一株高產(chǎn)曲酸的米曲霉菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株米曲霉菌株及其應(yīng)用，特別是一株高產(chǎn)曲酸的米曲霉菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在人體中，酪氨酸酶能催化酪氨酸與氧自由基經(jīng)復(fù)雜氧化、聚合，最后合成黑色素。曲酸及其衍生物能通過抑制酪氨酸酶的活性而抑制黑色素形成，而且安全無毒，因而在化妝品和食品防腐保鮮等領(lǐng)域具有廣泛的用途。在醫(yī)藥上，曲酸可以作為生產(chǎn)頭孢類抗生素的中間體。同時，可作為合成香料中間體、殺蟲劑原料等，在食品、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工等行業(yè)有廣泛的應(yīng)用前景。許多曲霉如米曲霉、黃曲霉、疏展曲霉、構(gòu)巢曲霉、寄生曲霉、白曲霉、煙曲霉、巨大曲霉、灰綠曲霉等和少數(shù)青霉，如產(chǎn)曲酸青霉等，能代謝產(chǎn)生曲酸。目前，生產(chǎn)中普遍使用的是米曲霉和不產(chǎn)生黃曲霉素的黃曲霉。1998年，周衛(wèi)東等人報道米曲霉2336培養(yǎng)6.5d后產(chǎn)曲酸7.45g/L (周衛(wèi)東，沈育芬，陳移亮，等.曲酸生產(chǎn)菌的誘變選育[J].亞熱帶植物通訊，1998，02:12-6)。沈衛(wèi)榮等于2003年報道誘變前黃曲霉C-527的曲酸產(chǎn)量為9.26g/L(沈衛(wèi)榮，沈儉，韓麗萍，等.曲酸生產(chǎn)菌的復(fù)合誘變選育[J].微生物學(xué)通報，2003，04:60-64)。2006年李一婧等人于2006年報道米曲霉QA96.8在誘變前曲酸產(chǎn)量為4.79g/L，即使經(jīng)多次紫外誘變后，曲酸產(chǎn)量僅上升至18.13g/L(李一婧，馬偉超.曲酸生產(chǎn)菌種的篩選和發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化[J].中國釀造，2006，06:42-44)。沈育芬等在2001年用米曲霉2336經(jīng)紫外線誘變篩選到一株突變株，曲酸產(chǎn)量達(dá)到26.36g/L(沈育芬，陳移亮，周衛(wèi)東，等.曲酸產(chǎn)生菌F31012變株的選育及發(fā)酵條件的研宄[J].福建師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2001，02:73-77)。因此，篩選曲酸高產(chǎn)優(yōu)良菌株具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了一株米曲霉菌株(Aspergillus oryzae QS)，已于2014年9月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCC M 2014436，保藏地址為中國，武漢，武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。
[0004]所述產(chǎn)曲酸米曲霉從土壤中篩選得到，其保藏條件如下:用無菌蒸餾水將斜面上的孢子洗出，玻璃珠打散后用帶脫脂棉漏斗過濾制備孢子懸浮液。每個甘油管里面加入0.5mL孢子懸浮液和0.5mL 30%甘油，放入_70°C低溫冰箱保存。
[0005]固態(tài)平板培養(yǎng)基為(w/v):5%葡萄糖，1%玉米淀粉，0.5%酵母膏，0.5% KH2PO4,0.25% MgSO4.7H20，瓊脂粉 2%，自然 pH，滅菌。
[0006]液體種子培養(yǎng)基為(w/v):10%葡萄糖，2%玉米淀粉，1%酵母膏，0.5% KH2PO4,0.25% MgS04.7H20，用稀 HCl 調(diào) pH 至 4.0，滅菌。
[0007]液體發(fā)酵培養(yǎng)基為(w/v):12%葡萄糖，1.0%豆餅粉，0.3%酵母膏，0.2% KH2PO4,0.02 % MgSO4.7H20，自然 pH,滅菌。
[0008]米曲霉的培養(yǎng)條件為:將已保藏甘油管的米曲霉孢子在固體平板培養(yǎng)基上劃線，30°C培養(yǎng)5d后將孢子接入液體種子培養(yǎng)基，30°C，200rpm，搖床培養(yǎng)27h。以10% (v/v)的接種量將培養(yǎng)好的液體種子接種到發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基中，300C，200rpm，搖床培養(yǎng)。
[0009]將產(chǎn)曲酸米曲霉發(fā)酵后的發(fā)酵液，1000rpm離心2min，采用三氯化鐵比色法測定離心后發(fā)酵上清液的曲酸產(chǎn)量。在發(fā)酵2d后開始生產(chǎn)曲酸，7d后曲酸產(chǎn)量可達(dá)25g/L。
[0010]本發(fā)明自土壤中篩選出一株產(chǎn)曲酸米曲霉，是一株曲酸產(chǎn)量較高的野生菌株。該菌株生產(chǎn)的曲酸可廣泛應(yīng)用于食品防腐保鮮、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工等行業(yè)，具有重要的生產(chǎn)應(yīng)用價值。
【附圖說明】
:
[0011]圖1:曲酸測定標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0012]圖2:米曲霉篩選顏色反應(yīng)及菌落形態(tài)
[0013]圖3:曲酸發(fā)酵生產(chǎn)
【具體實施方式】
:
[0014]實施例1:三氯化鐵測定曲酸含量方法
[0015]曲酸測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:
