(nèi)生細(xì)菌，分類命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LYMC-3，已保藏與中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為：CCTCC NO：M 2016775，保藏日期：2016年12月21日，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。

所述的短小芽孢桿菌LYMC-3在殺松材線蟲中的應(yīng)用。

所述的短小芽孢桿菌LYMC-3在殺松材線蟲卵中的應(yīng)用。

一種制備所述的短小芽孢桿菌LYMC-3的無菌發(fā)酵濾液的方法：將保存于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上的短小芽孢桿菌LYMC-3接入含牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基50mL的三角瓶中，于28℃和無光照條件下以200r/min轉(zhuǎn)速搖培；將搖培4d后的細(xì)菌培養(yǎng)液用濾膜孔徑為0.22μm的細(xì)菌過濾器將菌體過濾后，所得的濾液為無菌發(fā)酵濾液。

所述的制備短小芽孢桿菌LYMC-3的無菌發(fā)酵濾液的方法所獲得的無菌發(fā)酵濾液。

所述的無菌發(fā)酵濾液在殺松材線蟲中的應(yīng)用。

所述的無菌發(fā)酵濾液在殺松材線蟲卵中的應(yīng)用。

本發(fā)明人從南京中山陵、上海辰山植物園、洛陽隋唐植物園的黑松、馬尾松、濕地松和火炬松莖部共分離到植物內(nèi)生細(xì)菌137株，對(duì)137株細(xì)菌進(jìn)行殺線活性的測(cè)定。從中篩選出一株無菌發(fā)酵濾液對(duì)松材線蟲及其蟲卵有強(qiáng)烈毒殺作用的細(xì)菌LYMC-3。

LYMC-3的鑒定：菌株LYMC-3在NA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，菌落呈白色蠟狀，邊緣不整齊，干燥，有皺褶，菌落大小中等。細(xì)胞呈桿狀，革蘭氏染色陽性，大小為(0.8～0.9)μm×(1.5～3.0)μm，芽孢卵圓形，中生，周生鞭毛，具運(yùn)動(dòng)性。革蘭氏染色陽性，氧化酶反應(yīng)陰性，接觸酶反應(yīng)陽性，明膠水解陽性，淀粉水解陽性，甲基紅試驗(yàn)陰性，V-P反應(yīng)陽性，硝酸鹽還原反應(yīng)陰性，吲哚試驗(yàn)陰性。在Biolog鑒定培養(yǎng)16～24h后，測(cè)得LYMC-3為Bacillus pumilus，SIM值為0.624。16S rDNA序列分析，測(cè)序所得菌株LYMC-3的序列長度為1400bp(SEQ ID NO.1所示)。將LYMC-3的16SrDNA序列與GenBank中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，與LYMC-3菌株相似性最高的是Bacillus pumilus，同源性達(dá)到99％。將比對(duì)獲得的同源序列和測(cè)定序列運(yùn)用ClustalX軟件進(jìn)行多重序列的同源性分析，然后利用MEGA6.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，LYMC-3與Bacillus pumilus同屬一個(gè)遺傳分枝。最終確定菌株LYMC-3為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)LYMC-3。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的松樹內(nèi)生短小芽孢桿菌LYMC-3，為松樹內(nèi)生細(xì)菌，其無菌發(fā)酵濾液具有很強(qiáng)的殺線作用，無菌發(fā)酵濾液的原液及稀釋2倍、4倍、10倍液處理松材線蟲24h后，其死亡率達(dá)到100％，且死亡的蟲體全部消解。經(jīng)無菌發(fā)酵濾液處理過的蟲卵均未孵化，且蟲卵的卵殼受到了破壞，可見該短小芽孢桿菌LYMC-3在殺線方面講具有很好的應(yīng)用前景，具有很好生防作用。

附圖說明

圖1是LYMC-3無菌發(fā)酵濾液對(duì)松材線蟲的毒殺作用(蟲體消解)結(jié)果圖；

圖2是LYMC-3無菌發(fā)酵濾液對(duì)蟲卵的影響(卵殼破壞)結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1短小芽孢桿菌LYMC-3無菌發(fā)酵濾液的制備

將保存于牛肉膏蛋白胨(每1000mL蒸餾水含蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，pH＝7.2～7.4)固體培養(yǎng)基上的短小芽孢桿菌LYMC-3接入含牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基50mL的三角瓶中，于28℃和無光照條件下以200r/min轉(zhuǎn)速搖培。將搖培4d后的細(xì)菌培養(yǎng)液用濾膜孔徑為0.22μm的細(xì)菌過濾器將菌體過濾后，所得的濾液為試驗(yàn)中的無菌發(fā)酵濾液。

