本發(fā)明涉及微生物選育技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種一種阿維拉霉素高產(chǎn)菌株及其選育方法。
背景技術(shù)：
阿維拉霉素(avilamycin)又名卑霉素，是由綠色產(chǎn)色鏈霉（streptomycesviridoehrongenes）經(jīng)過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生的一種寡糖類(lèi)抗生素，由美國(guó)禮來(lái)公司最先研制開(kāi)發(fā)并命名為效美素(maxus100)由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致的高安全性，其易降解導(dǎo)致的在腸道基本無(wú)殘留和對(duì)環(huán)境污染小以及毒性小、不存在交叉耐藥性等特點(diǎn)，因此被廣泛用于畜禽飼料中作為添加劑使用，而且無(wú)需停藥期。目前阿維拉霉素在世界上主要的養(yǎng)殖業(yè)國(guó)家，比如歐盟、日本、巴西等被大量使用，而在2005年被我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)進(jìn)口使用[進(jìn)口獸藥再注冊(cè)目錄，(2005)外獸藥證字56號(hào)]。近年來(lái)，我國(guó)對(duì)阿維拉霉素的生產(chǎn)研究也在相應(yīng)的增加，有關(guān)的報(bào)道也在逐年的增加。
國(guó)內(nèi)外對(duì)綠色鏈霉菌及阿維拉霉素的研究基本上仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。研究?jī)?nèi)容包括菌種選育、培養(yǎng)基和培養(yǎng)工藝對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和阿維拉霉素生成的影響、鏈霉菌細(xì)胞內(nèi)阿維拉霉素的提取與測(cè)定等。但至今仍存在一些關(guān)鍵問(wèn)題有待解決，主要是阿維拉霉素合成的詳細(xì)途徑及調(diào)控因子不明確，無(wú)法確定阿維拉霉素生產(chǎn)運(yùn)輸機(jī)制等?？傮w歸納有三點(diǎn)：c1)對(duì)鏈霉菌產(chǎn)阿維拉霉素的基因調(diào)控及代謝網(wǎng)絡(luò)了解不深；c2)主要采用傳統(tǒng)育種方法，工作量大，機(jī)會(huì)性強(qiáng)；c3)篩選手段不精心設(shè)計(jì)、效率低、工作量大。因此探索新的途徑和手段，獲得高產(chǎn)阿維拉霉素鏈霉菌菌株就成為產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的關(guān)鍵問(wèn)題和核心技術(shù)。
現(xiàn)有技術(shù)如中國(guó)知網(wǎng)中論文：王慶齡.阿維拉霉素高產(chǎn)菌株選育[d].浙江工商大學(xué)，2015.公開(kāi)了阿維拉霉素是一種正糖霉素族中的寡糖類(lèi)抗生素，作為一種新型促進(jìn)消化和代謝調(diào)節(jié)飼料藥物添加劑，以其高安全性、低毒性以及低殘留被歐盟等國(guó)家批準(zhǔn)使用。本文通過(guò)誘變及基因組重排的方法并結(jié)合利福平抗性壓力，選育了高產(chǎn)阿維拉霉素生產(chǎn)菌。通過(guò)rpob序列分析，闡述了重組菌利福平遺傳抗性及代謝特性。建立了發(fā)酵液中阿維拉霉素?zé)o鹽相液相色譜測(cè)量法。該論文公布的高產(chǎn)阿維拉霉素生產(chǎn)菌產(chǎn)阿維拉霉素的產(chǎn)率還有待提高。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種無(wú)化學(xué)污染、安全性高、成本低、突變率高的誘變方法，效率高且能提高正向突變率的篩選方法，選育出阿維拉霉素產(chǎn)率高的菌株。
本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中提到的問(wèn)題，采取的技術(shù)方案為：一種阿維拉霉素高產(chǎn)菌株選育方法，具體步驟：
1）artp及第一次137csy誘變：將原始菌株11-10活化培養(yǎng)，制備單孢子懸液，artp及137csy誘變，artp照射時(shí)間為170~210s，較高的致死率有利于淘汰親本和篩選突變株，同時(shí)等離子誘變時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。瓊脂塊法初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其效價(jià)，得到誘變高產(chǎn)菌株b-1、f-2和f-28，凍干管保存。等離子誘變使用的是一種等離子體源，其能夠在大氣壓下產(chǎn)生一股溫度在25-40℃之間、并具有高活性離子濃度的等離子體射流。等離子體中的活性粒子可改變微生物的細(xì)胞壁及膜的通透性，引起相應(yīng)基因損傷，從而使微生物的基因簇及代謝發(fā)生顯著變化，最終致使基因發(fā)生突變。artp具有成本低、無(wú)化學(xué)污染、高安全性以及高突變率的優(yōu)點(diǎn)；
