本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)肝素前體的重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

肝素(Heparin)和硫酸乙酰肝素(HS)屬于一類高度硫酸化的糖胺聚糖(GAGs)，糖胺聚糖是一類由重復(fù)的二糖單元組成的不分支的帶負(fù)電荷的多糖，由于其獨(dú)特的生理功能，糖胺聚糖組成了一類具有巨大治療應(yīng)用潛力的化合物。肝素作為一種抗凝血和抗血栓藥物，在深部靜脈血栓形成、腎透析和留置導(dǎo)管分流術(shù)、及術(shù)后血栓控制等醫(yī)療措施中使用。同時(shí)還具有抗血脂，抗炎、抗腫瘤、抑制細(xì)菌粘附等作用，自1918年被發(fā)現(xiàn)后被廣泛應(yīng)用于臨床作為抗凝血藥物。其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生物活性多樣等特點(diǎn)，研發(fā)以肝素和硫酸乙酰肝素為骨架的新藥已成為近年來(lái)多糖藥物研究的熱點(diǎn)。

肝素主要通過(guò)動(dòng)物提取法獲得，然而該方法存在種間疾病感染和過(guò)硫酸軟骨素污染等風(fēng)險(xiǎn)，且提取過(guò)程往往造成環(huán)境污染。另外，通過(guò)化學(xué)法也可從頭合成低分子量的肝素，但因原料昂貴、步驟繁多和產(chǎn)量極低等缺點(diǎn)難以進(jìn)行大規(guī)模制備。近年來(lái)，以肝素前體為合成起點(diǎn)進(jìn)行硫酸化的化學(xué)酶法逐漸受到研究者的重視，因此，在微生物中實(shí)現(xiàn)肝素前體的高產(chǎn)成為了重要環(huán)節(jié)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種高產(chǎn)肝素前體的重組枯草芽孢桿菌，是在枯草芽孢桿菌B.subtilis 168基因組整合表達(dá)KfiC和KfiA基因的基礎(chǔ)上，以pP43NMK為表達(dá)載體共表達(dá)肝素前體合成途徑的關(guān)鍵酶基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述共表達(dá)是指共表達(dá)UDP-GlcUA途徑的關(guān)鍵酶基因pgcA、gtaB、tuaD，或共表達(dá)UDP-GlcNAc途徑的關(guān)鍵酶基因glmS、glmM、glmU。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述共表達(dá)是指組合共表達(dá)，所述組合共表達(dá)是共表達(dá)tuaD和glmU，或共表達(dá)tuaD、glmU、gtaB、glmM、glmS。。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，是以整合共表達(dá)KfiC和KfiA基因的B.subtilis 168為宿主，以pP43NMK為表達(dá)載體共表達(dá)肝素前體合成途徑的關(guān)鍵酶基因；所述共表達(dá)是指共表達(dá)UDP-GlcUA途徑的關(guān)鍵酶基因pgcA、gtaB、tuaD，或共表達(dá)UDP-GlcNAc途徑的關(guān)鍵酶基因glmS、glmM、glmU。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述共表達(dá)是指組合共表達(dá)，所述組合共表達(dá)是共表達(dá)tuaD和glmU，或共表達(dá)tuaD，gtaB，glmU，glmM和glmS。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種發(fā)酵生產(chǎn)肝素前體的方法，所述方法是將所述重組菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)24～60h。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖為碳源。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成為分：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，3.9g/L硫酸鉀，1.5g/L硫酸鎂，50mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.5-7.5。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成成為分：20g/L酵母粉，15g/L蔗糖，3.9g/L硫酸鉀，1.5g/L硫酸鎂，50mM磷酸鹽緩沖液，pH 6.5-7.5。

本發(fā)明還提供所述重組枯草芽孢桿菌在醫(yī)藥、保健品領(lǐng)域的應(yīng)用，所述應(yīng)用具體是制備含肝素的藥品、醫(yī)藥配制品。

有益效果：本發(fā)明通過(guò)在產(chǎn)肝素前體的枯草芽孢桿菌中進(jìn)行合成途徑優(yōu)化，即共表達(dá)UDP-GlcUA途徑和UDP-GlcNAc途徑中的關(guān)鍵酶基因，提高了肝素前體的產(chǎn)量，且重組質(zhì)粒pP43-DU-PBMS的轉(zhuǎn)入并沒(méi)有成為菌體生長(zhǎng)的負(fù)擔(dān)，菌體量反而比對(duì)照菌提高了17.3％，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。首先，本發(fā)明過(guò)程中使用的宿主為食品級(jí)，可滿足醫(yī)療衛(wèi)生和食品安全的要求，無(wú)內(nèi)毒素和病原感染的風(fēng)險(xiǎn)；其次，共表達(dá)tuaD，gtaB，glmU，glmM和glmS基因?qū)е聝汕绑w物供應(yīng)充足且比例平衡，并進(jìn)一步通過(guò)3L罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)，使肝素前體的積累達(dá)到最高，為7.25g/L，分子量為46.66kD。本研究為高產(chǎn)肝素前體提供了新策略，一方面可應(yīng)用于其它糖胺聚糖，另一方面為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)肝素前體奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為共表達(dá)途徑基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖；

