專利名稱：一種抗真菌蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)，特別是涉及一種新的來(lái)源于有毒植物豆薯種籽的抗真菌蛋白及其制備和應(yīng)用。
本發(fā)明所述的蛋白可被定義為具有抗真菌的活性—抗木霉菌、黃霉菌、稻瘟菌等活性。
所有高等植物都受到多種真菌的侵害。真菌病害是造成農(nóng)作物減產(chǎn)的最嚴(yán)重的一類病害，全世界已發(fā)現(xiàn)的240種水稻病中，真菌性病害占90％(《水稻生態(tài)學(xué)》，梁光商主編，農(nóng)業(yè)出版社，北京1983，322)，它每年給世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成數(shù)十億美元的損失。傳統(tǒng)的育種方法雖可得到抗病品種，但耗資大、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，用化學(xué)殺菌劑會(huì)引起抗藥性。因此，用生物工程技術(shù)得到抗病新品種是人類一直在努力進(jìn)行的課題，而尋找新的抗真菌蛋白將為抗真菌轉(zhuǎn)基因工程提供重要的基礎(chǔ)和信息，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)開辟植物育種的新途徑。
除了幾丁質(zhì)和β-1，3葡聚糖等具有抗真菌能力的物質(zhì)被發(fā)現(xiàn)外，Logcmann(Logemann，J.et al.，Biotechnology 1992，10305-308)，Woloshnk(Woloshuk C.P.et al.，Plant Cell，1991，3619-628)，Vigers(Vigers，A.J.et al.，Mol.Plant-Microbe Inter.1991，4315-323)等人在大麥、煙草、玉米等新種籽中發(fā)現(xiàn)了抗真菌蛋白。在蘿卜、千穗谷、紫茉莉等的種籽中也發(fā)現(xiàn)了一類堿性小分子量蛋白也具有抗真菌活性。根據(jù)孫勇如的總結(jié)論文(《植物學(xué)報(bào)》，1997，39(1)91-96)，我國(guó)至目前只在天麻(胡忠等，《云南植物研究》1980，10373-380)和萌芽水稻種籽(陳章良等，《高技術(shù)通訊》1994，222-26)中發(fā)現(xiàn)抗真菌蛋白。前者可抑制小麥赤霉菌和木霉菌(抑菌量為50μg)，后者具有抗木霉菌活性的同時(shí)，也具有以抑制胰蛋白酶為主的活性(陳章良等，《植物學(xué)報(bào)》1997，39(6)561-569)，其抑制木霉菌最低量為20μg。我們從有毒植物豆薯種籽中分離出三個(gè)組分，液相色譜證明其為蛋白(吳紅京等，《色譜》1997，15(2)153-155)。
本發(fā)明的目的在于從有毒植物豆薯種籽中分離純化含有較強(qiáng)的抑制木霉菌、黃霉菌、稻瘟菌等活性的抗真菌蛋白。
本發(fā)明采用簡(jiǎn)化、溫和的分離純化方法，包括鹽溶液粗提、S-SFF強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析、DEAE-纖維素陰離子交換過(guò)濾、CM-纖維素陽(yáng)離子交換梯度洗脫和G-75凝膠過(guò)濾(或Sephacryl S200)，由此得到高純度、高活性的豆薯種籽的抗真菌蛋白，暫命名為PE3。