2）第二次137csy誘變：再次用137csy進(jìn)行誘變，再利用瓊脂塊法初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其效價(jià)，得到正向誘變株g-11、h-7和i-17，凍干管保存；
3）第一輪原生質(zhì)體融合：將高產(chǎn)菌株b-1、f-2、f-28、g-11、h-7和i-17分別在種子活化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收集菌絲體，加入溶菌酶，得到的六種原生質(zhì)體，將其作為親本進(jìn)行原生質(zhì)體融合，在利福平濃度為280~320mg/l的抗性平板上進(jìn)行初篩，再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其效價(jià)，得到融合株g1-4、g1-6、g1-20和g1-31，再生培養(yǎng)，凍干管保存。再生平板使用前需在34~40℃的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一天，或是在60~70℃的烘箱中烘25~35min，以保證固體培養(yǎng)基表面的水分能夠充分蒸發(fā)，從而減少由于再生培養(yǎng)基表面的冷凝水所引起的原生質(zhì)體破裂。原生質(zhì)體融合技術(shù)不僅能夠打破有性雜交重組基因以創(chuàng)造新種的界限，更重要的是能夠擴(kuò)大遺傳物質(zhì)的重組范圍，能夠?qū)⒍喾N正向突變?nèi)诤希玫郊喾N正向突變于一體的融合菌株；
4）第三次137csy誘變：對(duì)第一次融合的效價(jià)最高的菌種g1-6再次137csy誘變，再利用瓊脂塊法初篩，再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其效價(jià)，得到正向誘變株y4、y13和y32，凍干管保存；
5）第二輪原生質(zhì)體融合：將效價(jià)提高的誘變株y4、y13和y32重復(fù)第三步，抗性平板上利福平含量為480~520mg/l，得到融合株g2-10和g2-31，測(cè)其效價(jià)，將融合株g2-31保藏，保藏號(hào)為cgmcc13119。隨著原生質(zhì)體的逐漸融合，篩選菌株的利福平抗性壓力增大，在淘汰親本的同時(shí)減輕了初篩的工作量；將融合株g2-31五次傳代性能穩(wěn)定，其正突變率成明顯上升趨勢(shì)；基因組重排技術(shù)是將分子進(jìn)化的對(duì)象定向?yàn)檎麄€(gè)基因組而非單個(gè)基因，從而可以更為廣泛的對(duì)菌株的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。此技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)就是不必了解菌株的遺傳背景而只是從細(xì)胞水平上進(jìn)行定向優(yōu)化。使用基因組重排技術(shù)，能夠快速實(shí)現(xiàn)鏈霉菌基因的突變和篩選，得到的融合株g2-31阿維拉霉素的產(chǎn)率高。
優(yōu)選的，鏈霉菌活化培養(yǎng)基的成份及其重量份為：可溶性淀粉30~40份、mgso4·6h2o0.7~1.2份、kno31.3~1.8份、k2hpo40.5~0.9份、feso4·7h2o0.01~0.03份、nacl0.4~0.9份、agar30~40份，ph為7.2~7.4。上述活化培養(yǎng)基能使處于凍干狀態(tài)的鏈霉菌迅速活化，恢復(fù)生長(zhǎng)活力并且進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，菌數(shù)擴(kuò)增，得到足夠下一步操作的數(shù)量。
優(yōu)選的，再生培養(yǎng)基的配置為：在四個(gè)錐形瓶中分別都裝有蔗糖10~15份、葡萄糖1~2份、蛋白胨0.01~0.03份、酵母浸出粉0.5~0.8份、烏索酸0.00002~0.00004份、kh2po40.025~0.05份、mgcl2·6h2o1~1.2份、微量元素溶液0.4~0.8份、tes3~5份、海藻酸鈉0.0001~0.0003份和瓊脂4~8份，再分別加入單獨(dú)滅菌的k2h2po40.002~0.004份、cacl2·2h2o0.001~0.002份和naoh0.0005~0.0009份。上述培養(yǎng)基不僅能穩(wěn)定滲透壓，保護(hù)原生質(zhì)體不會(huì)因吸水過(guò)多漲破或因失水而失去活性，又能提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，烏索酸和海藻酸鈉促進(jìn)細(xì)胞壁的合成，相比于現(xiàn)有技術(shù)，上述再生培養(yǎng)基能使細(xì)胞壁合成的速度加快，菌株活性強(qiáng)。
