一種牡丹籽降血糖肽及其純化方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牡丹籽降血糖肽及其純化方法和應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。隨著經(jīng)濟(jì)水平的飛速發(fā)展，人們的飲食 越來越好，運(yùn)動(dòng)量日趨減少，導(dǎo)致糖尿病的發(fā)病率逐年增加。傳統(tǒng)的降血糖藥包括葡萄糖苷 酶抑制劑、胰島素增敏劑、胰島素促分泌劑、中成藥、胰島素、雙胍類藥物、磺酞脲類藥物等， 由于藥物治療存在副作用，長期使用患者難以接受。近年來，通過食療達(dá)到控制血糖的方法 越來越受到人們的青睞，其中開發(fā)新的葡萄糖苷酶抑制劑是眾多學(xué)者的努力方向。
[0003] 最近有學(xué)者以雜色蛤、蠶絲、蛋清和乳清等蛋白為原料，酶解制備具有抑制α_葡萄 糖苷酶的活性肽。但這些多肽的活性不高，如蠶絲源降血糖多肽中分離出的兩個(gè)三肽，半抑 制劑量分別為2.7mg/mL和1.5mg/mL。因此，研發(fā)新型高活性的降血糖肽是本行業(yè)重點(diǎn)要解 決的難題。
[0004] 自牡丹籽油被衛(wèi)生部正式批準(zhǔn)成為新型食用油以來，我國油用牡丹的種植面積逐 年遞增，榨油后的牡丹籽柏產(chǎn)量也不斷增加，其中粗蛋白約占牡丹籽柏的28.34% (W/W)。牡 丹籽蛋白含有18種天然氨基酸，其中8種人體必須氨基酸占30.44%，營養(yǎng)比例合理，具有極 大的開發(fā)前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種牡丹籽降血糖肽及其純化方法，采用超聲 波輔助酶解牡丹籽蛋白，通過超濾、離子交換樹脂、葡聚糖凝膠進(jìn)行分離純化，得到高活性 的降血糖肽。不僅為牡丹籽的綜合利用提供新方法，更為重要是獲得一種新型、高活性的降 血糖肽，為廣大糖尿病患者帶來福音。
[0006] 技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的牡丹籽降血糖肽通過如下方法制備得 到：
[0007] (1)將牡丹籽榨油之后得到的牡丹籽脫脂粉與水按照料液比1:8~12混合均勻，調(diào) 節(jié)pH至9~9.5，40~60°C下超聲攬摔提取蛋白，然后3500~3800r/min離心10~15min，取上 層液體，所得的沉淀按上述方法重復(fù)提取兩次，合并所得的上層液體，使用lmol/L HC1調(diào)節(jié) pH至4~4.5,3500~380〇1'/111；[11離心10~15111；[11，取沉淀進(jìn)行冷凍干燥，即得牡丹籽蛋白；
[0008] (2)配制1~3 %牡丹籽蛋白溶液，使用胰蛋白酶酶解，按照加胰蛋白酶5000~ 125000U/g，pH7.5~8.5，溫度35~40°C，超聲輔助酶解的時(shí)間15~25min，超聲波頻率22~ 40kHz，功率50~200W/L，反應(yīng)結(jié)束，沸水浴10~15min進(jìn)行滅酶，即可得到牡丹籽降血糖肽。
[0009] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，通過如下方法制備得到牡丹籽降血糖肽溶液：
[0010] a.將原料與蒸餾水混勻，使用lmol/L的NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至9.5，50 °C水浴超聲間歇 攪拌提取蛋白2h，3800r/min離心15min，所得沉淀再次提取兩次，所得上層液體使用lmo 1 /L HC1調(diào)節(jié)pH至4.5,3800r/min離心15min，取沉淀進(jìn)行冷凍干燥，即可獲得牡丹籽蛋白。
[0011 ] b.配制1~3 %牡丹籽蛋白溶液，使用胰蛋白酶按照加胰蛋白酶5000~125000U/g， pH7.5~8.5，溫度35~40°C，超聲輔助酶解的時(shí)間15~25min，超聲波頻率22~40kHz，功率 50~200W/L，反應(yīng)結(jié)束，沸水浴lOmin進(jìn)行滅酶，即可得到牡丹籽多肽溶液。
