一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種Nrf 2-ARE通路激活劑的制備方法，具體涉及一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf 2-ARE通路激活劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高F值寡肽混合物是一個(gè)由由3?7個(gè)氨基酸殘氨基酸殘基所組成的混合小肽(或稱寡肽)體系。F值(Fischer rat1)是指支鏈氨基酸(BCAA: Val，lie，Leu)與芳香族氨基酸(△△六:1'印巧^?1^)含量的摩爾數(shù)比值。正常人的血液中？值為3.0-3.5，而患有肝臟疾病病人的F值只有1.0或者更低，而高F值寡肽的F值應(yīng)大于20，遠(yuǎn)高于人體中這兩類氨基酸的比值。由于它具有獨(dú)特的氨基酸組成和生理功能，已經(jīng)受到食品和醫(yī)藥界的高度關(guān)注。
[0003]鰹魚(Katsuwonus pelamis)，屬鱸形總目、金槍魚亞目、金槍魚科、舵鰹亞科、鰹屬，又名正鰹、炸彈魚、堅(jiān)魚、松魚、飛虎魚。鰹魚是大洋性重要經(jīng)濟(jì)魚。鰹魚分布范圍較廣，在印度洋、太平洋和大西洋水溫高于15攝氏度以上的水域，都有鰹魚的蹤跡，并且儲量豐富、開發(fā)利用前景樂觀。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2_ARE通路激活劑的制備方法。
[0005]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案為:一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf 2-ARE通路激活劑的制備方法，其包括以下步驟:
I)金槍魚碎肉的酶解:取金槍魚碎肉勻漿，按固液比I g:1OmL?15 mL加入Gly-NaOH緩沖液(0.05mol/L，pH 9.5),用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH到9.0?10.0，將溶液溫度調(diào)制55?65°C，按照金槍魚碎肉質(zhì)量的1.0 %?1.5 %加入堿性蛋白酶(酶活力2 1.95X105 U/g)，酶解時(shí)間
3.5h?4.0 h后，酶解液于90?95°C保溫10?15min，滅酶活;將酶解液溫度調(diào)至45?55°C，調(diào)節(jié)pH到6.0?7.0，按照金槍魚碎肉質(zhì)量的0.8 %?1.0%加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(酶活力2 IXlO3 1^^1]/^)，酶解時(shí)間2.5 h?3.0 h，酶解液于90?95°C保溫10?15min后降至室溫，于8000?10000 rpm離心15?20 min，取上清液。
[0006]2)金槍魚碎肉高F值寡肽的制備:取上述上清液，采用I kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液;將超濾酶解液調(diào)pH值至2.5-3.5,按照物料與活性炭顆粒比為10?15:1將超濾酶解液以0.3?0.5mL/min流速緩慢加入到裝載有活性炭顆粒的玻璃柱中，上樣完成后，采用2?3倍柱體積的1:1比例的lmol/L氨水和無水乙醇混合溶液洗脫色譜柱，收集洗脫液，干燥，得活性炭精制多肽;將活性炭精制多肽配成10?20 mg/mL的溶液，調(diào)pH值至6.5?7.5，緩慢加入到物料與D1I大孔樹脂比為1?15:1的裝載D1I大孔樹脂的玻璃柱中，用2?3倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質(zhì)，再用2?3倍柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為金槍魚碎肉高F值寡肽。
[0007]3)金槍魚碎肉高F值寡肽中Nrf2-ARE通路激活劑制備:將金槍魚碎肉高F值寡肽依次經(jīng)凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化，得Nrf2-ARE通路激活劑。
[0008]作為優(yōu)選，所述步驟I)中的金槍魚為鰹魚(Katsuwonus pelamis)。
[0009]作為優(yōu)選，所述步驟3)的凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化的具體過程為: 凝膠柱層析:將上述大孔樹脂精制多肽溶于雙蒸水配成濃度為20?30 mg/mL的溶液，
