一種多基因轉(zhuǎn)染嗜熱四膜蟲細(xì)胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種多基因轉(zhuǎn)染嗜熱四膜蟲細(xì)胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。將靶基因A的同源序列克隆到打靶載體pNeo4中，經(jīng)基因槍法轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)期四膜蟲，巴龍霉素抗性篩選獲得大核基因遺傳轉(zhuǎn)化的陽性細(xì)胞株a；將靶基因B的同源序列克隆到打靶載體pBsr中，經(jīng)基因槍法轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)期四膜蟲細(xì)胞株a，巴龍霉素配合殺稻瘟菌素抗性篩選，獲得大核基因遺傳轉(zhuǎn)化的陽性細(xì)胞株a/b。該方法解決了現(xiàn)有多基因轉(zhuǎn)染技術(shù)效率低、篩選過程復(fù)雜及耗時(shí)長(zhǎng)等問題；并克服了現(xiàn)有技術(shù)無法獲得必需基因缺失或突變細(xì)胞株的局限，可研究必需基因缺失或突變對(duì)相關(guān)基因表達(dá)及功能的影響。本發(fā)明可用于對(duì)兩個(gè)不同目的基因進(jìn)行敲除、突變或表位標(biāo)注等定向修飾，從而實(shí)現(xiàn)四膜蟲多基因聯(lián)合應(yīng)用研究。
【專利說明】一種多基因轉(zhuǎn)染嗜熱四膜蟲細(xì)胞株的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種多基因轉(zhuǎn)染嗜熱四膜蟲細(xì)胞株的構(gòu)建方法，以及該方法在四膜蟲多基因聯(lián)合研究中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]嗜熱四膜蟲(Tetrahymena thermophila)是一種單細(xì)胞真核生物,屬于纖毛類原生動(dòng)物，在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)集中了維持生命和延續(xù)后代所必需的一切功能，是研究蛋白功能理想的模式體系。作為研究某些人類疾病相關(guān)基因結(jié)構(gòu)和功能的生物模型，四膜蟲內(nèi)已建立了一系列成熟的基因重組和轉(zhuǎn)化技術(shù)，這些技術(shù)已經(jīng)成功地通過基因敲除、過表達(dá)和突變等實(shí)現(xiàn)基因功能研究。近年來隨著對(duì)遺傳學(xué)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)生物性狀往往不是由單一基因控制，而是多個(gè)基因相互作用的結(jié)果，單基因遺傳研究已無法滿足四膜蟲蛋白組學(xué)發(fā)展的需要。因此有必要建立簡(jiǎn)便、有效的多基因共轉(zhuǎn)染及共表達(dá)方法，同時(shí)對(duì)兩個(gè)不同目的基因進(jìn)行敲除、突變或表位標(biāo)注等改造，從而通過分析被定向改造的遺傳性狀，進(jìn)一步探討四膜蟲中兩目的基因間的相互作用及功能關(guān)系。
[0003]目前，四膜蟲中常用的多基因聯(lián)合研究方法是通過小核轉(zhuǎn)染及巴龍霉素或殺稻瘟菌素抗性篩選，分別獲得小核A、B基因改造純合細(xì)胞株，再將該兩純合株接合配對(duì)，獲得具有雙抗性的、純合的大核及小核A、B基因改造細(xì)胞株(Bowen Cui，Yifan Liu, andMartin A.Gorovsky.Deposit1n and Funct1n of Histone H3 Variants in Tetrahymenathermophila.Molecular and Cellular B1logy.2006，26 (20):7719-7730.) ?盡管該方法可以獲得遺傳穩(wěn)定的細(xì)胞株，即小核(生殖核，傳遞遺傳信息)和大核(體核，執(zhí)行轉(zhuǎn)錄功能)中的內(nèi)源基因均被改造，但該方法的轉(zhuǎn)染技術(shù)復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)且成功率低，具體應(yīng)用到四膜蟲的多基因定向修飾方面難度較大。首先，轉(zhuǎn)染效率低。小核基因改造純合細(xì)胞株是通過基因槍法轉(zhuǎn)染接合生殖過程減數(shù)分裂crescent期小核來完成的，該方法需要精確配比不同交配型的四膜蟲細(xì)胞，并提供穩(wěn)定的環(huán)境條件，如溫度、濕度等，以確保幾乎完全同步的接合配對(duì)。