一種酶解-發(fā)酵偶聯(lián)的制備水產(chǎn)蛋白活性肽方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶解-發(fā)酵偶聯(lián)的制備水產(chǎn)蛋白活性肽方法，屬于水產(chǎn)品加工與利用的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]蛋白質(zhì)酶解的后的產(chǎn)物小肽不但容易消化、吸收，而且還具有抗高血壓、抗膽固醇、抗血栓形成、改善脂質(zhì)代謝、增強(qiáng)人體體能、幫助恢復(fù)疲勞、促進(jìn)鈣磷和其它微量元素的吸收、促進(jìn)大腦發(fā)育、提高記憶力、增強(qiáng)巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞活力、增強(qiáng)免疫功能、保護(hù)表皮細(xì)胞、防止黑色素沉淀、消除體內(nèi)自由基等功效。
[0003]關(guān)于水產(chǎn)蛋白活性肽的制備，國(guó)內(nèi)進(jìn)行了大量的研究。目前，水產(chǎn)蛋白活性肽的制備方法主要有自溶酶解、酶解法、液態(tài)發(fā)酵法和固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)酶解相結(jié)合的方法這四種。專利申請(qǐng)200810195646.4“內(nèi)源酶制備生物活性小肽的工藝”公開了一種利用海洋低值魚體內(nèi)的內(nèi)源酶自溶酶解的方法制備水產(chǎn)蛋白生物活性小肽的方法。專利申請(qǐng)201410145196.3“一種制備扇貝裙邊活性肽的方法”公開了一種酶解法制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法。專利申請(qǐng)CN102028091A “一種納豆菌發(fā)酵法制備低分子魚肽的方法”公開了一種液體發(fā)酵法制備魚蛋白肽的方法，專利申請(qǐng)201210539941.3“一種由魚蛋白肽和與大豆肽組成的蛋白肽的生產(chǎn)方法”公開了一種由固態(tài)發(fā)酵與液態(tài)酶解相結(jié)合制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法。
[0004]現(xiàn)有的水產(chǎn)蛋白活性肽制備技術(shù)中存在以下缺陷。首先，現(xiàn)有的水產(chǎn)蛋白活性肽制備技術(shù)中都有高溫處理的過程。以上制備技術(shù)中都有高溫滅酶這一工序;微生物發(fā)酵的方法原料需要滅菌。以上這些高溫處理，會(huì)在一定程度減弱制備的功能肽或水產(chǎn)蛋白本身所含功能性成分的生物學(xué)活性；另外高溫處理會(huì)顯著增強(qiáng)美拉德反應(yīng)，使得酶解液顏色變深，為成品加工過程增加了負(fù)擔(dān)。其次，外加酶酶解的方法需要外加蛋白酶，增加了成本；自溶酶解由于內(nèi)源酶的不足，導(dǎo)致酶解不徹底。另外，微生物發(fā)酵法雖然不用外加蛋白酶，但是原料需要滅菌導(dǎo)致內(nèi)源酶失活，不能充分地有效利用內(nèi)源酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有的水產(chǎn)蛋白活性肽制備技術(shù)所存在的問題。本發(fā)明提供了一種酶解-發(fā)酵偶聯(lián)的制備水產(chǎn)蛋白活性肽方法，本技術(shù)可使得微生物發(fā)酵與內(nèi)源酶酶解過程能夠在酶解罐中有機(jī)結(jié)合在一起。本發(fā)明的主要目的是提供一種低溫的制備水產(chǎn)蛋白活性肽的方法，以便更好地保留制備的功能肽和水產(chǎn)蛋白本身所含功能性成分的生物學(xué)活性。發(fā)明另一目的是簡(jiǎn)化活性肽的制備工序，降低其生產(chǎn)成本。
[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:一種酶解-發(fā)酵偶聯(lián)的制備水產(chǎn)蛋白活性肽方法，包括如下步驟:
(I)將斜面保藏的能產(chǎn)蛋白酶的耐高溫兼性厭氧菌甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus) HL-4接入到滅菌后冷卻的LB液體培養(yǎng)基中，于55 °C、150r/min培養(yǎng)12h，制備成Bacillus methylotrophicus HL-4種子液備用；
(2)將新鮮的水產(chǎn)蛋白絞碎后備用；
(3)將步驟(2)制得的絞碎的水產(chǎn)蛋白放入到酶解罐中，并向酶解罐中加入水和營(yíng)養(yǎng)物，混勻后得到發(fā)酵培養(yǎng)基；
(4)往步驟(3)獲得的發(fā)酵培養(yǎng)上接入步驟(I)所制備的BaciIIusmethylotrophicusHL-4種子液；
(5 )酶解-發(fā)酵過程的控制:酶解罐溫度為5 O °C?5 5 °C，酶解罐的轉(zhuǎn)速為5 O r P m?10rpm，時(shí)間為 42h ?48h ；