優(yōu)選的，步驟3和5中活化培養(yǎng)基為上述活化培養(yǎng)基中加入1~3份甘氨酸。
優(yōu)選的，微量元素溶液成份及其重量份為：zncl20.0003~0.0005份、fecl3·6h2o0.001~0.003份、cacl2·2h2o0.0001~0.0003份、mncl2·4h2o0.0001~0.0003份、nbb4o7·10h2o0.0001~0.0003份、(nh4)6m7o24·4h2o0.0001~0.0003份和10份蒸餾水。
優(yōu)選的，鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基成份及其重量份為：可溶性淀粉30~40份、豆粕粉30~40份、d-木糖7.5~8.2份、l-纈氨酸2.4~2.5份、大豆蛋白胨5.6~6.3份、mgso40.52~0.61份、mncl20.52~0.61份、caco30.52~0.61份，ph為7.2~7.4。上述培養(yǎng)基能提供鏈霉菌發(fā)酵所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其分泌產(chǎn)生阿維拉霉素，通過(guò)測(cè)定每株菌株產(chǎn)生阿維拉霉素的量來(lái)對(duì)菌株進(jìn)行篩選。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：等離子誘變使用的是一種等離子體源，其能夠在大氣壓下產(chǎn)生一股溫度在25-40℃之間、并具有高活性離子濃度的等離子體射流。等離子體中的活性粒子可改變微生物的細(xì)胞壁及膜的通透性，引起相應(yīng)基因損傷，從而使微生物的基因簇及代謝發(fā)生顯著變化，最終致使基因發(fā)生突變。artp具有成本低、無(wú)化學(xué)污染、高安全性以及高突變率的優(yōu)點(diǎn)；原生質(zhì)體融合技術(shù)不僅能夠打破有性雜交重組基因以創(chuàng)造新種的界限，更重要的是能夠擴(kuò)大遺傳物質(zhì)的重組范圍，能夠?qū)⒍喾N正向突變?nèi)诤?，得到集多種正向突變于一體的融合菌株；隨著原生質(zhì)體的逐漸融合，篩選菌株的利福平抗性壓力增大，在淘汰親本的同時(shí)減輕了初篩的工作量；將融合株g2-31五次傳代性能穩(wěn)定，其正突變率成明顯上升趨勢(shì)；基因組重排技術(shù)是將分子進(jìn)化的對(duì)象定向?yàn)檎麄€(gè)基因組而非單個(gè)基因，從而可以更為廣泛的對(duì)菌株的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。此技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)就是不必了解菌株的遺傳背景而只是從細(xì)胞水平上進(jìn)行定向優(yōu)化。使用基因組重排技術(shù)，能夠快速實(shí)現(xiàn)鏈霉菌基因的突變和篩選，得到的融合株g2-31阿維拉霉素的產(chǎn)率高；再生培養(yǎng)基不僅能穩(wěn)定滲透壓，保護(hù)原生質(zhì)體不會(huì)因吸水過(guò)多漲破或因失水而失去活性，又能提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，加快細(xì)胞壁的合成，相比于現(xiàn)有技術(shù)，上述再生培養(yǎng)基能使細(xì)胞壁合成的速度加快，菌株活性強(qiáng)；本發(fā)明選育方法簡(jiǎn)單高效，相對(duì)于傳統(tǒng)選育方法工作量大大減少，最后得到的菌株阿維拉霉素的產(chǎn)率高。
具體實(shí)施例
下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明方案作進(jìn)一步說(shuō)明：
實(shí)施例1：
一種阿維拉霉素高產(chǎn)菌株選育方法，具體步驟：
1）artp及第一次137csy誘變：將原始菌株11-10活化培養(yǎng)，制備單孢子懸液，artp及137csy誘變，artp照射時(shí)間為170~210s，較高的致死率有利于淘汰親本和篩選突變株，同時(shí)等離子誘變時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。瓊脂塊法初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其效價(jià)，得到誘變高產(chǎn)菌株b-1、f-2和f-28，凍干管保存。等離子誘變使用的是一種等離子體源，其能夠在大氣壓下產(chǎn)生一股溫度在25-40℃之間、并具有高活性離子濃度的等離子體射流。等離子體中的活性粒子可改變微生物的細(xì)胞壁及膜的通透性，引起相應(yīng)基因損傷，從而使微生物的基因簇及代謝發(fā)生顯著變化，最終致使基因發(fā)生突變。artp具有成本低、無(wú)化學(xué)污染、高安全性以及高突變率的優(yōu)點(diǎn)；
