本發(fā)明涉及一種塔賓曲霉及其液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素的方法。屬生物技術領域。

背景技術：
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曲霉(Aspergillus)是發(fā)酵工業(yè)和食品加工業(yè)的重要菌種，已被利用的近60種?，F(xiàn)代工業(yè)利用曲霉生產各種酶制劑(如淀粉酶、蛋白酶、及果膠酶)、有機酸(檸檬酸、葡萄糖酸、及五倍子酸)，農業(yè)上用作糖化飼料菌種。塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)被廣泛發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵食品中，如普洱茶及黃酒酒曲。塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)是黑色曲霉組(Aspergillus section Nigri)的一種，至2011年，黑色曲霉組已被鑒定和細化為26個種。應用分子生物學方法鑒定黑色曲霉組真菌時，分析比對真菌常用的核糖體rDNA ITS序列的解析度較低，無法區(qū)分每一個種；而測定分析鈣調蛋白(calmodulin)基因序列和β-微管蛋白(beta-tubulin)基因序列能夠區(qū)分所有種。

茶褐素(Theabrownins,TB)是指由茶葉中以兒茶素為主的多酚類化合物氧化聚合而成的大分子水溶性色素。它是一類易溶于水，但不溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇、三氯甲烷等有機溶劑的高聚合物質。具有調節(jié)血脂異常、抗動脈粥樣硬化、抗氧化的作用，是普洱茶的主要活性物質，在普洱熟茶中茶褐素含量平均為12％。

現(xiàn)有技術主要是從經固態(tài)發(fā)酵后的普洱熟茶中提取茶褐素。但普洱熟茶存在生產周期長(30天以上)、茶褐素含量高低不均、生產過程易污染雜菌、生產過程可控性和自動化差的技術問題。因此，現(xiàn)有的茶褐素提取方法也受到限制。

本發(fā)明通過從普洱茶固態(tài)發(fā)酵中分離而獲得塔賓曲霉，用塔賓曲霉KUtea 01接種生產茶褐素。經文獻檢索，未見與本發(fā)明相同的公開報道。

技術實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術之不足，而提供一種生產條件及環(huán)境容易控制，且不受茶葉生產季節(jié)限制，能實現(xiàn)自動化、效率高、成本低的塔賓曲霉及其液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素的方法。

本發(fā)明提供的塔賓曲霉，從普洱茶固態(tài)發(fā)酵中分離、純化所得。生產菌株為塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 01，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2014年11月20日，保藏號：CGMCC No.10022。

本發(fā)明用塔賓曲霉KUtea 01接種生產茶褐素，其生產方法包括以下步驟：

(1)制備綠茶茶湯：按1g:10-50mL的比例將綠茶加入到沸蒸餾水中，沸水浴15分鐘，后減壓過濾而得到茶湯，將茶湯冷卻后定容至10-50mL，在80℃下進行巴氏殺菌30分鐘，制得綠茶茶湯；

(2)制備種子培養(yǎng)基：將上述1所述的塔賓曲霉KUtea 01孢子在無菌操作下接種于上述(1)所得到的巴氏殺菌后的綠茶茶湯中，在250rpm，37℃下?lián)u瓶培養(yǎng)24h后得到種子培養(yǎng)基；

(3)液態(tài)發(fā)酵：按10％的種子培養(yǎng)基接種量將上述(2)所得的種子培養(yǎng)基在無菌操作下接種于上述(1)所得的的巴氏殺菌后的綠茶茶湯中，在30-45℃下，以100-500rpm，搖瓶發(fā)酵1-4天后生成茶褐素。

本發(fā)明的塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 01經公知的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)分離、純化，經可靠的分子生物學測序技術鑒定，其GenBank/EMBL/DDBJ編號分別為：ITS序列(KJ948640)、鈣調蛋白(calmodulin)基因序列(KJ948650)、β-微管蛋白(beta-tubulin)基因序列(KJ948652)。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

1、本發(fā)明的塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 01菌株能直接在綠茶茶湯中生長繁殖，無需額外添加任何碳源氮源，并能快速地將綠茶茶湯中的多酚類物質生物轉化為大分子水溶性茶褐素。

2、方法生產條件及環(huán)境容易控制，且不受茶葉生產季節(jié)限制，能實現(xiàn)自動化、效率高、成本低。

具體實施方式：

實施例1：塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 01的分離鑒定

(1)固態(tài)發(fā)酵普洱茶：按400g大葉曬青綠茶(Camellia sinensis var.assamica)噴灑蒸餾水200mL，使茶葉初始水分含量達到35％，用透氣性食品薄膜包裹后，置于45℃，相對濕度70％的全自動恒溫恒濕發(fā)酵箱中發(fā)酵14d。在第8天時，翻堆茶葉并適當噴灑補充水分，發(fā)酵結束后于60℃下鼓風干燥，得到普洱熟茶。經傳統(tǒng)萃取比色法分析測定，所得普洱熟茶樣品中茶褐素含量為10％。

