本發(fā)明涉及微生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種曲霉菌及其在制備肺念菌素b0(pneumocandinb0)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：卡泊芬凈(caspofungin)由默克公司開(kāi)發(fā)，商品名科賽斯(cancidas)，結(jié)構(gòu)式如下式1所示，2001年首次在美國(guó)上市，已在70多個(gè)國(guó)家被廣泛使用。目前，該產(chǎn)品已成為全身用抗真菌藥市場(chǎng)的王牌藥物。卡泊芬凈是葡聚糖合成酶抑制劑(該酶在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞內(nèi)沒(méi)發(fā)現(xiàn)，是許多致病性真菌合成細(xì)胞壁主要部分所需要的酶)。該酶可催化轉(zhuǎn)運(yùn)尿苷二磷酸中的葡聚糖基生成β-1，3-d-葡聚糖。β-1，3-d-葡聚糖合成酶為真菌生長(zhǎng)所必需，抑制該酶可使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)異常，致使細(xì)胞破壞，細(xì)胞內(nèi)容物滲漏?？ú捶覂艟哂袕V譜抗真菌活性，可以治療對(duì)氟康唑耐藥的念珠菌屬、曲霉菌屬和某些地方性真菌病，對(duì)卡式肺囊蟲(chóng)病等有效，通過(guò)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制的真菌細(xì)胞壁內(nèi)的β-1，3-d-葡聚糖合成酶的活性，進(jìn)而引起真菌細(xì)胞壁的裂解以及細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的改變從而將真菌細(xì)胞徹底殺死。肺念菌素b0(pneumocandinb0)是合成卡泊芬凈的原料，是一類(lèi)由glarealozoyensis產(chǎn)生的天然抗真菌脂肽類(lèi)抗生素，glarealozoyensis除能產(chǎn)生a0和b0兩種主要產(chǎn)物外，還能產(chǎn)生c0、d0、e0、b1、和b2等16種類(lèi)似物，不同氨基酸側(cè)鏈修飾或氨基酸連接順序的不同導(dǎo)致了肺念菌素類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)多樣性。目前已知的肺念菌素類(lèi)化合物及其類(lèi)似物的結(jié)構(gòu)如下式2和下表1所示：表1肺念菌素類(lèi)化合物的取代基pneumocandinr1r2r3r4r5r6r7a0ch3ohohohch3ohohb0hohohohch3ohohc0ohhohohch3ohohd0ohohohohch3ohohe0hhohohch3ohoha1ch3ohohohch3hoha2ch3ohhhch3ohoha3ch3ohohhch3hha4ch3ohhhch3hhb1hohohohch3hohb2hohhhch3ohohb5hohohhch3ohohb6hohhohch3ohohd2ohohhhch3ohohb0serineanaloguehohohohhohohb5serineanaloguehohohhhohoh秦婷婷等在中國(guó)抗生素雜志2016年3月第41卷第3期(原生質(zhì)體誘變篩選高產(chǎn)紐莫康定b0的菌株)報(bào)道了默克公司經(jīng)過(guò)亞硝基胍誘變選育出肺念菌素b0產(chǎn)生菌atcc74030的來(lái)源，發(fā)酵效價(jià)為241μg/ml，經(jīng)過(guò)碳源優(yōu)化將甘露醇作為碳源的條件下，肺念菌素b0效價(jià)達(dá)到800μg/ml。再經(jīng)過(guò)原生質(zhì)體的制備和再生，采用常壓室溫等離子體(artp)誘變篩選出肺念菌素b0高產(chǎn)菌株，效價(jià)為1130μg/ml。wo00/08197公開(kāi)了菌株atcc74030發(fā)酵制備肺念菌素b0時(shí)，以125g/l果糖為碳源，通過(guò)添加氨基酸和微量元素來(lái)降低雜質(zhì)的方法，其中添加15g/l脯氨酸可以將肺念菌素c0降低到4.4％，但肺念菌素e0增加到2.7％，添加微量元素鋅使肺念菌素b0絲氨酸類(lèi)似物及b5含量分別降低了1％，但是肺念菌素e0含量增加了一倍且肺念菌素b0效價(jià)降低了50％，添加微量元素鈷可以使肺念菌素e0含量從2.2％降低到1.8％，但是肺念菌素b0絲氨酸類(lèi)似物及b5含量增加一倍且肺念菌素b0效價(jià)降低了25％，且在發(fā)酵過(guò)程中添加氨基酸和微量元素，增加了生產(chǎn)成本。即便通過(guò)大體積的硅膠柱可以有效分離肺念菌素b0的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，但在菌種水平提高肺念菌素b0的效價(jià)并同時(shí)降低副產(chǎn)物的含量，從而降低下游分離的成本很有必要，因此，尋找一種新的、高效的、副產(chǎn)物低的、易于提取的肺念菌素b0(pneumocandinb0)的生產(chǎn)菌種的工作仍然在繼續(xù)進(jìn)行中。