2）第二次137csy誘變：再次用137csy進(jìn)行誘變，再利用瓊脂塊法初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其效價(jià)，得到正向誘變株g-11、h-7和i-17，凍干管保存；
3）第一輪原生質(zhì)體融合：將高產(chǎn)菌株b-1、f-2、f-28、g-11、h-7和i-17分別在種子活化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收集菌絲體，加入溶菌酶，得到的六種原生質(zhì)體，將其作為親本進(jìn)行原生質(zhì)體融合，在利福平濃度為280~320mg/l的抗性平板上進(jìn)行初篩，再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其效價(jià)，得到融合株g1-4、g1-6、g1-20和g1-31，再生培養(yǎng)，凍干管保存。再生平板使用前需在34~40℃的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一天，或是在60~70℃的烘箱中烘25~35min，以保證固體培養(yǎng)基表面的水分能夠充分蒸發(fā)，從而減少由于再生培養(yǎng)基表面的冷凝水所引起的原生質(zhì)體破裂。原生質(zhì)體融合技術(shù)不僅能夠打破有性雜交重組基因以創(chuàng)造新種的界限，更重要的是能夠擴(kuò)大遺傳物質(zhì)的重組范圍，能夠?qū)⒍喾N正向突變?nèi)诤希玫郊喾N正向突變于一體的融合菌株；
4）第三次137csy誘變：對(duì)第一次融合的效價(jià)最高的菌種g1-6再次137csy誘變，再利用瓊脂塊法初篩，再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其效價(jià)，得到正向誘變株y4、y13和y32，凍干管保存；
5）第二輪原生質(zhì)體融合：將效價(jià)提高的誘變株y4、y13和y32重復(fù)第三步，抗性平板上利福平含量為480~520mg/l，得到融合株g2-10和g2-31，測(cè)其效價(jià)，將融合株g2-31保藏，保藏號(hào)為cgmcc13119。隨著原生質(zhì)體的逐漸融合，篩選菌株的利福平抗性壓力增大，在淘汰親本的同時(shí)減輕了初篩的工作量；將融合株g2-31五次傳代性能穩(wěn)定，其正突變率成明顯上升趨勢(shì)；基因組重排技術(shù)是將分子進(jìn)化的對(duì)象定向?yàn)檎麄€(gè)基因組而非單個(gè)基因，從而可以更為廣泛的對(duì)菌株的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。此技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)就是不必了解菌株的遺傳背景而只是從細(xì)胞水平上進(jìn)行定向優(yōu)化。使用基因組重排技術(shù)，能夠快速實(shí)現(xiàn)鏈霉菌基因的突變和篩選，得到的融合株g2-31阿維拉霉素的產(chǎn)率高。
鏈霉菌活化培養(yǎng)基的成份及其重量份為：可溶性淀粉30~40份、mgso4·6h2o0.7~1.2份、kno31.3~1.8份、k2hpo40.5~0.9份、feso4·7h2o0.01~0.03份、nacl0.4~0.9份、agar30~40份，ph為7.2~7.4。上述活化培養(yǎng)基能使處于凍干狀態(tài)的鏈霉菌迅速活化，恢復(fù)生長(zhǎng)活力并且進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，菌數(shù)擴(kuò)增，得到足夠下一步操作的數(shù)量。
再生培養(yǎng)基的配置為：在四個(gè)錐形瓶中分別都裝有蔗糖10~15份、葡萄糖1~2份、蛋白胨0.01~0.03份、酵母浸出粉0.5~0.8份、烏索酸0.00002~0.00004份、kh2po40.025~0.05份、mgcl2·6h2o1~1.2份、微量元素溶液0.4~0.8份、tes3~5份、海藻酸鈉0.0001~0.0003份和瓊脂4~8份，再分別加入單獨(dú)滅菌的k2h2po40.002~0.004份、cacl2·2h2o0.001~0.002份和naoh0.0005~0.0009份。上述培養(yǎng)基不僅能穩(wěn)定滲透壓，保護(hù)原生質(zhì)體不會(huì)因吸水過(guò)多漲破或因失水而失去活性，又能提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，加快細(xì)胞壁的合成，相比于現(xiàn)有技術(shù)，上述再生培養(yǎng)基能使細(xì)胞壁合成的速度加快，菌株活性強(qiáng)。
