本發(fā)明屬于植物病害生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株防治藍(lán)莓等果蔬采后病害的淺黃隱球酵母HMQAUSZ01的分離篩選、發(fā)酵以及生防效果測(cè)定，屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

我國(guó)是果蔬生產(chǎn)大國(guó)，果蔬往往因運(yùn)輸和貯藏過程的不當(dāng)而造成大量腐爛，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益降低、產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力下降和浪費(fèi)等現(xiàn)象，這也是全球關(guān)注的問題。發(fā)達(dá)國(guó)家很早就將采后保鮮加工放在農(nóng)業(yè)的首要位置，據(jù)報(bào)道，美國(guó)果蔬損失率為1.7%~5.0%，而我國(guó)則在25~30%，可見，我國(guó)果蔬采后的保鮮技術(shù)具有很大的經(jīng)濟(jì)潛力。

藍(lán)莓屬于杜鵑花科Ericaceae，越桔屬Vaccinium，是一種具有極高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新興世界性小漿果果樹（李亞東 2002），因其突出的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一（Kader & Rovel 1996）。目前，藍(lán)莓種植產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)果樹種植業(yè)最熱門的產(chǎn)業(yè)之一，藍(lán)莓市場(chǎng)潛力也逐漸被開發(fā)出來，至2015年底，全國(guó)藍(lán)莓種植面積由最初的24公頃發(fā)展到31210公頃, 產(chǎn)量由2002年的2噸發(fā)展到43244噸。

藍(lán)莓屬于漿果類果實(shí)，含水量很高，采后的藍(lán)莓果實(shí)極易衰老，發(fā)生失水、腐爛等現(xiàn)象，極不耐貯藏，如不及時(shí)處理將會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。這一特性極大地限制了其鮮果貨架期和商品價(jià)值。目前在青島地區(qū)引起藍(lán)莓貯藏期病害的病原有5種，其中灰葡萄孢和鏈格孢為主要病原菌（梁晨等 2010）。

隨著藍(lán)莓栽培面積的不斷擴(kuò)大和產(chǎn)量的迅速增加，生產(chǎn)上迫切需要適合于藍(lán)莓果實(shí)的采后貯藏保鮮配套技術(shù)，以緩解市場(chǎng)的供求矛盾和加工壓力，減少采后損失，延長(zhǎng)供應(yīng)期，從而提高藍(lán)莓果實(shí)的經(jīng)濟(jì)價(jià)值并促進(jìn)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的健康快速發(fā)展（姜愛麗 2011）。傳統(tǒng)的殺菌劑和保鮮方法不僅不能很好地解決腐爛變質(zhì)問題，而且?guī)碓S多安全隱患。考慮到藍(lán)莓的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及醫(yī)用價(jià)值，決定了藍(lán)莓病害的防治應(yīng)該盡量避免使用化學(xué)藥劑，采取有機(jī)栽培的方式，發(fā)展有機(jī)藍(lán)莓種植業(yè)必須堅(jiān)決杜絕化學(xué)藥劑的使用，因此對(duì)于藍(lán)莓采后病害的防治應(yīng)著眼于發(fā)展生物防治手段。

酵母菌作為果蔬生物防治拮抗菌的最大優(yōu)點(diǎn)是它能在較干燥的果蔬表面生存，能迅速利用營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行繁殖，且受殺蟲劑的影響?。╓isniewski and Wilosn, 1992）且酵母菌不產(chǎn)生抗菌素，可以避免病菌對(duì)抗菌素產(chǎn)生抗性而降低生物防治的抑病效果（WiIson and Winsiweksi, 1994），另一方面也可以避免某些抗生素對(duì)人體的不利影響。因此尋找新的酵母資源是研發(fā)藍(lán)莓等果蔬采后病害生防制劑的關(guān)鍵因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明第一個(gè)目的在于提供從山東省青島市城陽(yáng)區(qū)的柿樹果實(shí)表面分離得到一株對(duì)果蔬采后病害具有顯著防治作用的生防酵母-淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）菌株HMQAUSZ01，豐富藍(lán)莓等果蔬采后病害生防真菌菌種資源，為研究開發(fā)生防菌劑奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明第二個(gè)目的在于提供一種利用上述菌株HMQAUSZ01生產(chǎn)的微生物菌劑。