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供一種新的菌株glarealozoyensishs-2158其保藏編號(hào)為cgmccno.13367。本發(fā)明的目的還在于提供的菌株hs-2158在制備肺念菌素b0或其類(lèi)似物中的應(yīng)用，所述類(lèi)似物為肺念菌素a0，c0，d0，e0，a1，a2，a3，a4，b1，b2，b5，b6，d2，b0絲氨酸類(lèi)似物，b5絲氨酸類(lèi)似物，優(yōu)選為肺念菌素c0、b5、e0、b0絲氨酸類(lèi)似物。本發(fā)明還提供了一種采用菌株hs-2158制備肺念菌素b0的方法。該方法包括將菌株hs-2158在固體培養(yǎng)基進(jìn)行菌落培養(yǎng)，然后在種子培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)，再接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述菌落培養(yǎng)的時(shí)間為5～15天，優(yōu)選7～12天；所述種子培養(yǎng)的時(shí)間為24～120小時(shí)，優(yōu)選48～100小時(shí)；所述種子培養(yǎng)的溫度為20～30℃，優(yōu)選22～28℃。所述發(fā)酵培養(yǎng)的時(shí)間為96～360小時(shí)，優(yōu)選216-340小時(shí)；所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為20～30℃，優(yōu)選22～28℃。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的種子培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的濃度為：碳源5.0～70.0g/l，氮源5.0～60.0g/l，無(wú)機(jī)鹽0～5.5g/l，所述的種子培養(yǎng)基的ph為5.0～7.0；和/或發(fā)酵培養(yǎng)基各組分在培養(yǎng)基中的濃度為：碳源5.0～170.0g/l，氮源5.0～65.0g/l，無(wú)機(jī)鹽0～21.0g/l，氨基酸5.0～30.0g/l，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為5.0～7.5；在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的種子培養(yǎng)基的碳源選自葡萄糖、玉米淀粉、乳糖、麥芽糊精中的一種或幾種，所述的種子培養(yǎng)基的氮源選自黃豆餅粉、棉籽餅粉、蛋白胨、花生餅粉、玉米漿干粉中的一種或幾種，所述的種子培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽選自硝酸鈉，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硝酸鉀、硫酸銨、碳酸鈣、硫酸鋅中的一種或幾種；和/或所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源選自葡萄糖、乳糖、果糖、甘露醇、山梨醇、麥芽糊精、玉米淀粉、豆油、油酸甲酯中的一種或幾種，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源選自酵母抽提粉、酵母粉、牛肉浸膏、大豆蛋白胨、蛋白胨、黃豆餅粉、棉籽餅粉、花生餅粉、麩質(zhì)粉、玉米漿干粉、麩皮中的一種或幾種，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的無(wú)機(jī)鹽選自氯化銨、硝酸銨，磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸銨、碳酸鈣、硫酸亞鐵、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、硫酸鎂、氯化鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅中的一種或幾種，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的氨基酸選自l-酪氨酸、l-脯氨酸、l-蘇氨酸、l-鳥(niǎo)氨酸鹽酸鹽、l-纈氨酸、l-精氨酸中的一種或幾種。優(yōu)選的，所述的種子培養(yǎng)基含有玉米淀粉5.0～20.0g/l、葡萄糖10.0～50.0g/l、黃豆餅粉10.0～30.0g/l、蛋白胨5.0～15.0g/l、花生餅粉5.0～15.0g/l、磷酸二氫鉀0.5～2.0g/l、硫酸銨0.5～1.5g/l、碳酸鈣0.5～2.0g/l，所述的種子培養(yǎng)基的ph為6.0～7.0；和/或所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有山梨醇90.0～150.0g/l、葡萄糖5.0～50.0g/l、黃豆餅粉5.0～20.0g/l、蛋白胨5.0～15.0g/l、棉籽餅粉10.0～30.0g/l、磷酸二氫鉀1.0～7.0g/l、硫酸銨0.5～4.0g/l、氯化鈣0.5～5.0g/l、硫酸鋅0.8～5.0g/l、l-脯氨酸5.0～30.0g/l，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為5.0～7.0。