圖2為PCR驗(yàn)證重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建，M為5000bp的Marker，1-4分別表示含有質(zhì)粒pP43-DBA，pP43-UMS，pP43-DU和pP43-DU-PBMS的重組菌；

圖3為共表達(dá)途徑基因后重組菌的肝素前體產(chǎn)量；

圖4為重組菌B.subtilis E168H/pP43-DU-PBMS與對(duì)照株B.subtilis E168H在搖瓶培養(yǎng)中的細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)量曲線；

圖5為重組菌B.subtilis E168H/pP43-DU-PBMS在3L罐中的補(bǔ)料分批培養(yǎng)。

具體實(shí)施方式

肝素前體發(fā)酵產(chǎn)物分子量檢測(cè)分析方法：采用高效體積排阻色譜-多角度激光散射進(jìn)行分析，選擇示差折光檢測(cè)器RI，使用凝膠色譜柱Ultrahydrogel Linear進(jìn)行分析。流動(dòng)相選擇0.1M硝酸鈉進(jìn)行洗脫，流速為0.5mL/min，柱子溫度設(shè)定為50℃，進(jìn)樣量為20μL，每個(gè)樣品洗脫時(shí)間為20min，利用軟件計(jì)算平均分子質(zhì)量和多分散性系數(shù)。

實(shí)施例涉及的核苷酸序列信息：

(1)SEQ ID NO.1序列信息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的葡萄糖磷酸變位酶的基因pgcA編碼序列；

(2)SEQ ID NO.2序列信息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB編碼序列；

(3)SEQ ID NO.3序列信息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的UDP-葡萄糖脫氫酶基因tuaD編碼序列；

(4)SEQ ID NO.4序列信息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的酰胺轉(zhuǎn)移酶的基因glmS編碼序列；

(5)SEQ ID NO.5序列信息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的氨基葡糖磷酸變位酶的基因glmM的編碼序列；

(6)SEQ ID NO.6序列信息為枯草芽孢桿菌來(lái)源的UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU的編碼序列；

實(shí)施例1共表達(dá)途徑基因的重組枯草芽孢桿菌的構(gòu)建

首先制備B.subtilis E168H感受態(tài)細(xì)胞，所需試劑為無(wú)機(jī)鹽母液(g/L)：K₂HPO₄140，KH₂PO₄ 60，(NH₄)₂SO₄ 20，(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)10，MgSO4·7H₂O 2；GMI溶液(每100mL)：無(wú)機(jī)鹽母液9.6mL，20％葡萄糖2.5mL，5％水解酪蛋白0.4mL，10％酵母汁1mL；GMII溶液(每100mL)：無(wú)機(jī)鹽母液9.7mL，20％葡萄糖2.5mL，5％水解酪蛋白0.08mL，10％酵母汁0.04mL，1M MgCl₂0.25mL，1M CaCl₂0.05mL。將B.subtilis E168H單菌落接種于5mL GMI溶液，30℃、125rpm培養(yǎng)16h，取2mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到18mL GMI溶液，37℃、200rpm培養(yǎng)3.5h，再取10mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到90mL GMII溶液，37℃、200rpm培養(yǎng)90min，在4℃、5000g離心10min收集菌體，僅保留10mL液體重懸菌體，以500μL為單位分裝。

以pP43NMK為表達(dá)載體，共表達(dá)肝素前體合成途徑基因的4個(gè)重組型質(zhì)粒pP43-DBA，pP43-UMS，pP43-DU和pP43-DU-PBMS(圖1)為先前構(gòu)建(公開(kāi)于Production of specific-molecular-weight hyaluronan by metabolically engineered Bacillus subtilis 168，Metabolic Engineering，2016，Jinpeng)，通過(guò)化轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)化入B.subtilis E168H感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布于含50μg/mL卡那霉素的篩選平板，挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證。轉(zhuǎn)化pP43-DBA，pP43-UMS，pP43-DU和pP43-DU-PBMS質(zhì)粒的重組菌分別用引物gtaB-F/pgcA-R，glmM-F/glmS-R，tuaD-F/glmU-R和glmU-F/gtaB-R驗(yàn)證，結(jié)果如圖2所示，并命名重組菌為B.subtilis E168H/pP43-DBA，B.subtilis E168H/pP43-UMS，B.subtilis E168H/pP43-DU，B.subtilis E168H/pP43-DU-PBMS。