本發(fā)明第三個(gè)目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。

本發(fā)明第四個(gè)目的在于提供上述微生物菌劑對(duì)藍(lán)莓等果蔬采后病害的生測(cè)方法。

本發(fā)明第五個(gè)目的在于提供上述菌株HMQAUSZ01在藍(lán)莓等果蔬采后病害上的應(yīng)用。

本發(fā)明第六個(gè)目的在于提供上述菌株HMQAUSZ01的鑒定方法。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述。

淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）HMQAUSZ01菌株于2016年1月7日保藏于中國(guó)科學(xué)院微生物所內(nèi)中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)：CGMCC No. 11984。

利用上述淺黃隱球酵母HMQAUSZ01菌株生產(chǎn)的微生物菌劑，活性成分為菌體或發(fā)酵原液。

上述微生物菌劑的制備步驟如下：

（1）菌種活化：將低溫保藏的菌株HMQAUSZ01于10%的豆芽汁培養(yǎng)基平板上25℃培養(yǎng)48h，得到活化的菌種；（2）發(fā)酵培養(yǎng)：將活化的菌株HMQAUSZ01接入含有50mL NYDB培養(yǎng)液的150 mL三角瓶中，使發(fā)酵液中酵母的初濃度為2*10⁴cfu/mL，于140r/min，25℃搖培48h后的發(fā)酵液為菌劑A；將菌液A在3000rpm下離心10min，棄上清液，收集菌體，并用無菌水洗滌菌體兩次，并用其制成細(xì)胞懸浮液，得到菌劑B；用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌劑A和菌劑B中的酵母菌所需濃度，4℃保存待用。

上述微生物菌劑中的A和B活菌體數(shù)應(yīng)大于1x10⁹cfu/mL。

豆芽汁培養(yǎng)基：10%豆芽汁200mL，瓊脂20g，葡萄糖50g，水800mL，自然pH。

NYDB培養(yǎng)液：牛肉膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，水1000mL。

本發(fā)明的有益效果：

1. 本發(fā)明的淺黃隱球酵母HMQAUSZ01菌株對(duì)藍(lán)莓等果蔬采后病害有很好的防治效果，具有高效，抗菌譜廣的優(yōu)點(diǎn)；

2. 本發(fā)明所提供的淺黃隱球酵母HMQAUSZ01菌株防治效果穩(wěn)定，對(duì)環(huán)境友好，大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低廉。

根據(jù)本發(fā)明提供的淺黃隱球酵母HMQAUSZ01菌株和發(fā)酵原液菌劑可作為單劑或組合制劑利用或施用，這樣的制劑可包括農(nóng)業(yè)上合適的助劑、溶劑、載體、表面活性劑或填充劑。

具體實(shí)施方式：

下面實(shí)施例用于進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但是不以任何方式構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無特殊說明，一般為常規(guī)方法。

實(shí)施例1 HMQAUSZ01菌株的分離篩選

菌株HMQAU SZ01是從山東省青島市城陽(yáng)區(qū)的柿樹果實(shí)表面分離得到。2015年11月從山東省青島市城陽(yáng)區(qū)市場(chǎng)購(gòu)買無病蟲危害、無傷口的冬棗、葡萄、香蕉、梨、蘋果、桃和番茄、柿子若干。分別稱取10g果皮組織，加入到裝有90mL豆芽汁葡萄糖液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，同時(shí)加入3000單位的鏈霉素， 25℃下以120r/min振蕩培養(yǎng)48h；用移液槍吸取lmL菌液，用濃度梯度法稀釋成10^-1～10^-7的濃度，將10^-5、10^-6、10^-7濃度的菌液分別取0.lmL涂布于倒有豆芽汁葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基的平板上。每稀釋度重復(fù)3次, 置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，挑取培養(yǎng)特征相異的單菌落進(jìn)行平皿劃線純化。酵母分離試驗(yàn)獲得40株酵母菌，以藍(lán)莓采后病原菌鏈格孢為靶標(biāo)菌，通過離體果實(shí)篩選試驗(yàn)進(jìn)行拮抗菌株的篩選，最終獲得一株對(duì)果實(shí)采后病原真菌具有明顯防治效果的菌株HMQAU SZ01，防效為100%。

