一種從凝結(jié)芽孢桿菌中提取環(huán)(甘-丙)二肽的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)(甘-丙）二肽的制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從凝結(jié)芽孢桿菌中提 取環(huán)(甘-丙)二肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 凝結(jié)芽孢桿菌(bacillus coagulans LL1103)，又稱芽孢乳酸菌，既擁有乳酸菌產(chǎn) 乳酸的特性，又具有芽孢桿菌的豐富的酶系統(tǒng)及抗逆性強、耐高溫、耐膽鹽、易儲存的特性。 作為益生菌家族的后起之秀，將其制成微生態(tài)制劑己被廣泛地應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、畜牧伺料、 食品和醫(yī)藥等行業(yè)。凝結(jié)芽孢桿菌除了在維持腸道微生態(tài)平衡中的保健作用外，其對常見 腸道疾病如慢性結(jié)腸炎、腹瀉和便秘等有明顯療效，還具有調(diào)節(jié)血糖血脂和提高免疫力的 功效。
[0003] 研究表明凝結(jié)芽孢桿菌代謝產(chǎn)物中具有抑制腐敗菌和致病菌的多肽類物質(zhì)細菌 素，近年來還有關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生抗植物病原真菌的報道。但是凝結(jié)芽孢桿菌代謝產(chǎn) 物中卻未見小分子物質(zhì)環(huán)二肽類化合物的報道，環(huán)二肽是一種具有穩(wěn)定六元環(huán)結(jié)構(gòu)的二酮 哌嗪類物質(zhì)，表現(xiàn)出抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫抑制、神經(jīng)保護、抗高血糖、抗瘧 疾等多種生物活性和藥理活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種制備工藝簡單、制得的環(huán)(甘-丙）二肽純度高的從凝結(jié) 芽孢桿菌中提取環(huán)(甘-丙)二肽的方法。
[0005] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是，一種從凝結(jié)芽孢桿菌中提取環(huán)(甘-丙)二肽的方法，環(huán)(甘-丙)二肽的結(jié)構(gòu)式如下：
所述方法包括以下步驟： (1) 菌種活化:將凝結(jié)芽孢桿菌接種到平板培養(yǎng)基上，37 °C條件下培養(yǎng)24小時，獲得活 化菌種； (2) 初級培養(yǎng):將步驟（1)中得到的活化菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在150r/min，37 °C條件下，搖床培養(yǎng)12~16小時，得種子液； (3) 次級培養(yǎng):將步驟(2)得到的種子液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，種子液的體積為MRS 液體培養(yǎng)基體積的4~6%，在150r/min，37 °C條件下，搖床培養(yǎng)48~72小時得發(fā)酵液； (4)粗提物制備:將步驟(3)制備的發(fā)酵液旋蒸濃縮至原發(fā)酵液體積的1/4后離心，取上 清液用乙醇沉淀，過濾并繼續(xù)將濾液濃縮至原濾液體積的1/4,然后用乙酸乙酯萃取，將水 相用正丁醇進行再次萃取，將正丁醇萃取液減壓濃縮獲得粗提物； (5)硅膠柱層析粗分:將步驟(4)制備的粗提物用甲醇溶解，然后硅膠拌樣后裝柱，固 定相為80-100目的硅膠，以二氯甲烷：甲醇體積比=50:1~1:1梯度洗脫，硅膠薄層層析檢 測，合并二氯甲烷-甲醇的體積比為1:1的流份； (6)將步驟(5)得到的流份采用重結(jié)晶法純化，重結(jié)晶法純化的具體操作為:將步驟(5) 得到的流份旋蒸濃縮除去二氯甲烷和甲醇，干燥，在50°C下加入二氯甲烷：甲醇(體積比）= 1:1的二氯甲烷-甲醇溶劑溶解完全，然后4°C下冷凝12~24h，過濾，干燥，用甲醇洗滌，將甲 醇洗滌后的固體加入二氯甲烷：甲醇(體積比）=1:1的二氯甲烷-甲醇溶解完全，然后4°C下 冷凝12~24h，過濾，干燥，得環(huán)(甘-丙)二肽。