豆薯蛋白PE3的分離純化流程見附圖3，具體操作如下[1]粗提將豆薯種籽100克粉碎，勻漿，用含0.6～0.9％NaCl的pH6.8～7.2 5mM磷酸鹽緩沖液浸泡，4℃過(guò)夜。預(yù)處理粗提液用雙層濾布去掉粗渣，用40～50％HAc調(diào)pH至3.5～4.0，在4℃下靜置2小時(shí)，高速離心得上清液。上S-SFF柱洗脫粗提液的上清液上S-SFF陽(yáng)離子交換柱(預(yù)先用pH4.0～4.5，0.01M NaAc緩沖液平衡)，用同樣緩沖液洗雜蛋白后，用含約1N NaCl的平衡液洗脫，收集洗脫峰。上DE-52柱由[3]所得洗脫峰溶液，經(jīng)蒸餾水透析48h后，上預(yù)先用平衡液平衡過(guò)的DE-52陰離子交換柱，收集穿過(guò)峰。上CM-52柱由[4]所得穿過(guò)峰溶液上CM-52陽(yáng)離子交換柱(先用5mM～10mM PB液，pH6.0～6.5平衡)。用平衡液洗去雜蛋白，再用含0～0.2MNaCl的同樣PB液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰C1(見附

圖1)。上G-75柱將[5]所得C1峰溶液，經(jīng)濃縮、透析后，上預(yù)先用平衡液平衡過(guò)的G-75柱，用平衡緩沖液洗脫，收集洗脫峰C1G(見附圖2)。凍干由[6]所得C1G峰溶液，經(jīng)充分透析后，冷凍干燥得凍干粉即為豆薯蛋白PE3。
本發(fā)明從有毒植物種籽—豆薯種籽—中分離純化出一種抗真菌蛋白PE3，其分子量為14KD(SDS-PAGE檢測(cè))，等電點(diǎn)PI≈7.5。抑菌實(shí)驗(yàn)表明它具有抗木霉菌、抗黃霉菌活性，其抑菌圈分別為1.2cm和1.0cm，抑菌最低量分別為6.25μg和12.5μg。其對(duì)稻瘟菌也有一定的抑制作用。后來(lái)在其CM-52柱洗脫組份中又發(fā)現(xiàn)兩個(gè)組分PA2，PA3具有抗木霉菌活性，其分子量范圍在20～50KD之間，此兩組分抑菌圈分別為3.5cm和3.0cm，抑菌量估算為8.89μg和9.24μg。
本發(fā)明的抗真菌蛋白可作為基礎(chǔ)蛋白，將通過(guò)植物轉(zhuǎn)基因工程，獲得具有抗真菌能力的新的植株，在防治農(nóng)作物真菌侵害方面有實(shí)用價(jià)值。本發(fā)明的抗真菌蛋白，將可在防治食用菌(香菇、草菇、磨菇等)受黃霉菌的侵害，在消除爛菇、死菇的發(fā)生方面有實(shí)用價(jià)值。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有以下積極效果1.本發(fā)明從有毒植物種籽—豆薯種籽—提取抗真菌蛋白，是新發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)導(dǎo)。
2.本發(fā)明的有毒植物品種—豆薯—含有兩種以上的不同分子量的抗真菌蛋白，其抑制木霉菌所需量比天麻和水稻萌芽種籽中的抗真菌用量要低，抑菌效果好。
3.本發(fā)明的有毒植物豆薯種籽尚可綜合利用。其粗提液經(jīng)硫酸銨沉淀后，沉淀用于提取抗真菌蛋白，而其濾液含有魚藤酮等生物堿可用1∶50對(duì)水稀釋，用于殺滅蔬菜上蟲害。
4.豆薯種籽來(lái)源豐富、價(jià)格便宜。
現(xiàn)對(duì)附圖作簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1.豆薯種籽蛋白PE3的CM-52洗脫圖(取C1峰)；圖2.PE3的G-75洗脫圖(取C1G峰)；圖3.豆薯種籽中蛋白PE3的分離純化流程圖；圖4.PE3的SDS-PAGE凝膠電泳圖(Lane5PE3)；圖5.PE3的等電聚焦電泳圖(Lane3PE3)；圖6.PE3的等電點(diǎn)測(cè)定(CPE3)；圖7.PE3的紫外280nm色譜圖(CPE3)；圖8.PE3的HPLC色譜圖(CPE3)；圖9.豆薯種籽蛋白的CM-52柱上二個(gè)組分PA2，PA3的洗脫圖；以下結(jié)合附圖通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明實(shí)施例1.從有毒植物豆薯種籽中分離純化抗真菌蛋白PE31.粗提液的制備稱取豆薯種籽100克，用粉碎機(jī)磨碎，加入一定量的含0.9％NaCl，pH7.2、5mM磷酸鹽緩沖液(PB)，用高速自控組織搗碎機(jī)(8,000轉(zhuǎn)/分鐘)，搗碎3分鐘×2次，再加入同樣的緩沖液至總體積為800ml，靜置24hr后，用雙重濾布過(guò)濾，濾液用50％HAc調(diào)酸至pH4.0，靜置2hr后，用濾紙過(guò)濾得到粗提上清液。以上操作均在4℃下進(jìn)行。