[0012] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了上述牡丹籽降血糖肽的純化方法，其特征在于，包括如下步 驟：
[0013] (1)將牡丹籽降血糖肽8000~10000r/min離心15~20min，取中層澄清液體，先使 用0.46μηι或0.22μηι濾膜過濾，過濾后進(jìn)行超濾，先使用10000Da的超濾膜進(jìn)行初濾，獲得分 子量在10000Da以下的初濾液，再將初濾溶液使用5000Da的濾膜進(jìn)行二次超濾，最終獲得抑 制率最好的分子量在5000Da以下濾液；
[0014] (2)采用樹脂進(jìn)行離子交換吸附，靜態(tài)吸附lh以上，收集洗脫物進(jìn)行冷凍干燥，得 到一級(jí)冷凍干燥多肽；
[0015] (3)將步驟（2)得到的冷凍干燥多肽配制成水溶液，采用SephadexG-15進(jìn)行柱層 析，收集得到的樣品并冷凍干燥，得到二級(jí)冷凍干燥多肽；
[0016] (4)將得到的二級(jí)冷凍干燥多肽使用C-18反相色譜柱分離，得到純化后的牡丹籽 降血糖肽。
[0017] 優(yōu)選地，步驟(2)中，所述的樹脂為732型陽離子樹脂、D151大孔陽離子交換樹脂、 717型陰離子交換樹脂中的任意一種。更優(yōu)選地，采用732型吸附率最高，效果最好.
[0018] 具體地，使用732型吸附的優(yōu)選步驟為：將處理好的732鈉型陽離子樹脂裝入層析 柱，使用蒸餾水以流速2%CV/min進(jìn)行平衡，在下游使用紫外檢測(cè)器在220nm進(jìn)行檢測(cè)，直至 基線平穩(wěn)，加入5000kD超濾溶液流經(jīng)樹脂床，待到樹脂下方也變成紅色，使用蒸餾水以流速 2%(^/111；[11沖洗樹脂，220111]1基線平穩(wěn)即可，換用0.5~2%(>八)氨水按照2%(^/111；[11進(jìn)行洗 脫，220nm檢測(cè)，收集第二個(gè)洗脫峰進(jìn)行冷凍干燥，其中，CV表示實(shí)際的柱容體積。
[0019] 優(yōu)選地，步驟（3 )中，采用SephadexG-1 5進(jìn)行柱層析的步驟為：將處理好的 SephadexG-15裝入層析柱，徑高比1:30~1:45，使用蒸餾水按照2 % CV/min流速進(jìn)行平衡， 在下游使用紫外檢測(cè)器在220nm進(jìn)行檢測(cè)；將配好的多肽溶液上樣，體積為柱體積的5~ 10%，待樣品完全進(jìn)入凝膠柱床，使用蒸餾水按照2%CV/min沖洗，220nm檢測(cè)并收集第二個(gè) 洗脫峰，CV表示實(shí)際的柱容體積。
[0020] 優(yōu)選地，步驟(4)中的C-18反相色譜柱分離的步驟為:配制流動(dòng)相，其中，流動(dòng)相A 為按照體積比超純水:TFA = 99.95:0.05，流動(dòng)相B為按照體積比乙腈:TFA = 99.95:0.05，流 動(dòng)相A、B均使用0.22μπι濾膜過濾，按照體積比流動(dòng)相A:流動(dòng)相B = 85:15，流速12%CV/min， 檢測(cè)波長220nm進(jìn)行檢測(cè)并收集，CV表示實(shí)際的柱容體積。
[0021] 更近一步地，本發(fā)明提出了上述的牡丹籽降血糖肽或經(jīng)純化得到的純化后的牡丹 籽降血糖肽在制備用于降血糖的藥品或保健品中的應(yīng)用。
[0022] 有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0023] (1)本發(fā)明通過對(duì)牡丹籽榨油之后的牡丹籽柏進(jìn)行超聲波復(fù)合酶解，并進(jìn)行分離 純化，制備新型、高活性的牡丹籽降血糖多肽。傳統(tǒng)酶解蛋白質(zhì)需要的反應(yīng)時(shí)間長，且效率 低下，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本發(fā)明使用超聲波輔助酶解，不僅可以實(shí)現(xiàn)縮短反應(yīng)時(shí)間，并且可以增加 產(chǎn)物得率。