步驟3和5中活化培養(yǎng)基為上述活化培養(yǎng)基中加入1~3份甘氨酸。
微量元素溶液成份及其重量份為：zncl20.0003~0.0005份、fecl3·6h2o0.001~0.003份、cacl2·2h2o0.0001~0.0003份、mncl2·4h2o0.0001~0.0003份、nbb4o7·10h2o0.0001~0.0003份、(nh4)6m7o24·4h2o0.0001~0.0003份和10份蒸餾水。
鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基成份及其重量份為：可溶性淀粉30~40份、豆粕粉30~40份、d-木糖7.5~8.2份、l-纈氨酸2.4~2.5份、大豆蛋白胨5.6~6.3份、mgso40.52~0.61份、mncl20.52~0.61份、caco30.52~0.61份，ph為7.2~7.4。上述培養(yǎng)基能提供鏈霉菌發(fā)酵所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其分泌產(chǎn)生阿維拉霉素，通過(guò)測(cè)定每株菌株產(chǎn)生阿維拉霉素的量來(lái)對(duì)菌株進(jìn)行篩選。
實(shí)施例2：
綠色產(chǎn)色鏈霉菌streptomycesviridochromogenes11一10，效價(jià)為710mg/l，浙江工商大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。
檢定菌:藤黃微球菌(microccusluteus)10209，來(lái)自于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。
一種阿維拉霉素高產(chǎn)菌株選育方法，具體步驟：
1）artp及第一次137csy誘變：將原始菌株11-10活化培養(yǎng)，制備單孢子懸液，artp及137csy誘變，artp照射時(shí)間為200s，較高的致死率有利于淘汰親本和篩選突變株，同時(shí)等離子誘變時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)。瓊脂塊法初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其效價(jià)，得到誘變高產(chǎn)菌株b-1、f-2和f-28，凍干管保存。等離子誘變使用的是一種等離子體源，其能夠在大氣壓下產(chǎn)生一股溫度在25-40℃之間、并具有高活性離子濃度的等離子體射流。等離子體中的活性粒子可改變微生物的細(xì)胞壁及膜的通透性，引起相應(yīng)基因損傷，從而使微生物的基因簇及代謝發(fā)生顯著變化，最終致使基因發(fā)生突變。artp具有成本低、無(wú)化學(xué)污染、高安全性以及高突變率的優(yōu)點(diǎn)；
2）第二次137csy誘變：再次用137csy進(jìn)行誘變，再利用瓊脂塊法初篩，搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其效價(jià)，得到正向誘變株g-11、h-7和i-17，凍干管保存；
3）第一輪原生質(zhì)體融合：將高產(chǎn)菌株b-1、f-2、f-28、g-11、h-7和i-17分別在種子活化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，收集菌絲體，加入溶菌酶，得到的六種原生質(zhì)體，將其作為親本進(jìn)行原生質(zhì)體融合，在利福平濃度為310mg/l的抗性平板上進(jìn)行初篩，再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其效價(jià)，得到融合株g1-4、g1-6、g1-20和g1-31，再生培養(yǎng)，凍干管保存。再生平板使用前需在37℃的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一天，或是在65℃的烘箱中烘30min，以保證固體培養(yǎng)基表面的水分能夠充分蒸發(fā)，從而減少由于再生培養(yǎng)基表面的冷凝水所引起的原生質(zhì)體破裂。原生質(zhì)體融合技術(shù)不僅能夠打破有性雜交重組基因以創(chuàng)造新種的界限，更重要的是能夠擴(kuò)大遺傳物質(zhì)的重組范圍，能夠?qū)⒍喾N正向突變?nèi)诤?，得到集多種正向突變于一體的融合菌株；