2.S-SFF強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱層析將粗提上清液上用pH4.5、0.01M NaAc緩沖液充分平衡的S-SFF柱(2.6×15cm)。上樣后用pH7.0、5mM PB液充分洗去雜蛋白，再用含1M NaCl的相同PB階段洗脫，得一尖峰，收集SF峰。
3.DEAE Cellulose DE-52陰離子交換柱層析將2所得SF峰溶液，經(jīng)蒸餾水及pH7.4、10mM Tris-HCl緩沖液透析，離心，將上清液上預(yù)先用pH7.4、10mM Tris-HCl緩沖液平衡的DE-52柱(1.5×15cm)，收集穿過(guò)峰。
4.CM Cellulose CM-52陽(yáng)離子交換柱層析將所得穿過(guò)峰對(duì)二次蒸餾水透析48小時(shí)后，上用pH6.5、5mM PB緩沖液平衡的CM-52柱(1.5×25cm)。然后用同樣緩沖液洗去雜蛋白后，再用含0～0.2M NaCl的平衡緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰C1，即PE3蛋白(見附圖1)。
5.Sephadex G-75凝膠過(guò)濾將CM-52柱的洗脫峰經(jīng)過(guò)濃縮、透析、離心，使體積達(dá)到7～8ml后，上Sephadex G-75柱(2.6×20cm，預(yù)先用pH6.5、5mM PB緩沖液平衡)，用平衡緩沖液進(jìn)行洗脫，收集洗脫峰C1G，即PE3蛋白(見附圖2)。經(jīng)多次透析完全去鹽后，進(jìn)行冷凍，在FLEXI-DRY真空冷凍干燥儀(FTSSystems Inc.，USA)上得到凍干粉(PE3蛋白)。每100g種籽得1mg蛋白。
實(shí)施例2.抗真菌蛋白PE3的生物性能1.十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠濃度7％，交聯(lián)度(即甲叉雙丙烯酰胺含量與丙烯酰胺含量的百分比)為3.7％，SDS濃度0.1％，電極液為Tris-HAc緩沖液，pH7.4。電泳前，將含1％SDS的樣品溶液在100℃水溶液中加熱3min。電泳時(shí)，每管電流恒定8mA，用溴酚藍(lán)作指示劑，電流時(shí)間約1.5小時(shí)。電泳結(jié)束后，用含0.05％考馬斯蘭R250，25％異丙醇和10％醋酸的染色液染色6小時(shí)，再用10％異丙醇，10％醋酸以及7％醋酸分步脫色，結(jié)果與低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白帶進(jìn)行比較，計(jì)算未知蛋白的分子量。其中標(biāo)準(zhǔn)蛋白為磷酸化酶(Mw.94,000D)，牛血清白蛋白(67,000D)，肌動(dòng)蛋白(43,000D)，碳酸酐酶(30,000D)，煙草花葉病毒外殼蛋白(17,500D)，溶菌酶(14,400D)。電泳結(jié)果表明PE3為高純度蛋白(見附圖4)。由圖可見PE3的分子量為14KD。
2.等電聚焦(Isoelecteic Focusing，IEF)將蛋白質(zhì)樣品和5％載體兩性電解質(zhì)(pH3.5～10.0)與7.5％的凝膠混合，然后聚合于凝膠管(0.5×8cm)中，正極電泳液為5％磷酸，負(fù)極為5％乙醇胺，恒壓120V，聚焦時(shí)間約10小時(shí)。當(dāng)電流接近零并不再下降時(shí)結(jié)束。結(jié)束后，將不含蛋白樣品的標(biāo)準(zhǔn)管切成1cm長(zhǎng)的小段，浸泡在2ml的10mMKCl溶液(預(yù)先抽氣)中封口過(guò)夜。次日測(cè)定各段的pH值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其余各樣品管按照SDS-PAGE的方法進(jìn)行染色和脫色，然后根據(jù)蛋白帶的相對(duì)位置在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出其等電點(diǎn)(見附圖5和附圖6)，等電點(diǎn)為7.5。