引物序列信息：5’-3’方向

gtaB-F：ATGAAAAAAGTACGTAAAGCCATAA

pgcA-R：TTATTTTGCTGTTGACTCAACAA

glmM-F：ATGGGCAAGTATTTTGGAACAGACG

glmS-R：TTACTCCACAGTAACACTCTTCGCA

tuaD-F：GTGAAAAAAATAGCTGTCATTGGAAC

glmU-R：TTATTTTTTATGAATATTTTTCACATAATC

glmU-F：ATGGATAAGCGGTTTGCAGTTG

gtaB-R：TTAGATTTCTTCTTTGTTTAGTAAAC

實(shí)施例2重組枯草芽孢桿菌的搖瓶發(fā)酵

分別挑取上述構(gòu)建的4株重組枯草芽孢桿菌及對(duì)照菌B.subtilis E168H單菌落，接種于種子培養(yǎng)基，置于200rpm 37℃過(guò)夜培養(yǎng)16h。按體積比為10％的接種量轉(zhuǎn)接于25mL發(fā)酵培養(yǎng)基中(250mL搖瓶)，發(fā)酵培養(yǎng)基為：20g/L酵母粉，50g/L蔗糖，硫酸鉀3.9g/L，硫酸鎂1.5g/L，50mM磷酸鹽緩沖液，pH 7.0，其中重組菌培養(yǎng)液中需添加50μg/mL卡那霉素。置于200rpm 37℃培養(yǎng)54h，并于接種后第2h添加木糖母液使其終濃度為20g/L進(jìn)行誘導(dǎo)。

搖瓶培養(yǎng)中取樣的發(fā)酵液經(jīng)10000g離心5min后，向上清液中加入3倍體積的無(wú)水乙醇，混勻并于4℃放置1h，再次經(jīng)10000g離心5min，收集沉淀，加入蒸餾水重新溶解沉淀，該純化步驟重復(fù)三次。肝素前體的含量采用Bitter-Muir硫酸咔唑比色法測(cè)定，在比色管中加入1mL硼砂硫酸試劑和200μL經(jīng)一定倍數(shù)稀釋后的肝素前體樣品，混勻并在沸水中煮15min，冷卻至室溫，再加入50μL咔唑試劑，混勻并再在沸水中煮15min，冷卻后測(cè)定530nm處的吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)量。

根據(jù)附圖3中第48h肝素前體產(chǎn)量，較對(duì)照菌株B.subtilis E168H(1.71g/L)，含重組質(zhì)粒的4株重組菌在搖瓶上產(chǎn)量均有提高，其中B.subtilis E168H/pP43-DBA產(chǎn)量為2.37g/L，B.subtilis E168H/pP43-UMS產(chǎn)量為2.20g/L，B.subtilis E168H/pP43-DU產(chǎn)量為2.52g/L，E168H/pP43-DU-PBMS產(chǎn)量最高，為2.89g/L，提高幅度最大，為69.01％。說(shuō)明兩前體物UDP-GlcUA和UDP-GlcNAc的比例平衡對(duì)加快肝素前體的聚合速度非常有利。并且，如圖4所示，重組菌B.subtilis E168H/pP43-DU-PBMS在第12-24h進(jìn)入菌體生長(zhǎng)穩(wěn)定期，OD₆₀₀最高為22.4，而對(duì)照菌OD₆₀₀最高為19.1，提高17.3％。與對(duì)照株相比，重組質(zhì)粒pP43-DU-PBMS的轉(zhuǎn)入并沒(méi)有成為菌體生長(zhǎng)的負(fù)擔(dān)，菌體量反而稍有提高，另外，根據(jù)MALLS-SEC結(jié)果(表1)，上述4株重組菌所產(chǎn)肝素前體的M_w分別為53.65kDa，73.83kDa，58.79kDa和75.90kDa，較對(duì)照菌(39.72kDa)也均增大。同時(shí)，產(chǎn)物的多分散性系數(shù)I_p在1.09-1.42之間，尤其是當(dāng)前體物平衡時(shí)，產(chǎn)物分子量分布范圍更集中，說(shuō)明可通過(guò)途徑優(yōu)化實(shí)現(xiàn)更統(tǒng)一分子量的肝素前體的生產(chǎn)。

表1搖瓶中重組菌與對(duì)照菌在第48h時(shí)所產(chǎn)肝素前體的分子量比較

^a數(shù)量平均分子量(M_n)；^b質(zhì)量平均分子量(M_w)；^c聚合度(I_p＝M_w/M_n).