更優(yōu)選的，所述的種子培養(yǎng)基含有玉米淀粉10.0g/l、葡萄糖30.0g/l、黃豆餅粉20.0g/l、蛋白胨8.0g/l、花生餅粉10.0g/l、磷酸二氫鉀1.0g/l、硫酸銨0.8g/l、碳酸鈣1.0g/l，所述的種子培養(yǎng)基的ph為6.5；和/或所述的發(fā)酵培養(yǎng)基含有山梨醇100.0g/l、葡萄糖5.0g/l、黃豆餅粉20.0g/l、蛋白胨5.0g/l、棉籽餅粉30.0g/l、磷酸二氫鉀5.0g/l、硫酸銨3.0g/l、氯化鈣4.0g/l、硫酸鋅1.0g/l、l-脯氨酸15.0g/l，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的ph為7.0。肺念菌素b0及其類(lèi)似物可以通過(guò)以下條件進(jìn)行液相(hplc)檢測(cè)：a、肺念菌素b0、b5、e0、b0絲氨酸類(lèi)似物的高效液相分析方法：色譜柱：ods柱4.6mm×250mm，柱溫：40℃；流動(dòng)相∶乙腈∶水＝60∶40(體積比)，流速：1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm，進(jìn)樣量：10μl；b、肺念菌素b0與c0的高效液相分析方法：色譜柱：硅柱4.6mm×250mm；流動(dòng)相∶正己烷∶甲醇∶水＝70∶30∶2(體積比)，流速：1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm，進(jìn)樣量：10μl。備注：進(jìn)行hplc檢測(cè)時(shí)，首先通過(guò)檢測(cè)方法a檢測(cè)肺念菌素b0、b5、e0、b0絲氨酸類(lèi)似物的效價(jià)，然后通過(guò)檢測(cè)方法b得到肺念菌素b0與c0的比值，再以檢測(cè)方法a中肺念菌素b0的效價(jià)計(jì)算肺念菌素c0的效價(jià)。本發(fā)明所述粘度可以在下述條件下進(jìn)行檢測(cè)，儀器：brookfield，轉(zhuǎn)子：16s，轉(zhuǎn)速：30rpm。本發(fā)明菌株hs-2158與現(xiàn)有技術(shù)中肺念菌素b0的產(chǎn)生菌相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：①本發(fā)明菌株hs-2158產(chǎn)生肺念菌素b0的發(fā)酵單位高，且能穩(wěn)定生產(chǎn)肺念菌素b0。②本發(fā)明菌株hs-2158降低了肺念菌素c0、e0、b5、b0絲氨酸類(lèi)似物等副產(chǎn)物占肺念菌素b0的百分比含量，降低了肺念菌素b0的提取和分離難度，有利于得到高純度的肺念菌素b0。③現(xiàn)有技術(shù)中披露了肺念菌素b0產(chǎn)生菌的發(fā)酵碳源為果糖或甘露醇，而本發(fā)明菌株hs-2158能很好的利用山梨醇，可以在以山梨醇為主要碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，且肺念菌素b0的效價(jià)最高可達(dá)到7625μg/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于已知的其他產(chǎn)生菌，培養(yǎng)后得到的發(fā)酵液粘度低，降低了發(fā)酵產(chǎn)物的提純難度。④現(xiàn)有技術(shù)中披露了通過(guò)添加脯氨酸、蘇氨酸、微量元素鋅、鎳等來(lái)分別降低某些雜質(zhì)，而本發(fā)明菌株hs-2158可以同時(shí)降低肺念菌素c0、e0、b5、b0絲氨酸類(lèi)似物等副產(chǎn)物占肺念菌素b0的百分比含量。⑤本發(fā)明菌株hs-2158的遺傳穩(wěn)定性好，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。本發(fā)明所采用的肺念菌素b0產(chǎn)生菌為glarealozoyensishs-2158(cgmccno.13367)。本發(fā)明菌株hs-2158(cgmccno.13367)的微生物菌種于2017年01月09日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為cgmccno.13367，分類(lèi)命名為glarealozoyensis，并登記入冊(cè)，證明存活。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中調(diào)節(jié)培養(yǎng)基料液ph值所采用的試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)使用的naoh溶液或鹽酸。