[0024] (2)超濾技術(shù)是一種以壓力為推動(dòng)力的膜分離技術(shù)，按照物質(zhì)分子量的大小將大 分子與小分子的物質(zhì)分離，操作簡(jiǎn)單便捷、成本低廉、不增加任何化學(xué)試劑、不引起大分子 物質(zhì)的變性失活，并且具有單位容器內(nèi)充填密度高，占地面積小等優(yōu)點(diǎn)。本申請(qǐng)采用超濾技 術(shù)，最大限度保證多肽初步分離之后的活性。
[0025] (3)732型陽離子交換樹脂具有處理能力大，可以反復(fù)再生使用，工作壽命長，運(yùn)行 費(fèi)用較低等優(yōu)勢(shì)，適合工業(yè)化生產(chǎn)需求，D151大孔陽離子交換樹脂具有孔徑與比表面積大、 吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長等優(yōu)點(diǎn)，滿 足工業(yè)生產(chǎn)需要。717型陰離子交換樹脂具有再生效率高、堿水耗低、交換容量大、抗有機(jī)物 污染及抗氧化能力強(qiáng)、機(jī)械強(qiáng)度好等優(yōu)點(diǎn)，適合工業(yè)生產(chǎn)要求。Sephadex系列是由葡聚糖通 過環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)形成的三維網(wǎng)狀凝膠顆粒，其中G-15分離物質(zhì)的分子量小于1500Da，在 這個(gè)分子量范圍內(nèi)適用于脫鹽、肽和其他小分子的分離。優(yōu)點(diǎn)在于SephadexG-15屬于惰性 載體，不帶電荷，吸附力弱，操作條件很溫和，對(duì)分離成份的理化性質(zhì)、活性都有很好的保 持。在此處主要利用其條件溫和按照分子量大小進(jìn)行分離并且活性保持好的優(yōu)點(diǎn)。
[0026] (4)本發(fā)明中使用高效液相分離的方法，可以制備出純度較高的目標(biāo)產(chǎn)物多肽，極 具應(yīng)用前景。目前我國正在進(jìn)入老齡化社會(huì)，糖尿病是老年人群的高發(fā)病和常發(fā)病，并且有 著向低齡化邁進(jìn)的趨勢(shì)，因此對(duì)于降低血糖類食品的研發(fā)刻不容緩。生物產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展， 對(duì)于牡丹籽降血糖肽的推廣有很好的促進(jìn)作用，后續(xù)加工制成膠囊、片劑或者飲料、飲品類 等廣品。
【附圖說明】
[0027] 圖1為本發(fā)明牡丹籽降血糖肽的制備即純化流程示意圖；
[0028] 圖2為經(jīng)732鈉型陽離子樹脂柱層析后的多肽溶液的紫外檢測(cè)示意圖；
[0029] 圖3為SephadexG-15柱層析后得到的多肽溶液的紫外檢測(cè)示意圖；
[0030] 圖4為C-18反相色譜柱分離后得到的多肽溶液的HPLC示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 如圖1所示，本發(fā)明提供了一種牡丹籽降血糖肽及其純化方法，包括牡丹籽蛋白的 制備、多肽酶解液的制備，并進(jìn)一步通過超濾收集分子量小于5000的多肽，然后依次用離子 交換樹脂分離、葡聚糖凝膠分離和液相分離，得到純化的牡丹籽降血糖肽。
[0032] 下面通過具體的實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明。其中，下述實(shí)施例中，CV表示實(shí)際的柱容 體積;氨水濃度為體積分?jǐn)?shù)(V/V)。
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 將原料與蒸餾水按照料液比1:10進(jìn)行配比，攪拌15min使其充分混勻，用lmol/L NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至9.5,50°(：水浴超聲211，380(^/1^11離心15~2〇1^11，所得沉淀再次提取兩 次，合并所得上層液體使用lmol/L HC1調(diào)節(jié)pH至4.5，3800r/min離心15~20min，取沉淀進(jìn) 行冷凍干燥，即可獲得牡丹籽蛋白。