實(shí)施例3重組枯草芽孢桿菌B.subtilis E168H/pP43-DU-PBMS的3L罐補(bǔ)料分批培養(yǎng)

將重組菌單菌落接種至150mL種子培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)16h，將種子培養(yǎng)液按體積比為10％的接種量轉(zhuǎn)接至含1.35L發(fā)酵培養(yǎng)基的3L發(fā)酵罐中，并添加50μg/mL卡那霉素。在接種后第2h添加木糖溶液使終濃度為20g/L進(jìn)行誘導(dǎo)。使用5M NaOH溶液控制pH為7.0，溫度為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速在接種后8h內(nèi)為600r/min，8h后為800r/min，通氣量為2.0vvm。補(bǔ)料料液為800g/L的蔗糖母液，當(dāng)發(fā)酵液中蔗糖濃度低于5g/L時(shí)開(kāi)始補(bǔ)料，維持殘?zhí)菨舛仍?-5g/L。在8-12h期間流加速度分別為7.5、7.5、15、10g/L/h，此后保持5g/L/h的流速至發(fā)酵結(jié)束。同時(shí)采用HPSEC-MALLS測(cè)定發(fā)酵終點(diǎn)肝素前體的質(zhì)量平均分子量(M_w)，數(shù)量平均分子量(M_n)和分散系數(shù)I_p。

如圖5所示，可以看出大量的肝素前體的積累主要集中于菌體生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，即細(xì)胞生長(zhǎng)與產(chǎn)物生成非偶聯(lián)。在發(fā)酵64h時(shí)，肝素前體的產(chǎn)量達(dá)到最高，為7.25g/L，是搖瓶水平的2.51倍，此后產(chǎn)量保持穩(wěn)定。產(chǎn)物的M_w為46.66kDa，較搖瓶培養(yǎng)時(shí)降低，可能因?yàn)閿嚢铇獧C(jī)械剪切力的作用使糖鏈切斷，但I(xiàn)_p值1.28卻顯示3L罐發(fā)酵仍較好地保持了相對(duì)集中的分子量分布。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大學(xué)

<120> 一種高產(chǎn)肝素前體的重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgacttgga gaaagagcta tgaacgctgg aaacagacag aacatttaga tctggaatta 60