4）第三次137csy誘變：對(duì)第一次融合的效價(jià)最高的菌種g1-6再次137csy誘變，再利用瓊脂塊法初篩，再進(jìn)行搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，測(cè)其效價(jià)，得到正向誘變株y4、y13和y32，凍干管保存；
5）第二輪原生質(zhì)體融合：將效價(jià)提高的誘變株y4、y13和y32重復(fù)第三步，抗性平板上利福平含量為520mg/l，得到融合株g2-10和g2-31，測(cè)其效價(jià)，將融合株g2-31保藏，保藏號(hào)為cgmcc13119。隨著原生質(zhì)體的逐漸融合，篩選菌株的利福平抗性壓力增大，在淘汰親本的同時(shí)減輕了初篩的工作量；將融合株g2-31五次傳代性能穩(wěn)定，其正突變率成明顯上升趨勢(shì)；基因組重排技術(shù)是將分子進(jìn)化的對(duì)象定向?yàn)檎麄€(gè)基因組而非單個(gè)基因，從而可以更為廣泛的對(duì)菌株的目的性狀進(jìn)行優(yōu)化組合。此技術(shù)的最大優(yōu)點(diǎn)就是不必了解菌株的遺傳背景而只是從細(xì)胞水平上進(jìn)行定向優(yōu)化。使用基因組重排技術(shù)，能夠快速實(shí)現(xiàn)鏈霉菌基因的突變和篩選，得到的融合株g2-31阿維拉霉素的產(chǎn)率高。
鏈霉菌活化培養(yǎng)基的成份及其含量為：可溶性淀粉20g/l、mgso4·6h2o0.5g/l、kno31.0g/l、k2hpo40.5g/l、feso4·7h2o0.01g/l、nacl0.5g/l、agar20g/l，ph為7.2~7.4。上述活化培養(yǎng)基能使處于凍干狀態(tài)的鏈霉菌迅速活化，恢復(fù)生長(zhǎng)活力并且進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，菌數(shù)擴(kuò)增，得到足夠下一步操作的數(shù)量。
再生培養(yǎng)基的配置為：在四個(gè)錐形瓶中分別都裝有蔗糖10.3%、葡萄糖1.0%、蛋白胨0.01%、酵母浸出粉0.5%、烏索酸0.00002%、kh2po40.025%、mgcl2·6h2o1.12%、微量元素溶液0.2ml/100ml、tes1.0ml/100ml、海藻酸鈉0.0001%和瓊脂2.0%，再分別加入單獨(dú)滅菌的k2h2po4（0.5%）、cacl2·2h2o（2.5n）和naoh（1.0n）3ml，2.4ml和2.1ml。上述培養(yǎng)基不僅能穩(wěn)定滲透壓，保護(hù)原生質(zhì)體不會(huì)因吸水過(guò)多漲破或因失水而失去活性，又能提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，加快細(xì)胞壁的合成，相比于現(xiàn)有技術(shù)，上述再生培養(yǎng)基能使細(xì)胞壁合成的速度加快，菌株活性強(qiáng)。
步驟3和5中活化培養(yǎng)基為上述活化培養(yǎng)基中加入0.5%甘氨酸。
鏈霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基成份及其含量為：可溶性淀粉20.0g/l、豆粕粉20.0g/l、d-木糖7.812g/l、l-纈氨酸2.34g/l、大豆蛋白胨5.0g/l、mgso40.5g/l、mncl20.5g/l、caco30.5g/l，ph為7.2~7.4。上述培養(yǎng)基能提供鏈霉菌發(fā)酵所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使其分泌產(chǎn)生阿維拉霉素，通過(guò)測(cè)定每株菌株產(chǎn)生阿維拉霉素的量來(lái)對(duì)菌株進(jìn)行篩選。
牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基成份及其含量為：牛肉膏3.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl5.0g/l、瓊脂20.0g/l，ph為7.0~7.2。
牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基成份及其含量為：牛肉膏3.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl5.0g/l、瓊脂10.0g/l，ph為7.0~7.2。
牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基成份及其含量為：牛肉膏3.0g/l、蛋白胨10.0g/l、nacl5.0g/l，ph為7.0~7.2。