[0006] 所述平板培養(yǎng)基的配方為：蛋白胨l〇.〇g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡萄 糖20.0 g/L、乙酸鈉5. Og/L、檸檬酸二胺2. Og/L、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鎂0.58g/L、硫酸錳 0.25g/L、瓊脂15.0g/L，吐溫-80 l.OmL /L，pH 6.0。
[0007] 所述MRS液體培養(yǎng)基的配方為:蛋白胨10.0g/L、牛肉膏10.0g/L、酵母膏5.0g/L、葡 萄糖20.0g/L、乙酸鈉5.0g/L、檸檬酸二胺2.0g/L、磷酸氫二鉀0.4g/L、硫酸鎂0.58g/L、硫酸 錳0.25g/L、吐溫-80 l.OmL /L，pH 6.0。
[0008] 所述步驟(4)中發(fā)酵液旋蒸濃縮后離心分離的工藝條件為：離心條件為溫度4 °C， 轉(zhuǎn)速為5000rpm，離心時間20min。
[0009] 所述步驟（4)中上清液用乙醇沉淀的具體操作為：向上清液中加入等體積的 95vol%的乙醇。
[0010] 所述步驟(4)中濃縮后濾液用乙酸乙酯萃取的具體操作是：將濃縮后濾液與乙酸 乙酯按體積比1:1混合，倒入分液漏斗中，搖瓶萃取2~3次，每次靜置20~30min，得到水相； 乙酸乙酯萃取得到的水相用正丁醇萃取的具體操作是:水相與正丁醇按體積比1:1混合，倒 入分液漏斗中，搖瓶萃取2~3次，每次靜置20~30min，得到正丁醇萃取液。
[0011] 本發(fā)明產(chǎn)生的有益效果是:本發(fā)明以凝結(jié)芽孢桿菌為原料進行環(huán)(甘-丙）二肽的 提取，凝結(jié)芽孢桿菌是一種益生菌，其代謝產(chǎn)物具有天然性安全性，且提取方法簡單，成本 低，具有可持續(xù)性，制得的環(huán)(甘-丙）二肽純度高(可達99%)，對促進環(huán)(甘-丙)二肽藥理學(xué) 進一步研究和做為藥物先導(dǎo)化合物開發(fā)和利用具有重要意義。
【附圖說明】
[0012]圖1為實施例1制備的環(huán)(甘-丙)二肽的4 NMR圖； 圖2為實施例1制備的環(huán)(甘-丙)二肽的13C NMR圖。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍不限于此。以 下實施例中的所用的凝結(jié)芽孢桿菌來源于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏編號:CCTCC N0: M2013193)。
[0014] 實施例1 一種從凝結(jié)芽孢桿菌中提取環(huán)(甘-丙)二肽的方法，包括以下步驟： (1) 菌種活化:將凝結(jié)芽孢桿菌接種到平板培養(yǎng)基上，37 °C條件下培養(yǎng)24小時，獲得活 化菌種； (2) 初級培養(yǎng):將步驟（1)中得到的活化菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中，在150r/min，37 °C條件下，搖床培養(yǎng)12小時，得種子液1L; (3) 次級培養(yǎng):將步驟(2)得到的種子液接種到MRS液體培養(yǎng)基中，種子液的體積為MRS 液體培養(yǎng)基體積的4%，在150r/min，37 °C條件下，搖床培養(yǎng)48小時得發(fā)酵液20L; (4) 粗提物制備:將步驟(3)制備的發(fā)酵液旋蒸濃縮至原來體積的1/4后離心，取上清液 用乙醇沉淀，過濾并繼續(xù)將濾液濃縮至原來體積的1/4,然后用乙酸乙酯萃取，將水相用正 丁醇進行再次萃取，將正丁醇萃取液減壓濃縮獲得粗提物20g; (5)硅膠柱層析粗分:將步驟(4)制備的粗提物用甲醇溶解然后硅膠拌樣后裝柱，固定 相為80-100目的硅膠，以二氯甲烷：甲醇體積比=50:1~1:1梯度洗脫(二氯甲烷：甲醇體積 比為50:1，40 :1，30:1，20:1，10:1，1:1)，硅膠薄層層析檢測，收集二氯甲烷-甲醇的體積比 為1:1的流份； (6)將步驟(5)得到的流份采用重結(jié)晶法純化，重結(jié)晶法純化的具體操作為:將步驟(5) 得到的流份旋蒸濃