下述實(shí)施例中固體培養(yǎng)基采用去離子水定容，種子及發(fā)酵培養(yǎng)基采用自來(lái)水進(jìn)行定容，各培養(yǎng)基按所述配方稱取原料，將各原料進(jìn)行充分混合，再加水至所需體積，最后通過(guò)naoh溶液或鹽酸調(diào)節(jié)至所需ph值。實(shí)施例1菌株來(lái)源本發(fā)明菌株hs-2158系從浙江新安江中分離得到的原始菌株，再通過(guò)誘變得到的突變菌株。原始菌株在pda斜面培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)13天后，在無(wú)菌條件下用接種鏟將菌絲體刮下，在磨口試管中磨碎菌絲體并懸浮于無(wú)菌水中，制得菌懸液，供ntg(亞硝基胍)誘變處理。稱取ntg晶體5mg，溶解在5ml無(wú)菌tris緩沖液(ph8.0)中，用移液管吸取3mlntg溶液加入到2ml菌懸液，置于25℃培養(yǎng)基中旋轉(zhuǎn)式或往復(fù)式搖床上振蕩處理30min。余下的具體步驟如下：(1)菌絲體的制備與培養(yǎng)pda固體培養(yǎng)基，121℃滅菌30分鐘，冷卻到50-60℃倒入平板，將處理過(guò)的菌懸液經(jīng)適當(dāng)稀釋，吸取0.1ml菌懸液涂布于pda平板上，未作誘變處理的菌懸液亦經(jīng)適當(dāng)稀釋涂布于pda平板作為對(duì)照，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，菌落培養(yǎng)13天后，菌絲成熟。(2)種子液的制備與培養(yǎng)種子培養(yǎng)基配方(g/l)：玉米淀粉10.0、葡萄糖30.0、黃豆餅粉20.0、蛋白胨8.0、花生餅粉10.0、磷酸二氫鉀1.0、硫酸銨0.8、碳酸鈣1.0，ph6.5，搖瓶裝液量為20ml/250ml，121℃滅菌30分鐘。每個(gè)種子搖瓶接入0.5個(gè)菌落左右為宜，培養(yǎng)溫度22～28℃，培養(yǎng)濕度40～60％，搖瓶機(jī)振幅5cm，轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)周期88小時(shí)。(3)肺念菌素b0發(fā)酵培養(yǎng)基的制備與培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基配方ⅰ(g/l)：麥芽糊精100.0、葡萄糖5.0、黃豆餅粉20.0、蛋白胨5.0、棉籽餅粉30.0、磷酸二氫鉀5.0、硫酸銨3.0、氯化鈣4.0、硫酸鋅1.0、l-脯氨酸15.0；ph7.0，搖瓶裝液量為30ml/250ml，121℃滅菌30分鐘。將種子液以10％(體積百分比)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度22～28℃，培養(yǎng)濕度40～60％，搖瓶機(jī)振幅5cm，轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)周期239小時(shí)。挑選經(jīng)過(guò)ntg誘變后的單菌落1000株，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，hplc檢測(cè)肺念菌素b0的產(chǎn)量。篩選出產(chǎn)肺念菌素b0最高產(chǎn)的突變菌株即菌株hs-2158。其主要生物學(xué)特征為：成熟時(shí)的菌落呈黑綠色，并產(chǎn)黃綠色孢子，高聳扎實(shí)，菌落圓形稍不規(guī)則，直徑0.8-1.2cm，無(wú)水溶性色素產(chǎn)生。實(shí)施例2菌種鑒定參照《普通真菌學(xué)》、《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》、《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》及《中國(guó)藥典》(2005版xih)等書(shū)中的有關(guān)內(nèi)容進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.培養(yǎng)特征：采用isp1、isp2、isp3、isp4、isp5、查氏、pda、蘋(píng)果酸鈣、營(yíng)養(yǎng)和高氏一號(hào)培養(yǎng)基10種培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7～10天后，觀察菌絲體的顏色及色素情況。菌株的培養(yǎng)特征見(jiàn)表3。表3菌株hs-2158(cgmccno.13367)在10種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況基質(zhì)菌絲氣生菌絲可溶色素isp12橄欖綠色白色無(wú)isp24橄欖綠色黃綠色無(wú)isp34橄欖綠色黃綠色無(wú)isp41黃綠色白色無(wú)isp51淡粉色淡粉色無(wú)查氏2褐綠色白色無(wú)pda4橄欖綠色黃綠色無(wú)蘋(píng)果酸鈣3黑綠色白色無(wú)營(yíng)養(yǎng)3棕黑色褐色無(wú)高氏一號(hào)1褐綠色白色無(wú)2.生理生化試驗(yàn)：除溫度實(shí)驗(yàn)外，均為28℃培養(yǎng)5～7天。