(2)真菌的分離、純化和鑒定：在固態(tài)發(fā)酵期間，每天取樣，采用稀釋平板法進行微生物的分離。稱取1g樣品放入含9mL無菌水的錐形瓶中，150rpm搖床震蕩15min。將制備的菌懸液依次稀釋到10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，均勻涂布到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯淀粉4g、葡萄糖20g、氯霉素0.1g、瓊脂15g、蒸餾水1000mL、自然pH、在121℃高壓鍋中滅菌15min)平板上，37℃恒溫培養(yǎng)2d后，進行菌落計數(shù)。

挑取單菌落進行三點接種純化培養(yǎng)2-3次后，得到一株純菌株并命名為KUtea 01，將其劃線培養(yǎng)于PDA斜面上，37℃恒溫培養(yǎng)2d后轉至4℃冰箱中保存，用于后續(xù)測序鑒定及液態(tài)發(fā)酵產茶褐素試驗。

菌株的分類鑒定采用分子生物學測序技術。將KUtea 01菌株接種于已121℃高壓滅菌15min的20mL YM肉湯中(酵母抽提物3g,麥芽抽提物3g,蛋白胨5g,葡萄糖10g，蒸餾水1000mL),37℃,250rpm搖瓶培養(yǎng)24h。采用離心法(1700g，5min)分離菌絲，并用已滅菌的去離子水沖洗菌絲2次。用公知的CTAB法從新鮮菌絲中提取菌種DNA后，采用引物對ITS1和ITS4，Bt2a和Bt2b,CF1L和CF4分別對真菌的內轉錄間隔區(qū)(ITS)，鈣調蛋白(calmodulin)基因和β-微管蛋白(beta-tubulin)基因進行PCR擴增，并測定其序列組成。然后通過序列比對的方式在GenBank數(shù)據庫中對未知真菌KUtea 01進行鑒定。經鑒定為塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)，將所得序列提交至GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據庫，獲得編號如下：ITS序列(KJ948640)、鈣調蛋白(calmodulin)基因序列(KJ948650)、β-微管蛋白(beta-tubulin)基因序列(KJ948652)。

實施例2：將實施例1所得塔賓曲霉KUtea 01用于液態(tài)發(fā)酵綠茶茶湯生產茶褐素

(1)綠茶茶湯制備：大葉曬青綠茶(Camellia sinensis var.assamica)，按1g:30mL的比例加入沸蒸餾水，沸水浴15分鐘后減壓過濾得到茶湯，冷卻后定容至30mL。茶湯巴氏殺菌(80℃,30min)后冷卻至室溫用于后續(xù)塔賓曲霉KUtea 01液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素。

(2)種子培養(yǎng)基：將1-2環(huán)塔賓曲霉KUtea 01孢子在無菌操作下接種于含25mL上述已巴氏殺菌綠茶茶湯(按1g:30mL的茶水比制備綠茶茶湯)的125mL三角瓶中，在250rpm，37℃下?lián)u瓶培養(yǎng)24h，所得為種子培養(yǎng)基。

(3)液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素：將25mL上述種子培養(yǎng)基在無菌操作下接種于含225mL已巴氏殺菌綠茶茶湯(按1g:30mL的茶水比制備綠茶茶湯)的500mL三角瓶中(即種子培養(yǎng)基接種量10％)，250rpm，40℃下?lián)u瓶培養(yǎng)4d，發(fā)酵期間每天取樣測定茶褐素含量。結果表明，在發(fā)酵0d、1d、2d、3d、4d時發(fā)酵液中茶褐素濃度分別為0.19、0.73、6.58、11.40、12.44g/L。由于固態(tài)發(fā)酵14d后，茶褐素含量為10％，經計算對比，采用塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)KUtea 01液態(tài)發(fā)酵綠茶茶湯生產茶褐素時，容產率比固態(tài)發(fā)酵高11倍，實現(xiàn)了快速、低成本、高度可控化生產茶褐素。

實施例3：

基本同實施例2。與實施例2的不同之處僅在于：液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素溫度為30℃，在發(fā)酵0d、1d、2d、3d、4d時發(fā)酵液中茶褐素濃度分別為0.62、0.60、1.92、9.11、10.48g/L。

實施例4：

基本同實施例2。與實施例2的不同之處僅在于：液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素溫度為37℃，在發(fā)酵0d、1d、2d、3d、4d時發(fā)酵液中茶褐素濃度分別為0.64、0.80、5.22、9.28、11.28g/L。

實施例5：

基本同實施例2。與實施例2的不同之處僅在于：液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素溫度為42℃，在發(fā)酵0d、1d、2d、3d、4d時發(fā)酵液中茶褐素濃度分別為0.65、0.62、0.73、3.39、6.46g/L。

實施例6：

基本同實施例2。與實施例2的不同之處僅在于：液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素溫度為45℃，在發(fā)酵0d、1d、2d、3d、4d時發(fā)酵液中茶褐素濃度分別為0.93、0.98、0.97、1.14、4.16g/L。