實(shí)施例2短小芽孢桿菌LYMC-3無菌發(fā)酵濾液殺線活性的測(cè)定

供試線蟲的培養(yǎng)和線蟲懸浮液的制備：供試松材線蟲由南京林業(yè)大學(xué)江蘇省有害生物入侵預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，分離于江蘇省連云港地區(qū)發(fā)病的黑松上。松材線蟲采用灰葡萄孢(Botrytis cinerca)培養(yǎng)，將線蟲接種在長滿灰葡萄孢的PDA平板上，放置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至灰葡萄孢菌絲消失，線蟲長滿平板。采用貝爾曼漏斗法分離收集線蟲,然后離心消毒濃縮配制成約20條/μL的線蟲懸液。

殺線活性測(cè)定：將制備的短小芽孢桿菌LYMC-3無菌發(fā)酵濾液(實(shí)施例1制備)分別稀釋2倍、4倍和10倍，取1mL不同稀釋倍數(shù)的無菌發(fā)酵濾液注入1.5mL離心管中，再注入50μL線蟲懸液約1000條線蟲，混合。分別于處理12h和24h后吸取混合液50μL約50條線蟲在體視顯微鏡下觀察線蟲死亡情況以及蟲體的消解情況。每處理重復(fù)三次，以不接菌的NA液體培養(yǎng)基和清水為對(duì)照。線蟲死亡標(biāo)準(zhǔn)是蟲體僵直，用解剖針攪動(dòng)或接觸刺激時(shí)仍不活動(dòng)。

表1短小芽孢桿菌LYMC-3無菌發(fā)酵濾液對(duì)松材線蟲的殺傷效果

結(jié)果(表1)表明：松材線蟲經(jīng)短小芽孢桿菌LYMC-3無菌發(fā)酵濾液原液及稀釋2倍、4倍、10倍液處理24h后，其死亡率達(dá)到100％，且死亡的蟲體全部消解(圖1)。說明LYMC-3無菌發(fā)酵濾液具有極強(qiáng)的殺線活性。

實(shí)施例3短小芽孢桿菌LYMC-3無菌發(fā)酵濾液對(duì)松材線蟲卵的影響

采用貝爾曼漏斗法收集松材線蟲，挑取一定數(shù)量的雌、雄成蟲于小培養(yǎng)皿中，加適量清水，放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待線蟲產(chǎn)出大量卵時(shí)，并用清水反復(fù)沖洗培養(yǎng)皿，因?yàn)橄x卵可以黏附在培養(yǎng)皿底面，在沖洗沖洗線蟲時(shí)仍可保留在培養(yǎng)皿底部。在顯微鏡下觀察，確保培養(yǎng)皿中無線蟲存在后，取2mL無菌發(fā)酵濾液(實(shí)施例1制備)原液注入到小培養(yǎng)皿中，放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。以清水處理為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。分別在處理24h、48h、72h、96h，在顯微鏡下觀察蟲卵的孵化情況，統(tǒng)計(jì)孵化率。

表2短小芽孢桿菌LYMC-3無菌發(fā)酵濾液對(duì)松材線蟲卵孵化率的影響

結(jié)果(表2)表明：經(jīng)短小芽孢桿菌LYMC-3無菌發(fā)酵濾液處理過的蟲卵均未孵化，在高倍顯微鏡下還觀察到蟲卵的卵殼受到了破壞(圖2)。而對(duì)照清水處理的蟲卵在96h后的孵化率為87％。說明無菌發(fā)酵濾液可以抑制蟲卵的正常孵化過程。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林業(yè)大學(xué)

<120> 一株松樹內(nèi)生細(xì)菌短小芽孢桿菌LYMC-3及其應(yīng)用

<130> 100

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1400

<212> DNA

<213> Bacillus pumilus

<400> 1

tgctatacat gcaagtcgag cggacagaag ggagcttgct cccggatgtt agcggcggac 60

gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggagc 120

taataccgga tagttccttg aaccgcatgg ttcaaggatg aaagacggtt tcggctgtca 180

cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgggg taatggctca ccaaggcgac 240

gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300

cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc 360

cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtgcg 420

agagtaactg ctcgcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480

gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc 540

gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga 600

aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660

tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag 720

gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780

gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc 840

cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900

cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960

tctgacaacc ctagagatag ggctttccct tcggggacag agtgacaggt ggtgcatggt 1020

tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat 1080

cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa 1140

ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1200

ggacagaaca aagggctgca agaccgcaag gtttagccaa tcccataaat ctgttctcag 1260

ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320

gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt 1380

ttgcaacacc cgaagtcggt 1400