a)碳源的利用：采用isp9作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，各種碳源的終濃度均為1.0％，見(jiàn)表4。b)無(wú)機(jī)氮源的利用：采用isp9作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，硝酸鉀和硫酸銨的濃度均為1.0％，見(jiàn)表4。c)降解試驗(yàn)和nacl耐受實(shí)驗(yàn)采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基為gyea(ph6.0)，降解試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，nacl耐受實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。d)氧化酶和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、ph試驗(yàn)和溫度試驗(yàn)均采用pda培養(yǎng)基。氧化酶和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表7，ph試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8，溫度試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9.e)m.r、v.p實(shí)驗(yàn)：采用《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》方法。其結(jié)果見(jiàn)表7.生理生化特征：見(jiàn)表4～表9。表4菌株hs-2158(cgmccno.13367)的碳源和氮源的利用情況表5菌株hs-2158(cgmccno.13367)的降解試驗(yàn)結(jié)果降解物降解物濃度結(jié)果＊降解物降解物濃度結(jié)果腺嘌呤0.5％3，-酪蛋白1.0％4，-鳥(niǎo)嘌呤0.5％3，-酪氨酸1.0％3，-黃嘌呤0.4％3，-tween-401.0％4，-次黃嘌呤0.4％2，-tween-601.0％3，-木聚糖0.4％3，-tween-801.0％2，-表6菌株hs-2158(cgmccno.13367)對(duì)nacl的耐受性nacl濃度1％4％7％10％菌株生長(zhǎng)情況3100表7菌株hs-2158(cgmccno.13367)主要的生理生化特征試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果試驗(yàn)項(xiàng)目結(jié)果明膠液化+硫化氫產(chǎn)生-過(guò)氧化氫酶-淀粉水解-v.p實(shí)驗(yàn)-氧化酶-牛奶凝固-m.r實(shí)驗(yàn)-牛奶胨化-硝酸鹽還原+表8菌株hs-2158(cgmccno.13367)生長(zhǎng)的ph試驗(yàn)ph3.03.54.04.55.05.56.06.57.07.5生長(zhǎng)情況3333444444表9菌株hs-2158(cgmccno.13367)生長(zhǎng)的溫度試驗(yàn)溫度(℃)714283745生長(zhǎng)情況02431*注：表3-9中：0，無(wú)生長(zhǎng)；1，生長(zhǎng)很弱；2，能生長(zhǎng)，有少量孢子；3，生長(zhǎng)良好，有大量孢子；4，生長(zhǎng)最好，有豐富孢子；+，陽(yáng)性；-，陰性。3.26srdna序列分析：收集pda培養(yǎng)的新鮮菌體，采用液氮破壁方法提取總dna模板，采用fungiidentificationpcrkit(takara)進(jìn)行26srdna基因d1/d2區(qū)域擴(kuò)增，pcr產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)后，直接進(jìn)行序列測(cè)定，pcr產(chǎn)物的純化與測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行。菌株hs-2158(cgmccno.13367)所測(cè)的26srdna基因d1/d2區(qū)域序列經(jīng)校對(duì)后，與genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種、屬的序列進(jìn)行同源序列blast比較，以確定該菌株的分類(lèi)地位。hs-2158(cgmccno.13367)的26srdnad1/d2序列(見(jiàn)序列表)與genbank中相關(guān)序列進(jìn)行blast比較，結(jié)果見(jiàn)表10(表中只列出同源性較高的菌株)。