實施例7：

基本同實施例2。與實施例2的不同之處僅在于：液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素時，所用綠茶茶湯的制備是按1g:10mL的比例加入沸蒸餾水，沸水浴15分鐘后減壓過濾得到茶湯，冷卻后定容至10mL。在發(fā)酵0d、1d、2d、3d、4d時發(fā)酵液中茶褐素濃度分別為1.13、1.46、3.41、6.68、12.43g/L。

實施例8：

基本同實施例2。與實施例2的不同之處僅在于：液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素時，所用綠茶茶湯的制備是按1g:50mL的比例加入沸蒸餾水，沸水浴15分鐘后減壓過濾得到茶湯，冷卻后定容至50mL。在發(fā)酵0d、1d、2d、3d、4d時發(fā)酵液中茶褐素濃度分別為0.42、0.66、4.13、4.41、5.54g/L。

實施例9：

基本同實施例2。與實施例2的不同之處僅在于：液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素時，搖床轉速為100rpm,在發(fā)酵0d、1d、2d、3d、4d時發(fā)酵液中茶褐素濃度分別為0.19、0.63、5.58、8.40、9.43g/L。

實施例10：

基本同實施例2。與實施例2的不同之處僅在于：液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素時，搖床轉速為500rpm,在發(fā)酵0d、1d、2d、3d、4d時發(fā)酵液中茶褐素濃度分別為0.19、1.73、9.58、12.40、13.44g/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南農業(yè)大學

<120> 一種塔賓曲霉及其液態(tài)發(fā)酵生產茶褐素的方法

<130> KUtea 01

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 524

<212> DNA

<213> Aspergillus tubingensis

<400> 1

tccgtgtcta ttataccctg ttgcttcggc gggcccgccg cttgtcggcc gccggggggg 60

cgcctttgcc ccccgggccc gtgcccgccg gagaccccaa cacgaacact gtctgaaagc 120

gtgcagtctg agttgattga atgcaatcag ttaaaacttt caacaatgga tctcttggtt 180

ccggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gataactaat gtgaattgca gaattcagtg 240

aatcatcgag tctttgaacg cacattgcgc cccctggtat tccggggggc atgcctgtcc 300

gagcgtcatt gctgccctca agcccggctt gtgtgttggg tcgccgtccc cctctccggg 360

gggacgggcc cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccgatc ctcgagcgta tggggctttg 420

tcacatgctc tgtaggattg gccggcgcct gccgacgttt tccaaccatt ttttccaggt 480

tgacctcgga tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca tatc 524

<210> 2

<211> 649

<212> DNA

<213> Aspergillus tubingensis

<400> 2

taatgtattt tcgaactcaa taggacaagg atggcgatgg tgggtggaat cctgtcccct 60

tcacgtttta cccgtagcgc tcgatccgac cgcgggattt cgaccgcaat tcccccatcg 120

atctgaatca ttatactgat gtaatctgga aataggccag atcaccacca aggagctcgg 180

cactgtgatg cgctccctcg gccagaaccc ctccgagtct gagcttcagg acatgatcaa 240

cgaggttgac gctgacaaca acggaacgat cgacttcccc ggtatgtgat agatctacgc 300

ctgtaaggcg ggaatgccgt atgggttgtg attatctttt gccgccagaa ttcctcacca 360

tgatggctcg taagatgaag gacaccgact ccgaggagga aatccgcgag gctttcaagg 420

tcttcgaccg cgacaacaat ggtttcatct ccgccgcgga gttgcgccac gtcatgacct 480

ccattggtga gaagctcact gacgacgaag tcgatgagat gatccgtgag gctgaccagg 540

acggtgatgg ccgcatcgac tgtatgtttc ccattcttga tatgcccatg atatgacatg 600

ctaactctgc taccagacaa cgagttcgtc caactcatga tgcaaaaaa 649

<210> 3

<211> 533

<212> DNA

<213> Aspergillus tubingensis

<400> 3

ggtgctgctt tctggtacgt attcactgcc actggattgg ggatggaaca tcatctctca 60

agctatctta gcttgagttc agatgttatc catcggatat atagctatcg ggttaagaac 120

acgtctaaca actcaacagg cagaccatct ctggcgagca cggccttgac ggctccggtg 180

tgtaagtaca actttttcac acctctcaat tggtcaacaa tgtggaaagg attgggtttc 240

ctgacgcgca ggatagttac aatggcacct ccgacctcca gctggagcgc atgaacgtct 300

acttcaacga ggttagatca caccgtccct gagtttttca cgacaatatc atcaatgtcc 360

tgaccacttc agcaggctag cggtaacaag tatgtccccc gtgccgtcct cgtcgatctc 420

gagcccggta ccatggacgc cgtccgtgcc ggtcccttcg gccagatctt ccgccccgac 480

aacttcgtct tcggccagtc cggtgctggt aacaactggg acaagggtca cta 533