并須嚴(yán)格把握轉(zhuǎn)染時(shí)機(jī)，即在90%以上配對(duì)細(xì)胞均進(jìn)入crescent期時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，盡管如此，也無法保證成功轉(zhuǎn)染。其次，篩選過程繁瑣。除須進(jìn)行巴龍霉素和殺稻瘟菌素抗性篩選外，還需經(jīng)過3輪與不同缺陷型細(xì)胞株的配對(duì)，并進(jìn)行6-甲基嘌呤和放線菌酮抗性篩選，才可獲得純合的小核基因改造細(xì)胞株。最后，無法獲得必需基因突變細(xì)胞株。接合生殖期小核轉(zhuǎn)染獲得的是純合的小核、大核基因改造細(xì)胞株，即小核與大核所有染色體上的等位基因均被完全替換或引入突變。因而對(duì)于接合期有性生殖細(xì)胞核分化和發(fā)育所必需的基因，核發(fā)育將終止，配對(duì)細(xì)胞則分開并降解；對(duì)于營(yíng)養(yǎng)生殖期細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的基因，配對(duì)細(xì)胞在核發(fā)育完成后形成的后代細(xì)胞，由于大核中必需基因缺失導(dǎo)致的致死性表型，將無法存活。
[0004]如何能進(jìn)一步提高四膜蟲多基因轉(zhuǎn)染成功率、簡(jiǎn)化操作步驟，并獲得必需基因突變細(xì)胞株是應(yīng)用多基因定向修飾實(shí)現(xiàn)四膜蟲基因聯(lián)合應(yīng)用研究所面臨的重大課題。大核分步轉(zhuǎn)染不同基因打靶載體獲得大核多基因改造細(xì)胞株被認(rèn)為是解決該問題的有效途徑之一。本發(fā)明通過大核分步轉(zhuǎn)染及巴龍霉素和殺稻瘟菌素分步配合篩選，先后獲得大核A基因改造細(xì)胞株及大核A、B基因改造細(xì)胞株。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比轉(zhuǎn)染效率高、操作簡(jiǎn)單，且可用于研究必需基因缺失或突變對(duì)相關(guān)基因表達(dá)及功能的影響，是四膜蟲基因聯(lián)合應(yīng)用研究的有效方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提高四膜蟲多基因轉(zhuǎn)染成功率、簡(jiǎn)化操作步驟，并獲得必需基因突變或缺失細(xì)胞株從而進(jìn)一步研究必需基因缺失或突變對(duì)相關(guān)基因表達(dá)及功能發(fā)揮的影響。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過pNeo4及pBsr分別介導(dǎo)的基因打靶，及兩種抗生素配合篩選，可快速、有效實(shí)現(xiàn)兩不同目的基因轉(zhuǎn)染四膜蟲細(xì)胞株的構(gòu)建，具體技術(shù)方案包括:
[0006]本發(fā)明中基因打靶載體pNeo4序列包含載體骨架、可插入靶基因同源序列的多克隆位點(diǎn)及含巴龍霉素(Paromomycin)抗性基因的Neo4基因盒，通過同源重組使得抗性基因序列Neo4基因盒替代靶基因。本發(fā)明中基因打靶載體pBsr源自載體pNeo4，將原有載體中含巴龍霉素抗性標(biāo)記的Neo4基因盒替換為Bsr基因盒。Bsr基因盒源自載體pMNBL，是由四膜蟲組蛋白H4基因啟動(dòng)子序列、殺稻痕菌素抗性基因(blasticidin S resistance gene,bsr)及BTU2基因終止子序列構(gòu)成的融合序列(結(jié)構(gòu)示意圖見附圖1A)。所述基因打靶載體pBsr的構(gòu)建包括如下步驟:
[0007](I)以四膜蟲載體pMNBL為模板，上、下游引物為:5 ' GCGGCCGCGCATCTGGTGAGATATCTTCAAAGT-3 '(下劃線部分為Not I限制性酶切位點(diǎn))、5' -CTCGAGATCATGATGGAAAATAAAACCA TGCA-3'(下劃線部分為 XholI 限制性酶切位點(diǎn))，PCR擴(kuò)增獲得包含殺稻瘟菌素抗性基因的Bsr基因盒序列；
[0008](2)對(duì)Bsr基因盒序列及pNeo4進(jìn)行Not I和XholI雙酶切，并回收酶切產(chǎn)物:1.1kb Bsr基因盒及3.5 kb pNeo4大片段；
[0009](3)使用T4連接酶連接以上酶切片段，得到載體pBsr。
[0010]一種由pNeo4及pBsr介導(dǎo)的多基因轉(zhuǎn)染嗜熱四膜蟲細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0011](I)將靶基因A的5'和3'同源序列通過酶切、連接的方法，分別克隆到含巴龍霉素抗性標(biāo)記的打靶載體pNeo4中，經(jīng)基因槍法轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)期四膜蟲，通過巴龍霉素抗性篩選及PCR單克隆鑒定，獲得大核基因遺傳轉(zhuǎn)化的陽性細(xì)胞株a ；