表10菌株hs-2158(cgmccno.13367)和相關(guān)菌株的同源性通過(guò)對(duì)菌株hs-2158(cgmccno.13367)26srdnad1/d2區(qū)域測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其和曲霉菌(glarealozoyensis)有很高同源性，最高的達(dá)99％，同時(shí)對(duì)菌株hs-2158(cgmccno.13367)進(jìn)行表觀特征試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株和曲霉菌(glarealozoyensis)分類(lèi)相關(guān)參數(shù)非常接近，故將菌株hs-2158(cgmccno.13367)鑒定為曲霉菌(glarealozoyensis)的菌株。實(shí)施例3菌株hs-2158(cgmccno.13367)在發(fā)酵培養(yǎng)基主要碳源為山梨醇和麥芽糊精時(shí)的發(fā)酵工藝研究(1)pda固體培養(yǎng)基，121℃滅菌30分鐘，冷卻到50-60℃倒入平板，接入0.1ml菌懸液培養(yǎng)13d后，菌絲成熟。(2)種子培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件等同實(shí)施例1中步驟(2)，培養(yǎng)周期87小時(shí)。(3)肺念菌素b0發(fā)酵培養(yǎng)基的制備與培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基配方ⅰ等同實(shí)施例1中步驟(3)；發(fā)酵培養(yǎng)基配方ⅱ(g/l)：山梨醇50.0、麥芽糊精50.0、葡萄糖5.0、黃豆餅粉20.0、蛋白胨5.0、棉籽餅粉30.0、磷酸二氫鉀5.0、硫酸銨3.0、氯化鈣4.0、硫酸鋅1.0g、l-脯氨酸15.0，ph7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基配方ⅲ(g/l)：山梨醇100.0、葡萄糖5.0、黃豆餅粉20.0、蛋白胨5.0、棉籽餅粉30.0、磷酸二氫鉀5.0、硫酸銨3.0、氯化鈣4.0、硫酸鋅1.0g、l-脯氨酸15.0，ph7.0。搖瓶裝液量均為30ml/250ml，121℃滅菌30分鐘。將種子液以10％(體積百分比)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度22～28℃，培養(yǎng)濕度40～60％，搖瓶機(jī)振幅5cm，轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)周期240小時(shí)。粘度及hplc檢測(cè)，三組發(fā)酵的結(jié)果見(jiàn)表11。表11hs-2158(cgmccno.13367)在不同發(fā)酵配方時(shí)的發(fā)酵結(jié)果fmⅰ：發(fā)酵培養(yǎng)基配方ⅰfmⅱ：發(fā)酵培養(yǎng)基配方ⅱfmⅲ：發(fā)酵培養(yǎng)基配方ⅲ由表可知，發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為麥芽糊精或山梨醇時(shí)，菌株hs-2158產(chǎn)肺念菌素b0的效價(jià)均比較高，其中碳源優(yōu)選山梨醇，發(fā)酵效價(jià)更高，粘度更低。實(shí)施例4菌株hs-2158(cgmccno.13367)在發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為麥芽糊精和山梨醇時(shí)發(fā)酵工藝研究(1)pda固體培養(yǎng)基，121℃滅菌30分鐘，冷卻到50-60℃倒入平板，接入0.1ml菌懸液培養(yǎng)13d后，菌絲成熟。(2)種子培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件等同實(shí)施例1中步驟(2)，培養(yǎng)周期87小時(shí)。(3)肺念菌素b0發(fā)酵培養(yǎng)基的制備與培養(yǎng)。發(fā)酵培養(yǎng)基配方ⅰ等同實(shí)施例1中步驟(3)；發(fā)酵培養(yǎng)基配方ⅲ(g/l)：山梨醇100.0、葡萄糖5.0、黃豆餅粉20.0、蛋白胨5.0、棉籽餅粉30.0、磷酸二氫鉀5.0、硫酸銨3.0、氯化鈣4.0、硫酸鋅1.0g、l-脯氨酸15.0，ph7.0。搖瓶裝液量均為30ml/250ml，121℃滅菌30分鐘。將種子液以10％(體積百分比)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度22～28℃，培養(yǎng)濕度40～60％，搖瓶機(jī)振幅5cm，轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)周期240小時(shí)。粘度及hplc檢測(cè)，三組發(fā)酵的結(jié)果見(jiàn)表12。表12hs-2158(cgmccno.13367)在fmⅰ和fmⅲ上的發(fā)酵比較結(jié)果fm?。喊l(fā)酵培養(yǎng)基配方ⅰfmⅲ：發(fā)酵培養(yǎng)基配方ⅲ由表可知，無(wú)論發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為山梨醇還是麥芽糊精，本發(fā)明菌株hs-2158產(chǎn)生的肺念菌素c0、e0、b5、b0絲氨酸類(lèi)似物等副產(chǎn)物占肺念菌素b0的百分比含量接近且均較低。