3.分析性高效液相色譜層析(High Performance LiquidChromatography，HPLC)將分離所得的蛋白樣品用高效凝膠蛋白分離柱Protein-PAK 125(WatersCo.)，結(jié)合島津(Shimadzu)的SPD-MIA光電二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行了組份分析和純度分析，并給出了200～400nm范圍的紫外吸收光譜圖(見附圖7)。同時(shí)，根據(jù)未知蛋白與標(biāo)準(zhǔn)蛋白的滯留時(shí)間的比較，測(cè)定蛋白的分子量。HPLC層析的流動(dòng)相為pH6.5、0.2M PB，檢測(cè)波長(zhǎng)λ＝280nm，流速為1ml/min。標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清蛋白二聚體(Mw134,000D)，牛血清白蛋白(67,000D)，卵清蛋白(43,000D)，天花粉蛋白(27,000D)，溶菌酶(14,400D)。分析結(jié)果PE3的分子量為14KD(見附圖8)，與電泳結(jié)果一致。
4.氨基酸組成分析稱取1mg左右的樣品，用6M HCl在110℃水解24hr后，采用鄰苯二甲醛(OPA)柱后衍生熒光法，在日本島津LC-4A高效液相色譜儀的氨基酸分析系統(tǒng)上測(cè)定樣品的氨基酸組成。氨基酸的分離用ISC-0.7離子交換柱(4.6×150mm)，流動(dòng)相檸檬酸梯度緩沖液，檢測(cè)器為島津RF-530熒光檢測(cè)器。測(cè)定PE3氨基酸的組成見附表。
實(shí)施例3.抗真菌活性檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)在福建省農(nóng)科院完成。除所采用的蛋白干粉樣品外，本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中所使用的試劑、用具均經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌(15磅，30分鐘)，所有操作均在無(wú)菌室的超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。參照Roberts(Roberts，W.K.&Selitrennikoff，C.P.Biochim.Biophys.Acta 1986，880161-170)的菌絲生長(zhǎng)抑制法，在直徑9cm的培養(yǎng)皿中加入PDA培養(yǎng)基8ml，將每種經(jīng)過(guò)斜面活化培養(yǎng)的真菌菌絲塊接種于培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種同樣的四塊，置于24℃培養(yǎng)。待菌絲向外蔓延的圓面直徑約3cm時(shí)，取無(wú)菌濾紙圓片(直徑0.5cm)，平放在菌絲生長(zhǎng)前方約1cm處，每皿五個(gè)。待測(cè)試樣品用無(wú)菌雙蒸水配制成不同濃度，分別滴加在濾紙片上，每一張紙片滴加10μl，其中位于中心的濾紙片滴加等量無(wú)菌水作為對(duì)照，置于24℃，培養(yǎng)24hr。加有抗菌活性物質(zhì)的紙片周圍出現(xiàn)抑菌圈，以肉眼可以觀察到菌絲生長(zhǎng)被抑制的蛋白含量為抗菌指標(biāo)。