aaagagcgcc ttattgaatt agagggagat gaacaggccc ttgaggactg tttctataaa 120

gaccttgaat tcggtaccgg cggaatgcgc ggggaaatcg gcgccgggac aaatcggatg 180

aatatttaca ctgtgcgcaa agcatcggcc gggtttgcgg catacatctc gaagcaaggt 240

gaggaagcga aaaaacgggg cgttgtcatt gcttatgatt cccgccataa gtctccggag 300

ttcgcgatgg aagcggcaaa aacacttgcg acacaaggca tccaaacata cgtgtttgat 360

gagcttcgcc cgacgccaga gctgtcattc gctgttagac agctgaacgc ttatggtgga 420

attgtggtaa cggcaagcca taacccgcct gaatataacg gctacaaagt atacggggat 480

gatggcggcc agctgcctcc aaaggaagcg gacatcgtca ttgagcaggt aaacgcgatt 540

gaaaatgagc tgacgatcac agtggacgaa gaaaataagt taaaagaaaa aggcttaatc 600

aaaatcatcg gtgaagatat tgataaagtt tatacagaaa aactgacgtc catttctgta 660

catcctgaat tatcggaaga agtagatgta aaggttgttt tcacaccgct gcatggaact 720

gcaaataaac cggtcagacg cggtcttgaa gcactcggct acaaaaatgt aacggttgtc 780

aaagaacagg aactgccgga ttcaaacttc tccactgtta catcgccgaa cccggaagag 840

catgcggcat tcgaatatgc cattaagctt ggggaggagc agaatgcaga tattctcatc 900

gcgacagatc ctgatgctga ccgcctcggc atcgcggtga aaaacgatca aggcaaatat 960

acagtgctga caggaaacca aaccggagcg ttgctgcttc attacctgct ttctgaaaag 1020

aaaaaacaag gcatcctgcc tgataacggt gttgttctca aaacgatcgt cacaagcgaa 1080

atcggccgtg ctgtagcttc ttcattcggc cttgatacga ttgatacgct gacaggcttt 1140

aagtttatcg gtgaaaagat taaggaatac gaagcatcag gccagtatac cttccaattc 1200

ggttatgaag agagctacgg ttatttaatc ggggattttg cccgcgataa ggacgccatt 1260

caggctgcgc ttttggcagt tgaagtttgc gcgttctata aaaaacaggg aatgtcattg 1320

tatgaggcgc tcatcaatct ctttaacgaa tatggttttt atcgtgaagg gctgaaatcc 1380

ctgacgctga aaggcaaaca aggagcagag caaattgaag cgattcttgc ttccttcaga 1440

caaaatccgc cgcagaaaat ggcgggcaaa caggttgtca cagcagaaga ttacgctgta 1500

agcaaacgga cgcttctgac tgaaagcaaa gaagaagcca tcgacttgcc aaaatcaaat 1560

gtattgaaat acttcctgga agacgggtct tggttctgtc tccgtccttc tggaactgag 1620

ccgaaggtta aattttattt cgccgtaaaa gggtcatctt tggaagacag tgaaaagcga 1680

cttgccgtcc tttctgaaga tgtaatgaag acggtggatg aaattgttga gtcaacagca 1740

aaataa 1746

<210> 2

<211> 879

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaaaaaag tacgtaaagc cataattcca gcagcaggct taggaacacg ttttcttccg 60

gctacgaaag caatgccgaa agaaatgctt cctatcgttg ataaacctac cattcaatac 120

ataattgaag aagctgttga agccggtatt gaagatatta ttatcgtaac aggaaaaagc 180

aagcgtgcga ttgaggatca ttttgattac tctcctgagc ttgaaagaaa cctagaagaa 240

aaaggaaaaa ctgagctgct tgaaaaagtg aaaaaggctt ctaacctggc tgacattcac 300

tatatccgcc aaaaagaacc taaaggtctc ggacatgctg tctggtgcgc acgcaacttt 360

atcggcgatg agccgtttgc ggtactgctt ggtgacgata ttgttcaggc tgaaactcca 420

gggttgcgcc aattaatgga tgaatatgaa aaaacacttt cttctattat cggtgttcag 480

caggtgcccg aagaagaaac acaccgctac ggcattattg acccgctgac aagtgaaggc 540

cgccgttatc aggtgaaaaa cttcgttgaa aaaccgccta aaggcacagc accttctaat 600

cttgccatct taggccgtta cgtattcacg cctgagatct tcatgtattt agaagagcag 660

caggttggcg ccggcggaga aattcagctc acagacgcca ttcaaaagct gaatgaaatt 720

caaagagtgt ttgcttacga ttttgaaggc aagcgttatg atgttggtga aaagctcggc 780

tttatcacaa caactcttga atttgcgatg caggataaag agcttcgcga tcagctcgtt 840

ccatttatgg aaggtttact aaacaaagaa gaaatctaa 879

<210> 3

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgaaaaaaa tagctgtcat tggaacaggt tatgtaggac tcgtatcagg cacttgcttt 60

gcggagatcg gcaataaagt tgtttgctgt gatatcgatg aatcaaaaat cagaagcctg 120

aaaaatgggg taatcccaat ctatgaacca gggcttgcag acttagttga aaaaaatgtg 180

ctggatcagc gcctgacctt tacgaacgat atcccgtctg ccattcgggc ctcagatatt 240

atttatattg cagtcggaac gcctatgtcc aaaacaggtg aagctgattt aacgtacgtc 300

aaagcggcgg cgaaaacaat cggtgagcat cttaacggct acaaagtgat cgtaaataaa 360

agcacagtcc cggttggaac agggaaactg gtgcaatcta tcgttcaaaa agcctcaaag 420

gggagatact catttgatgt tgtatctaac cctgaattcc ttcgggaagg gtcagcgatt 480

catgacacga tgaatatgga gcgtgccgtg attggttcaa caagtcataa agccgctgcc 540

atcattgagg aacttcatca gccattccat gctcctgtca ttaaaacaaa cctagaaagt 600

gcagaaatga ttaaatacgc cgcgaatgca tttctggcga caaagatttc ctttatcaac 660

gatatcgcaa acatttgtga gcgagtcggc gcagacgttt caaaagttgc tgatggtgtt 720

ggtcttgaca gccgtatcgg cagaaagttc cttaaagctg gtattggatt cggcggttca 780

tgttttccaa aggatacaac cgcgctgctt caaatcgcaa aatcggcagg ctatccattc 840

aagctcatcg aagctgtcat tgaaacgaac gaaaagcagc gtgttcatat tgtagataaa 900

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aaaccgaata cgaacgatgt gagatccgct ccagcgcttg atattatccc aatgctgcag 1020

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