與公開(kāi)的專利wo00/08197進(jìn)行比較，該專利具體公開(kāi)了添加15g/l脯氨酸可以將肺念菌素c0降低到4.4％，但肺念菌素e0增加到2.7％，添加微量元素鋅使肺念菌素b0絲氨酸類(lèi)似物及b5含量分別降低了1％(b0絲氨酸類(lèi)似物為1.9％，b5為3.9％)，但是肺念菌素e0含量增加了一倍(肺念菌素e0為4.3％)且肺念菌素b0效價(jià)降低了50％，添加微量元素鈷可以使肺念菌素e0含量從2.2％降低到1.8％，但是肺念菌素b0絲氨酸類(lèi)似物及b5含量增加一倍(肺念菌素b0絲氨酸類(lèi)似物為6.0％，b5為7.2％)且肺念菌素b0效價(jià)降低了25％。通過(guò)比較可知雖然發(fā)酵中都含有脯氨酸，但本專利中的肺念菌素c0的百分含量更低；肺念菌素e0、b5、b0絲氨酸類(lèi)似物等副產(chǎn)物與已公開(kāi)專利工藝相比，其百分含量也都更低；此外，已公開(kāi)專利通過(guò)添加脯氨酸、微量元素鋅、鎳等來(lái)分別降低某些雜質(zhì)，而本發(fā)明菌株hs-2158可以同時(shí)降低肺念菌素c0、e0、b5、b0絲氨酸類(lèi)似物等副產(chǎn)物占肺念菌素b0的百分比含量。實(shí)施例5菌株hs-2158(cgmccno.13367)在發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為不同濃度的山梨醇時(shí)的發(fā)酵工藝研究(1)固體培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件等同實(shí)施例3中步驟(1)(2)種子培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件等同實(shí)施例1中步驟(2)，培養(yǎng)周期87小時(shí)。(3)肺念菌素b0發(fā)酵培養(yǎng)基的制備與培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方ⅳ(g/l)：葡萄糖5.0、黃豆餅粉20.0、蛋白胨5.0、棉籽餅粉30.0、磷酸二氫鉀5.0、硫酸銨3.0、氯化鈣4.0、硫酸鋅1.0、l-脯氨酸15.0。在發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方ⅳ中添加山梨醇，山梨醇濃度分別為90.0g/l、110.0g/l、130.0g/l、150.0g/l，得到四組不同濃度山梨醇的發(fā)酵培養(yǎng)基，ph7.0，搖瓶裝液量為30ml/250ml，121℃滅菌30分鐘。將種子液以10％(體積百分比)的接種量接入這四組不同濃度山梨醇的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度22～28℃，培養(yǎng)濕度40～60％，搖瓶機(jī)振幅5cm，轉(zhuǎn)速250rpm，培養(yǎng)周期分別為240、286小時(shí)。hplc檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表12。表13不同濃度的山梨醇發(fā)酵結(jié)果比較山梨醇濃度(g/l)90.0110.0130.0150.0240小時(shí)hplcb0(μg/ml)5613671161025615286小時(shí)hplcb0(μg/ml)4522719476257013實(shí)施例6菌株hs-2158(cgmccno.13367)在50l發(fā)酵罐上的小試研究(1)種子罐種子液的制備在15l種子罐中投入10l的種子培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基的配比同實(shí)施例1，同時(shí)添加0.05％的ppg作為消泡劑)，滅菌采用蒸汽滅菌，121℃條件下30分鐘，待冷卻后，接入200ml搖瓶種子液，培養(yǎng)溫度22～28℃，攪拌轉(zhuǎn)速100～500rpm，通氣量0.5～1.0vvm，溶氧20～70％，培養(yǎng)86小時(shí)。(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配制與培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方與前述實(shí)施例3中發(fā)酵配方ⅲ相同，但要添加0.05％ppg作為消泡劑，發(fā)酵罐裝量為35l/50l，ph7.0，于121℃下蒸汽滅菌30分鐘，冷卻后，接入約3.5l種子罐培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度22～28℃，攪拌轉(zhuǎn)速200～500rpm，通氣量為0.5～1.0vvm，發(fā)酵培養(yǎng)252小時(shí)，發(fā)酵放罐時(shí)發(fā)酵液進(jìn)行hplc檢測(cè)，測(cè)得肺念菌素b0發(fā)酵效價(jià)為7010μg/ml。