微量元素溶液成份及其重量份為：zncl20.0003~0.0005份、fecl3·6h2o0.001~0.003份、cacl2·2h2o0.0001~0.0003份、mncl2·4h2o0.0001~0.0003份、nbb4o7·10h2o0.0001~0.0003份、(nh4)6m7o24·4h2o0.0001~0.0003份和10份蒸餾水。
高滲溶液（pb液）的配置：蔗糖10.3g、k2so40.025g、mgcl2·6h2o0.202g、微量元素0.2ml，用去離子水定容到88ml，滅菌；再加入單獨(dú)滅菌的kh2po4（0.5%）、cacl2·2h2o（2.5n）、tes各10.0ml、1.0ml和10.0ml。
tes緩沖液：tris-hcl（ph8.0）10mmol/l、edta1mmol/l和sds0.1mmol/l。
酶溶液：0.2g溶菌酶溶解在100mlpb液中，配成濃度為0.2%的酶溶液。
單孢子懸液的制備：新鮮的孢子斜面中加入5ml的無(wú)菌生理鹽水，用接種棒將孢子刮下，裝入無(wú)菌離心管中，再用5ml無(wú)菌生理鹽水斜面一次，并轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管，用無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，得單孢子懸液，并計(jì)數(shù)為107。
菌種培養(yǎng)：
a1.用無(wú)菌生理鹽水從新鮮的斜面上將孢子洗下，接種于裝有100ml種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中(含有0.5g甘氨酸)，28℃，220rpm下震蕩培養(yǎng)48~54h；
b1.用顯微鏡觀察是否染菌；
c1.移取5ml上述種子液到10ml的無(wú)菌離心管中，6000rpm，10min。離心棄去上清液，收集菌絲體。加入5ml無(wú)菌水，振蕩均勻后倒入到裝有一定量玻璃碎片和10ml蒸餾水的100ml滅菌三角瓶中，在220rpm，震蕩30min，使成團(tuán)的菌絲體打碎分散開(kāi)。
d1.震蕩結(jié)束后，吸取5ml的菌液到10ml無(wú)菌離心管中，6000rpm離心10min，棄去上清液；
e1.在上述10ml離心管中加入5mlpb液，用移液槍吹吸均勻，洗滌菌絲體，離心棄上清，重復(fù)一次，然后將菌絲體懸浮于5mlpb液中，按下述步驟進(jìn)行原生質(zhì)體的制備。
原生質(zhì)體制備：
a2.將上述制備得到的菌絲體在6000rpm離心10min，棄去上清液；
b2.在上述離心管中加入5ml0.2%(g/ml)的溶菌酶，用移液槍吹均勻，于35℃的水浴中酶解2h，每隔10min輕輕震蕩一次，使菌體充分懸浮在酶液中。原生質(zhì)體的形成情況可用顯微鏡跟蹤觀察。酶解結(jié)束后，再用移液槍吹吸幾次，以使形成的原生質(zhì)體從菌絲體中釋放出來(lái)；
c1.用帶有脫脂棉的一次性針筒過(guò)濾酶解液，收集濾液。在2000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min，溫和的沉淀原生質(zhì)體，去除酶液；
d2.用5mlpb液洗滌原生質(zhì)體一次，以洗凈酶液；
e2.離心棄去上清液，然后用5mlpb液重新懸浮原生質(zhì)體，用移液槍吹吸均勻;再用pb液稀釋一定濃度，在血球計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)原生質(zhì)體；
f2.用pb液配制成約107個(gè)/ml的原生質(zhì)體溶液。
原生質(zhì)體融合：
a3.將不同菌株的原生質(zhì)體懸液各取1ml于5ml的無(wú)菌離心管中，1500rpm，15min，離心棄去上清液；
b3.加入40%的聚乙二醇(peg6000)，用移液槍吹吸均勻，懸浮原生質(zhì)體，盡可能讓助融劑peg把原生質(zhì)體包裹起來(lái)，25℃放置20min；
c3.2500rpm，10min，離心使原生質(zhì)體沉淀，棄去上清液。再用pb液洗滌一次，1500rpm離心15min，棄去上清液；
d3.加入5mlpb液懸浮原生質(zhì)體，適當(dāng)稀釋后吸取0.1ml懸液涂布于再生平板上；在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6~7d。
原生質(zhì)體再生：
a4.取經(jīng)過(guò)適當(dāng)稀釋后的原生質(zhì)體懸液0.1ml于加有利福平的再生平板上(再生平板使用前需在37℃的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)一天，或是在65℃的烘箱中烘30min，以保證固體培養(yǎng)基表面的水分能夠充分蒸發(fā)，從而減少由于再生培養(yǎng)基表面的冷凝水所引起的原生質(zhì)體破裂)；