經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，流速為0.5?0.8 mL/min，洗出溶液每3 min收集一管并于220 nm檢測，按峰合并試管內(nèi)溶液，比較各峰對Nrf2蛋白質(zhì)水平的影響，選擇Nrf2蛋白質(zhì)水平最高組分凍干，即為凝膠層析酶解物；
反相高效液相色譜純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成90?100 yg/mL的溶液，利用反相高效液相色譜進(jìn)行純化，根據(jù)對Nrf2蛋白質(zhì)水平的影響得I個(gè)活性多肽Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVW)，ESI_MS測定分子量為658.76 Da0
[00?0]再優(yōu)選，所述反相高效液相色譜條件為:進(jìn)樣量10?15 yL;色譜柱KromasiI Cis(250 mmX4.6 mm,5 μπι);流動相:水-乙腈梯度洗脫(O?40min乙腈濃度由O勻速升至50%);洗脫速度0.8?1.0 mL/min;紫外檢測波長220 nm。
[0011]與現(xiàn)在技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑Ile-Glu-Leu-Val-Trp (IELVff)對羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；可促進(jìn)Nrf2蛋白質(zhì)積累，激活Nrf2-ARE通路，上調(diào)抗氧化酶和II相解毒酶清除有害物，保護(hù)機(jī)體免受氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧的損傷;可用作制備肝損傷、皮膚光老化、衰老及其它與Nrf 2-ARE通路密切相關(guān)的疾病的藥品或保健食品。
【附圖說明】
[0012]圖1是本發(fā)明的葡聚糖凝膠SephadexG_15層析圖。
[0013]圖2葡聚糖凝膠SephadexG_15制備酶解物的反相高效液相色譜色譜圖。
[0014]圖3Ile-Glu-Leu-Val-Trp (ffiLVW)對Nrf2蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0015]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0016]實(shí)施例:
一種金槍魚高F值寡肽中的Nrf2-ARE通路激活劑的制備方法的制備方法，制備工藝流程如下:金槍魚碎肉—雙酶酶解—酶解物—超濾—活性炭吸附—大孔樹脂純化—金槍魚高F值寡肽—凝膠過濾層析—高效液相色譜制備—Nrf2-ARE通路激活劑。
[0017]I)金槍魚碎肉的酶解:取鰹魚碎肉勻漿，按固液比I g:12 mL加入Gly-NaOH緩沖液(0.05mol/L，pH 9.5),用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH到9.3，將溶液溫度調(diào)制60°C，按照金槍魚碎肉質(zhì)量的1.2 %加入堿性蛋白酶(酶活力M.95X105 1]/^)，酶解時(shí)間3.5 h后，酶解液于95°C保溫12 min，滅酶活;將酶解液溫度調(diào)至50°C，調(diào)節(jié)pH到7.0，按照金槍魚碎肉質(zhì)量的0.9%加入復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(酶活力2 IXlO3 1^?1]/^)，酶解時(shí)間3.0 h，酶解液于95°C保溫15min后降至室溫，于9000 rpm離心15 min，取上清液。
[0018]2)金槍魚碎肉高F值寡肽的制備:取上述上清液，采用I kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液;將超濾酶解液調(diào)pH值至3.0，按照物料與活性炭顆粒比為12:1將超濾酶解液以0.3mL/min流速緩慢加入到裝載活性炭顆粒的玻璃柱中，上樣完成后，采用3倍柱體積的1:1比例的lmol/L氨水和無水乙醇混合溶液洗脫色譜柱，收集洗脫液，干燥，得活性炭精制多肽;將活性炭精制多肽配成15 mg/mL的溶液，調(diào)pH值至7.0，緩慢加入到物料與DlOl大孔樹脂比為15:1的裝載DlOl大孔樹脂的玻璃柱中，用3倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質(zhì)，再用3柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為金槍魚碎肉高F值寡肽。
[0019]3)金槍魚碎肉高F值寡肽中Nrf2-ARE通路激活劑制備:將金槍魚碎肉高F值寡肽依次經(jīng)凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化，得