(6)成品處理:將步驟(5)得到的發(fā)酵液通過過濾去除沉淀得到上清液;上清液通過截留分子量為5000道爾頓的超濾膜的超濾去除大分子蛋白質(zhì)而得到透過液;透過液然后通過截留分子量為200道爾頓的納濾膜的納濾去除氨基酸而得到濃縮液;濃縮液經(jīng)過冷凍干燥而得到活性肽成品。
[0007]所述步驟(I)中所用的產(chǎn)蛋白酶的耐高溫兼性厭氧菌甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus) HL-4已于2016年I月18日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為GDMCC No:60002，保藏地址為廣州市先烈中路100號(hào)大院59號(hào)樓5樓廣東省微生物研究所。
[0008]所述步驟(2)中的水產(chǎn)蛋白為羅非魚下腳料、南極磷蝦、蝦頭、扇貝裙邊、鱈魚下腳料、魷魚下腳料、牡蠣、青鱗魚下腳料、青魚下腳料、鰱魚下腳料、草魚下腳料和鰹魚下腳料中的一種。
[0009]所述步驟(3)中水產(chǎn)蛋白的加入量以添加的水產(chǎn)蛋白的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，為10%?30%。
[0010]所述步驟(3)中營(yíng)養(yǎng)物為葡萄糖、食品級(jí)氯化鈣、食品級(jí)氯化亞鐵和食品級(jí)磷酸氫二鉀所組成的混合物。所述步驟(3)中的營(yíng)養(yǎng)物的加入量以添加的營(yíng)養(yǎng)物的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，分別為:葡萄糖0.0I %?5%，食品級(jí)氯化|丐0.01 %?5%，食品級(jí)氯化亞鐵0.01%?5%，食品級(jí)磷酸氫二鉀0.01%?5%。
[0011 ] 所述步驟(4)中Bacillus methylotrophicus HL-4種子液的接種量以接入的種子液的質(zhì)量占發(fā)酵培養(yǎng)基總質(zhì)量百分比計(jì)，為I %?8%。
[0012]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)。
[0013](I)酶解-發(fā)酵的完美結(jié)合?，F(xiàn)有的發(fā)酵技術(shù)中，原料都需滅菌，這不但增加了能耗，而且又使得水產(chǎn)蛋白的內(nèi)源酶失活。而本技術(shù)中原料無需滅菌，保留了水產(chǎn)蛋白中內(nèi)源酶的活性。并且本技術(shù)采用的兼性厭氧菌菌發(fā)酵，使得在酶解罐中能同時(shí)進(jìn)行酶解和發(fā)酵；再加上微生物發(fā)酵的溫度與內(nèi)源酶的最適酶解溫度一致，使得內(nèi)源酶酶解與微生物發(fā)酵能完美結(jié)合在一起。正是由于本發(fā)明中充分利用內(nèi)源酶的酶解作用，使得本發(fā)明無需另加蛋白酶。
[0014](2)整個(gè)制備過程沒有高溫處理，更好地保留了制備的功能肽和水產(chǎn)蛋白本身所含其它功能性成分中的生物學(xué)活性，例如蝦頭和南極磷蝦中的蝦青素。本發(fā)明申請(qǐng)采用耐高溫BaciIIus methylotrophicus發(fā)酵，在高溫條件下可以抑制致病菌、腐敗菌及其他雜菌的生長(zhǎng)，因此本技術(shù)中培養(yǎng)基無需滅菌。另外，本技術(shù)采用超濾膜去除酶解液中的蛋白酶，無需高溫滅酶。
[0015](3)簡(jiǎn)化了工序。由于本發(fā)明沒有高溫滅酶的過程，這不但降低了能耗，而且還會(huì)大大降低酶解液的美拉德反應(yīng)，所以發(fā)酵液的顏色比較淺。而后續(xù)的膜分離又有一定的脫色效果，因此本技術(shù)中可以無需脫色這個(gè)程序，簡(jiǎn)化了工序，降低了成本。
[0016](4)制備成本要低于現(xiàn)有的酶解和發(fā)酵技術(shù)。與傳統(tǒng)的酶解技術(shù)相比，本發(fā)明申請(qǐng)?zhí)峁┑闹苽浼夹g(shù)中可以不用額外添加蛋白酶，降低了成本。與現(xiàn)有的發(fā)酵技術(shù)相比，本發(fā)明申請(qǐng)的發(fā)酵可在酶解罐中完成，不用購(gòu)買發(fā)酵罐及相關(guān)的設(shè)備，既降低了設(shè)備投入，又可在人工和能耗方面降低生產(chǎn)成本。
[0017]本發(fā)明提供了一種酶解-發(fā)酵偶聯(lián)的制備水產(chǎn)蛋白活性肽方法。本發(fā)明技術(shù)可以在酶解罐中同時(shí)完成了酶解和發(fā)酵的過程，簡(jiǎn)化了設(shè)備和操作;并且作用條件溫和，更多地保留了制備的功能肽和水產(chǎn)蛋白本身所含功能性成分的生物學(xué)活性，有著良好的應(yīng)用前景。
【具體實(shí)施方式】
[0018]為了更好地理解本發(fā)明，下面就水產(chǎn)蛋白的種類、發(fā)酵參數(shù)和發(fā)酵方式的選擇結(jié)合實(shí)施例對(duì)本