b4.將涂布好的培養(yǎng)皿倒置于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6~7d，觀察再生結(jié)果。待再生雙層平板上長(zhǎng)出菌落，再經(jīng)過(guò)初篩、復(fù)篩測(cè)定其阿維拉霉素發(fā)酵效價(jià)，篩選出的高產(chǎn)菌株作為下一輪融合的出發(fā)菌株。
瓊脂塊初篩：稀釋涂布后的平板28℃培養(yǎng)3d后，用滅過(guò)菌的孔徑為8mm的打孔器將單個(gè)菌落打下，打下之后再置于無(wú)菌的恒濕的小室中培養(yǎng)4d，然后將其放置于含有2%的指示菌的瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)18~24h后測(cè)定抑菌圈大小，以出發(fā)菌株為對(duì)照，挑出抑菌圈比較大的菌株擴(kuò)培并搖瓶復(fù)篩。
生測(cè)法檢測(cè)阿維拉霉素產(chǎn)量：
將滅菌后的牛肉膏蛋白陳固體培養(yǎng)基倒入己滅菌的平皿中(每個(gè)平皿15ml左右)，室溫下自然凝固，作為平板的下層；
指示菌microccusluteus在液體培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)至od0.3(紫外檢測(cè)波長(zhǎng)600nm)左右備用，將滅菌后的牛肉膏蛋白胨半固體培養(yǎng)基冷卻到45℃左右，按2%的體積比向培養(yǎng)基中加入microccusluteus的培養(yǎng)液，混勻，然后吸取5ml加到已凝固的下層培養(yǎng)基上，自然凝固，作為平板的上層；
用無(wú)菌鑷子夾取內(nèi)徑6.0mm，外徑為8.0mm，高為10.0mm的牛津杯放在上層培養(yǎng)基表面。加入150μl樣品，常溫下靜置2h，使樣品擴(kuò)散(由于阿維拉霉素分子量較大，其在培養(yǎng)基中的擴(kuò)散速度比較慢，如果加樣后立即放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，容易引起測(cè)定的結(jié)果偏低，因此根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，點(diǎn)樣后必須先進(jìn)行擴(kuò)散)，37℃培養(yǎng)20h，測(cè)量抑菌圈直徑的大??；
此曲線公式為lgy=0.003x2一0.2347其中r2=0.9995
y:效價(jià)(mg/l)
x:直徑(mm)
配制一定濃度梯度的阿維拉霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。每個(gè)平板上放6個(gè)牛津杯，間隔加入150μl500mg/l的標(biāo)準(zhǔn)液。所有平板上由500mg/l標(biāo)準(zhǔn)液所得抑菌圈直徑的平均值與每個(gè)梯度中500mg/l的標(biāo)準(zhǔn)液所得抑菌圈直徑的平均值的差為各梯度的校正值。以標(biāo)準(zhǔn)液濃度的對(duì)數(shù)(mg/l)為縱坐標(biāo)，各梯度抑菌圈直徑校正值的平方(mm2)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)液有5個(gè)梯度，每個(gè)梯度3個(gè)平行；
將發(fā)酵液與甲醇等體積混勻，37℃放置2h，4000rpm離心15min后，取上清液做效價(jià)測(cè)定；
每個(gè)平板上都取一個(gè)牛津杯加入同一濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，之后求出其抑菌圈直徑的平均值。將每個(gè)平板上標(biāo)準(zhǔn)液的抑菌圈直徑與平均值相比，會(huì)得到一個(gè)校正數(shù)。將各個(gè)平板的校正數(shù)與發(fā)酵液的抑菌圈直徑進(jìn)行比較校正，所得的校正值經(jīng)過(guò)在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度即可作為所測(cè)定發(fā)酵液的效價(jià)。
最后得到的g2-31的抑菌圈直徑達(dá)到28.79mm（對(duì)應(yīng)效價(jià)為2842.57mg/l），比原始菌株（效價(jià)為710mg/l）提高了300%。
本發(fā)明的操作步驟中的常規(guī)操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，在此不進(jìn)行贅述。
以上所述的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，應(yīng)理解的是以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的原則范圍內(nèi)所做的任何修改、補(bǔ)充或類(lèi)似方式替代等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。