實(shí)施例2菌株 HMQAUSZ01細(xì)胞懸浮液對(duì)果蔬果實(shí)自然腐爛的生防效果

將菌株HMQAUSZ01的菌劑B用無菌水制備成以下濃度的處理液；（1）1×10⁶cfu/mL;（2）1×10⁷cfu/mL;（3）1×10⁸cfu/mL，將藍(lán)莓、葡萄、櫻桃、番茄的果實(shí)放入菌懸液中，浸泡3min后撈出，風(fēng)干；將果實(shí)放置于塑料盒中，外套塑料保鮮膜以保持濕度（95%左右）。處理果實(shí)貯于25℃，定期記錄果實(shí)的腐爛率。每處理10個(gè)果實(shí)，重復(fù)三次。試驗(yàn)結(jié)果表明三種濃度的HMQAUSZ01處理液對(duì)水果的自然腐爛均具有明顯的抑制效果，濃度越高，水果采后自然發(fā)病率越低。其中濃度為1×10⁸cfu/mL的處理液對(duì)四種果實(shí)自然腐爛率的各自防效均為最好，對(duì)番茄的生防效果為100%，其次對(duì)藍(lán)莓和葡萄的防效分別為86.96%和86.11%，櫻桃的生防效果最低，為61.54%。

實(shí)施例3 菌株 HMQAUSZ01細(xì)胞懸浮液對(duì)藍(lán)莓采后病原菌鏈格孢和灰葡萄孢的生防效果

將菌株HMQAUSZ01的菌劑B用無菌水制備成以下濃度的處理液：（1）1×10⁵cfu/mL；（2）1×10⁶cfu/mL；（3）1×10⁷cfu/mL；（4）1×10⁸cfu/mL；（5）1×10⁹cfu/mL；對(duì)照為無菌水。用無菌的牙簽在每個(gè)健康藍(lán)莓果實(shí)的果蒂部位制造傷口（3mm×3mm），在傷口處分別接種上述處理液15μL，3h晾干后，分別接種1×10⁵ cfu/mL病原菌孢子懸浮液，果實(shí)晾干后，將果實(shí)放置于塑料盒中，外套塑料保鮮膜以保持濕度。處理果實(shí)貯于25℃下, 定期記錄果實(shí)腐爛率。每處理10個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果表明隨著處理液濃度的增大，果實(shí)的發(fā)病率降低，其中1×10⁹cfu/mL和1×10⁸cfu/mL兩個(gè)濃度的處理液的發(fā)病率差異不顯著，因此在防治時(shí)可采用1×10⁸cfu/mL，這個(gè)處理濃度的對(duì)灰葡萄孢（Botrytis cinerea）和鏈格孢（Alternaria alternara）的防效分別為87.50%和84.62%。

實(shí)施例4菌株 HMQAUSZ01細(xì)胞懸浮液對(duì)蘋果采后病原菌擴(kuò)展青霉、灰葡萄孢及粉紅單端孢的生防效果

將菌株HMQAUSZ01的菌劑B用無菌水制備成以下濃度的處理液：（1）1×10⁵cfu/mL；（2）1×10⁶cfu/mL；（3）1×10⁷cfu/mL；（4）1×10⁸cfu/mL；（5）1×10⁹cfu/mL；對(duì)照為無菌水。用無菌的牙簽在每個(gè)健康蘋果果實(shí)的赤道部位制造傷口（3mm×3mm），在傷口處分別接種上述處理液15μL，3h晾干后，分別接種1×10⁵ cfu/mL病原菌孢子懸浮液，果實(shí)晾干后，將果實(shí)放置于塑料盒中，外套塑料保鮮膜以保持濕度。處理果實(shí)貯于25℃下, 定期測(cè)量病斑直徑。每處理3個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果表明隨著處理液濃度的增大，果實(shí)上病斑直徑減小。對(duì)于三種采后病原菌擴(kuò)展青霉、灰葡萄孢和粉紅單端孢的最適濃度分別為1×10⁸cfu/mL，1×10⁷cfu/mL以及1×10⁹cfu/mL，對(duì)應(yīng)的病斑直徑均為0，生防效果100%。