c0發(fā)酵效價(jià)156μg/ml，b5發(fā)酵效價(jià)44μg/ml，e0發(fā)酵效價(jià)32μg/ml，b0絲氨酸類(lèi)似物發(fā)酵效價(jià)34μg/ml。實(shí)施例7菌株hs-2158(cgmccno.13367)在5000l發(fā)酵罐上的放大培養(yǎng)(1)種子罐種子液的制備在500l種子罐中投入300l的種子培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基的配比同實(shí)施例1，同時(shí)添加0.05％的ppg作為消泡劑)，滅菌采用蒸汽滅菌，121℃條件下30分鐘，待冷卻后，接入1800ml搖瓶種子液，培養(yǎng)溫度22～28℃，攪拌轉(zhuǎn)速50～200rpm，通氣量0.6～1.2vvm，溶氧30～70％，培養(yǎng)98小時(shí)。(2)發(fā)酵罐培養(yǎng)基的配制與培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)基的配方與前述實(shí)施例3中發(fā)酵配方ⅲ相同，但要添加0.05％ppg作為消泡劑，發(fā)酵罐裝量為3000l/5000l，ph7.0，于121℃下蒸汽滅菌30分鐘，冷卻后，接入約300l種子罐培養(yǎng)液，發(fā)酵溫度22～28℃，攪拌轉(zhuǎn)速300～500rpm，通氣量為0.5～1.5vvm，發(fā)酵培養(yǎng)280小時(shí)，發(fā)酵放罐時(shí)發(fā)酵液進(jìn)行hplc檢測(cè)，測(cè)得肺念菌素b0發(fā)酵效價(jià)為6845μg/ml。c0發(fā)酵效價(jià)138μg/ml，b5發(fā)酵效價(jià)38μg/ml，e0發(fā)酵效價(jià)34μg/ml，b0絲氨酸類(lèi)似物發(fā)酵效價(jià)29μg/ml。雖然以上描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，這些僅是舉例說(shuō)明，在不背離本發(fā)明的原理和實(shí)質(zhì)的前提下，可以對(duì)這些實(shí)施方式做出多種變更或修改，因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍由所附權(quán)利要求書(shū)限定。sequencelisting<110>浙江海正藥業(yè)股份有限公司<120>一種曲霉菌及其生產(chǎn)肺念菌素b0的方法<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>999<212>dna<213>曲霉菌（glarealozoyensis）<400>1ggatctagacggcagtgattccagctcggtaccaccgggatcctctgcgagtgcaccagt60aacagctcaaatttgaaatctggctcttttagggtccgagttgtaatttgtagaagatgc120ttcgggtgtagctccggtctaagttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatccc180gtatgtgactggtggctttcgcccatgtgaagctctttcgacgagtcgagttgtttggga240atgcagctctaaatgggtggtaaatttcatctaaagctaaatattggccagagaccgata300gcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttggaaagagagttaaacagtacg360tgaaattgttgaaagggaagcgcttgcaaccagatttgcaccccgtcgatcatcccccgt420tctcggaggtgcactcggcggggttcaggccagcatcggtttcggtggtgggataaaggc480cttgggaacgtagctcctctcggggagtgttatagccctcggtgcaatgccgcctaccgg540gaccgaggaccgcgcttcggctaggatgctggcgtaatggttgtaagcgacccgtcttga600aacacggacccctgtgtgaaattgttatccgctcaatcgtcgacctgcaggcatgcaagc660ttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattcca720cacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaa780ctcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccag840ctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttcc900gcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagct960cactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggg999當(dāng)前第1頁(yè)12