[0012](2)將靶基因B的5'和3'同源序列通過酶切、連接的方法，分別克隆到含殺稻瘟菌素抗性標(biāo)記的打靶載體PBsr中，經(jīng)基因槍法轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)期四膜蟲細(xì)胞株a ;巴龍霉素配合殺稻瘟菌素抗性篩選:巴龍霉素與殺稻瘟菌素的初始濃度均為100μ g/mL，隨著殺稻瘟菌素濃度倍性增加，巴龍霉素濃度始終保持200 μ g/mL,直至殺稻瘟菌素達(dá)到終濃度800 μ g/mL。PCR單克隆鑒定獲得大核基因遺傳轉(zhuǎn)化的陽性細(xì)胞株a/b。
[0013]在殺稻瘟菌素篩選時(shí)，隨著濃度倍性增加(初始濃度為100 μ g/mL)，大核靶基因B逐漸被Bsr基因盒替換。在此過程中，為防止A基因回復(fù)突變，應(yīng)加入適當(dāng)濃度的巴龍霉素；而由于殺稻瘟菌素對(duì)四膜蟲細(xì)胞增殖有抑制作用，因此，有必要確定殺稻瘟菌素和巴龍霉素的最佳濃度配比，確保A基因不回復(fù)突變及B基因被Bsr基因盒替換。
[0014]本發(fā)明對(duì)巴龍霉素的最佳初始和終濃度進(jìn)行了摸索:當(dāng)不加入巴龍霉素時(shí)，隨著殺稻瘟菌素達(dá)到四膜蟲可耐受的最大濃度800 μ g/mL，A基因回復(fù)突變。當(dāng)巴龍霉素初始濃度為200 μ g/mL時(shí)，剛經(jīng)受基因槍轟擊的四膜蟲細(xì)胞無法存活。當(dāng)初始濃度為100μ g/mL時(shí)，若巴龍霉素與殺稻瘟菌素濃度同時(shí)雙倍增加，四膜蟲細(xì)胞可耐受的兩者最高濃度均為400 μ g/mL ;而若巴龍霉素濃度到200 μ g/mL即不再增加，殺稻瘟菌素可達(dá)到四膜蟲最大耐受濃度800 μ g/mL。
[0015]表1殺稻瘟菌素和巴龍霉素的濃度配比
[0016]

【權(quán)利要求】
1.一種多基因轉(zhuǎn)染嗜熱四膜蟲細(xì)胞株的構(gòu)建方法，其特征在于具體構(gòu)建步驟包括: (1)將靶基因A的5'和3'同源序列通過酶切、連接的方法，分別克隆到含巴龍霉素抗性標(biāo)記的打靶載體pNeo4中，經(jīng)基因槍法轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)期四膜蟲，通過巴龍霉素抗性篩選及PCR單克隆鑒定，獲得大核基因遺傳轉(zhuǎn)化的陽性細(xì)胞株a ; (2)將靶基因B的5'和3'同源序列通過酶切、連接的方法，分別克隆到含殺稻瘟菌素抗性標(biāo)記的打靶載體PBsr中，經(jīng)基因槍法轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)期四膜蟲細(xì)胞株a，巴龍霉素配合殺稻瘟菌素抗性篩選:巴龍霉素與殺稻瘟菌素的初始濃度均為100μ g/mL，隨著殺稻瘟菌素濃度倍性增加，巴龍霉素濃度始終保持200 μ g/mL,直至殺稻瘟菌素達(dá)到終濃度800 μ g/mL,PCR單克隆鑒定獲得大核基因遺傳轉(zhuǎn)化的陽性細(xì)胞株a/b。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述的打靶載體PBsr具體構(gòu)建步驟包括: (1)以四膜蟲載體PMNBL為模板，上、下游引物為:5'GCGGCCGCGCATCTGGTGAGATATCTTCAAAGT-3'、5' -CTCGAGATCATGATGGAAAATAAAACCATGCA-3'，PCR 擴(kuò)增獲得包含殺稻瘟菌素抗性基因的Bsr基因盒序列，且在其5'和3'末端分別引入限制性內(nèi)切酶Not I和XholI識(shí)別位點(diǎn)； (2)對(duì)Bsr基因盒序列及pNeo4進(jìn)行NotI和XholI雙酶切，并回收酶切產(chǎn)物:Bsr基因盒及pNeo4大片段； (3)使用T4連接酶連接以上酶切片段，得到載體pBsr。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于所述的基因槍轉(zhuǎn)化法為基因槍粒子轟擊營(yíng)養(yǎng)期四膜蟲大核。
4.權(quán)利要求1所述一種多基因轉(zhuǎn)染嗜熱四膜蟲細(xì)胞株的構(gòu)建方法在四膜蟲必需基因RANl敲減及AIF蛋白與HA標(biāo)簽蛋白融合表達(dá)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK104130944SQ201410342717
【公開日】2014年11月5日 申請(qǐng)日期:2014年7月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月12日
【發(fā)明者】梁海霞, 許靜, 王偉 申請(qǐng)人:太原理工大學(xué), 山西大學(xué)