實(shí)施例5 菌株HMQAUSZ01發(fā)酵液的不同處理液對(duì)果實(shí)采后病害的生防效果

將活化的菌株HMQAUSZ01接入含有50mL NYDB培養(yǎng)液的150 mL三角瓶中，使發(fā)酵液中酵母的初濃度為2*10⁴cfu/mL，于140r/min，25℃搖培48h后，制備成以下處理液；（1）酵母發(fā)酵原液：用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，并用濾液調(diào)整至濃度為1×10⁸cfu/mL；（2）酵母菌懸液；發(fā)酵液在3000r/min下離心10min，棄上清液，用無菌水洗滌酵母菌體2次，并用其制成酵母菌懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用無菌水調(diào)整至濃度為1×10⁸cfu/mL；（3）酵母發(fā)酵濾液：培養(yǎng)液在3000r/min下離心10min 后，取上清液，用細(xì)菌過濾器（濾膜0.22μm）過濾即得；（4）酵母發(fā)酵熱殺死液：將酵母發(fā)酵原液在121℃下高壓滅菌20min。對(duì)照為無菌水。用無菌的牙簽在蘋果的赤道部位制造傷口（3mm×3mm），在傷口處分別接種菌株HMQAUSZ01上述四種處理液20μL，3h晾干后，分別接種病原菌（鏈格孢和灰葡萄孢）的孢子懸浮液，濃度為1×10⁵ cfu/mL，之后晾干，將果實(shí)放置于塑料盒中，外套塑料保鮮膜以保持濕度。處理果實(shí)貯于25℃下，7天后測(cè)量病斑直徑。每處理3個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果表明，酵母發(fā)酵濾液和酵母發(fā)酵熱殺死液與對(duì)照無差異，防效均為0，而酵母發(fā)酵原液和酵母菌懸液的防效為100%。

實(shí)施例6菌株 HMQAUSZ01細(xì)胞懸浮液對(duì)番茄采后病原菌鏈格孢和灰葡萄孢的抑制效果

將菌株HMQAUSZ01的菌劑B用無菌水制備成以下濃度的處理液：（1）1×10⁵cfu/mL；（2）1×10⁶cfu/mL；（3）1×10⁷cfu/mL；（4）1×10⁸cfu/mL；（5）1×10⁹cfu/mL；對(duì)照為無菌水。用無菌的牙簽在每個(gè)健康番茄果實(shí)的赤道部位制造傷口（3mm×3mm），在傷口處分別接種上述處理液15μL，3h晾干后，分別接種1×10⁵ cfu/mL病原菌孢子懸浮液，果實(shí)晾干后，將果實(shí)放置于塑料盒中，外套塑料保鮮膜以保持濕度。處理果實(shí)貯于25℃下, 定期測(cè)量病斑直徑。每處理3個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。試驗(yàn)結(jié)果表明隨著處理液濃度的增大，果實(shí)的病斑直徑減小，其中1×10⁹cfu/mL和1×10⁸cfu/mL兩個(gè)濃度處理液的發(fā)病率均為零，差異不顯著，因此在防治時(shí)可采用1×10⁸cfu/mL。

實(shí)施例7菌株HMQAUSSZ01的鑒定

（1）形態(tài)學(xué)特征：10%的豆芽汁平板上12h光暗交替條件下，25度培養(yǎng)48h,菌落呈圓形，邊緣整齊，淺黃色，表明光滑，粘稠易挑起，不透明，無褶皺。鏡檢細(xì)胞呈橢圓形。 在NYDB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后，菌液渾濁，有沉淀；