結(jié)果顯示PE3蛋白對(duì)木霉菌、黃霉菌菌絲的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，抑菌圈分別達(dá)1.2cm和1.0cm，抑菌最低量分別為6.25μg和12.5μg；PE3對(duì)稻瘟菌也有抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種抗真菌蛋白，暫命名為PE3，該蛋白是從有毒的豆薯種籽中分離純化而得，其分子量為14KD，等電點(diǎn)為7.5，其特征在于它對(duì)木霉菌、黃霉菌有明顯的抑制作用，對(duì)稻瘟菌也有抑制作用。
2.如權(quán)利要求1所述的一種抗真菌蛋白，其特征在于它對(duì)木霉菌的抑菌圈為1.2cm，抑菌量為6.25μg。
3.如權(quán)利要求1所述的一種抗真菌蛋白，其特征在于它對(duì)黃霉菌的抑菌圈為1.0cm，抑菌量為12.5μg。
4.一種權(quán)利要求1的抗真菌蛋白的分離純化方法，包括鹽溶液粗提、S-SFF強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析、DEAE-纖維素陰離子交換過(guò)濾、CM-纖維素陽(yáng)離子交換梯度洗脫和G-75凝膠過(guò)濾，其特征在于采用了DEAE-纖維素陰離子交換過(guò)濾和G-75凝膠過(guò)濾。
5.一種抗真菌蛋白，暫命名為PA2，該蛋白來(lái)源于有毒的豆薯種籽，其特征在于該蛋白通過(guò)鹽溶液粗提、硫酸銨沉淀、CM-纖維素陽(yáng)離子交換柱梯度洗脫分離純化而得，其分子量為20～50KD，對(duì)木霉菌有較強(qiáng)的抑制作用。
6.如權(quán)利要求5所述的一種抗真菌蛋白，其特征在于它對(duì)木霉菌的抑菌圈為3.5cm，抑菌量為8.89μg。
7.一種抗真菌蛋白，暫命名為PA3，該蛋白來(lái)源于有毒的豆薯種籽，其特征在于該蛋白通過(guò)鹽溶液粗提、硫酸銨沉淀、CM-纖維素陽(yáng)離子交換柱梯度洗脫分離純化而得，其分子量為20～50KD，對(duì)木霉菌有較強(qiáng)的抑制作用。
8.如權(quán)力要求7所述的一種抗真菌蛋白，其特征在于它對(duì)木霉菌的抑菌圈為3.0cm，抑菌量為9.24μg。
9.一種權(quán)利要求1或5或7的抗真菌蛋白的應(yīng)用，其特征在于這些抗真菌蛋白可給抗真菌植物轉(zhuǎn)基因工程提供主要信息，將可通過(guò)轉(zhuǎn)基因得到具有抗真菌能力的轉(zhuǎn)基因植株，開辟新的植物育種新途徑，在為防治真菌對(duì)農(nóng)作物的侵染方面有實(shí)用的價(jià)值。
全文摘要
一種抗真菌蛋白,暫命名為PE3,其分子量約為14KD,等電點(diǎn)為7.5,對(duì)木霉菌、黃霉菌絲的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用,其抑菌圈分別達(dá)到1.2cm和1.0cm,抑菌最低量分別為6.25μg和12.5μg;對(duì)稻瘟菌也有一定的抑制作用。后來(lái)又發(fā)現(xiàn)其CM－52柱分離的另外二種組分PA2和PA3對(duì)木霉菌也有較強(qiáng)的抑制作用,其抑菌圈分別達(dá)到3.5cm和3.0cm,其抑菌量約為8.89μg和9.24μg,分子量約在20～50KD。抗真菌蛋白作為一種基礎(chǔ)蛋白將可通過(guò)轉(zhuǎn)基因工程得到具有抗真菌病害能力的新植株,開辟了植物育種新途徑。
文檔編號(hào)C07K2/00GK1247871SQ98119100
公開日2000年3月22日 申請(qǐng)日期1998年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月14日
發(fā)明者郝冰, 葉曉明, 林玉娟, 陳明晃, 宋立軍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所