（2）生理特征：本發(fā)明菌株能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、棉子糖、蜜二糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、麥芽糖、松三糖、甲基-α-D-葡萄糖苷、纖維二糖、水楊醇葡萄糖苷、左旋鼠李糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、乙醇、半乳糖醇、D-甘露醇、D-山梨糖醇、肌醇、琥珀酸鹽、葡（萄）糖酸鹽；

（3）分子鑒定：以菌株HMQAUSZ01基因組DNA為模板，利用引物NL1/ NL4對(duì)26S rDNA近5^，端的D1/D2區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。所述引物序列為NL1（5’-GCA TATCAATAAGCGGAGGAAAAG-’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGAC GG- 3’）；擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5μL，5 mM dNTP 2μL，10μLM引物NL1和引物NL4各1μL，Taq酶(5 U/μL) 0.5μL，模板DNA 2μL，補(bǔ)水至25μL。反應(yīng)條件： 94℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min20s，36個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行純化和雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Sequencher5.0 軟件自動(dòng)裝配后導(dǎo)出重疊群（Contig）并在 NCBI（http://www.ncbi.nlm.gov）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST 分析后提交給 GenBank。再?gòu)?GenBank 中 選 取 合 適 的 序 列， 經(jīng)CLUSTALW 2.0 軟件進(jìn)行序列對(duì)比，并用MEGA 5.0 軟件采用鄰接法（neighbor – joining analysis，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，其中 Bootstrap檢驗(yàn)的重復(fù)次數(shù)為 1,000次。結(jié)果表明，該菌株的大亞基序列與來自美國(guó)德克薩斯州的淺黃隱球酵母Cryptococcus flavescens大亞基序列（GenBank登錄號(hào)為FJ743610)的同源性達(dá)到99%。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，該菌株的大亞基序列與4株Cryptococcus flavescens菌株的大亞基序列位于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支。同源性比對(duì)數(shù)據(jù)和系統(tǒng)發(fā)育樹位置進(jìn)一步證明了菌株HMQAUSZ01為Cryptococcus flavescens。

綜合以上形態(tài)特征和26SrDNA序列同源性比對(duì)分析結(jié)果可知HMQAUSZ01屬于淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）。

核苷酸序列表

<110> 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一株淺黃隱球酵母及其在防治藍(lán)莓等果蔬采后病害的應(yīng)用

<160> 1

<210> 1

<211> 641

<212> DNA

<213> 淺黃隱球酵母(Cryptococcus flavescens)HMQAUSZ01

<400> 1

GCATATCAAT AAGCGGAGGA AAAGAAACTA ACAAGGATTC CCCTAGTAAC GGCGAGTGAA 60

CCGGGAAGAG CTCAAATTTG AAATCTGGCG TGCTCAGTGC GTCCGAGTTG TAATCTATAG120

AGTCGTTTTC CGTGCCGGAC TGTGTCCAAG TCCCTTGGAA CAGGGTATCA AAGAGGGTGA180

TAATCCCGTA CTTGACACAA TGACCGGTGC TCTGTGATAC GTCTTCTACG AGTCGAGTTG240

TTTGGGAATG CAGCTCAAAA TGGGTGGTGA GTTCCATCTA AAGCTAAATA TTGGCGAGAG300

ACCGATAGCG AACAAGTACC GTGAGGGAAA GATGAAAAGC ACTTTGGAAA GAGAGTTAAA360

CAGTACGTGA AATTGTTAAA AGGGAAACGA TTGAAGTCAG TCGTGACTGA GAGGCTCAGC420

CGGTTCTGCC GGTGTATTCC CCTCAGTCGG GTCAACATCA GTTTTGTTCG GTGGATAAGG480

GCGGTTGGAA GGTGGCACCC TCGGGTGTGT TATAGCCAAC TGTCGCATAC ATCGGATGAG540

ACTGAGGAAT GCAGCTCGCC TTTATGGCCG GGGTTCGCCC ACGTTCGAGC TTAGGATGTT600

GACATAATGG CTTTAAACGA CCCGTCTTGA AACACGGACC 640