[0016]1)0.1%曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備:準(zhǔn)確稱取曲酸標(biāo)準(zhǔn)品0.1OOOg于10mL容量瓶中，加入適量蒸餾水使之完全溶解，并用蒸餾水定容至100mL，得到lmg/mL的曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0017]2)1.0% FeCl3-HCl 顯色液制備:準(zhǔn)確稱取 FeCl3.6H20 1.0OOOg 于 10mL 容量瓶中，加入適量蒸餾水使之完全溶解，加入2mL濃鹽酸，并用蒸餾水定容至100mL，得到1.0%FeCl3-HCl顯色液，備用。
[0018]3)用移液管分別準(zhǔn)確吸取0.1 %曲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5、4.0、4.5、5.0mL于100 mL容量瓶中，各加入2.0mL 1.0% FeCl3-HCl顯色液，用蒸餾水定容至lOOmL，充分搖勾后，以蒸飽水加顯色液作為空白對照，于500nm處測定不同濃度下的吸光值(A5_J。以曲酸濃度為橫坐標(biāo)、A5tltol值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。
[0019]發(fā)酵液中曲酸測定:
[0020]將發(fā)酵液離心后，取上清液適當(dāng)稀釋，準(zhǔn)確吸取1.0mL稀釋液按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定A—并根據(jù)曲酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算發(fā)酵液中曲酸的含量。
[0021]實施例2:產(chǎn)曲酸米曲霉篩選方法
[0022]采取一定量的土壤，放入裝有10mL無菌水及玻璃珠的250mL三角瓶中，振蕩，稀釋不同濃度梯度，將不同濃度梯度稀釋好的樣品分別涂布到篩選培養(yǎng)基平板上，于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。觀察平板變色情況，挑取顏色深變色圈大的單菌落孢子接種于篩選培養(yǎng)基上，接種時以三點式法接種于察氏瓊脂培養(yǎng)基平皿上，接種時務(wù)必避免孢子散落到平皿其它位置，之后將其置于霉菌培養(yǎng)箱中標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7d。分離純化培養(yǎng)直到無雜菌污染，接種于斜面保存，供下一步鑒定用。
[0023]所述固體篩選培養(yǎng)基(w/v)為:10%葡萄糖，2%玉米淀粉，1%酵母膏，0.5%KH2PO4,0.25% MgSO4.7Η20，0.1% FeCl3.6Η20，0.08%去氧膽酸鈉，瓊脂 2%,自然 pH，滅菌。
[0024]鑒定主要通過:1)菌落特征觀察:菌落正面前期呈白色，后期呈褐色或淡綠褐色，背面無色，分生孢子較多，菌落中央稍呈疏松柱狀，菌落呈現(xiàn)同心環(huán)狀紋，菌落表面無滲出液。2)顯色圈觀察:顏色深變色圈大的單菌落(圖2)。
[0025]挑選顏色深變色圈大的單菌落進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，取培養(yǎng)后的發(fā)酵液1000rpm離心2min，離心結(jié)束后，取上清液，適當(dāng)稀釋后通過三氯化鐵比色法對發(fā)酵液中曲酸含量進(jìn)行測定，篩選出一株曲酸產(chǎn)量較高的優(yōu)良菌株，曲酸產(chǎn)量為25g/L左右，于2014年9月I日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號CCTCCM 2014436。
[0026]實施例3:曲酸發(fā)酵生產(chǎn)
[0027]將已保藏甘油管的米曲霉孢子在固體平板培養(yǎng)基上劃線，30°C培養(yǎng)5d后將孢子接入液體種子培養(yǎng)基，30°C，200rpm，搖床培養(yǎng)27h。以10% (v/v)的接種量將培養(yǎng)好的液體種子接種到發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)基中，30°C，200rpm，搖床培養(yǎng)。每隔24h取出ImL發(fā)酵液，將發(fā)酵液10000rpm、4°C條件下離心2min，收集上清液，并準(zhǔn)確測量上清液的體積。將通過離心得到的上清液適當(dāng)稀釋后，準(zhǔn)確吸取1.0mL稀釋液按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定A5tltlnm，并計算發(fā)酵液中曲酸的含量。該菌株發(fā)酵培養(yǎng)2d后開始產(chǎn)曲酸，培養(yǎng)7d后曲酸產(chǎn)量達(dá)到25g/L(圖3)，因而是一株曲酸產(chǎn)量較高的優(yōu)良野生菌株。
【主權(quán)項】
1.一株米曲霉菌株(Aspergillus oryzae QS)，于2014年9月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為:CCTCC M 2014436。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的米曲霉，其特征在于該菌高產(chǎn)曲酸。
3.權(quán)利要求2所述的米曲霉，其特征在于培養(yǎng)2d后開始生產(chǎn)曲酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的米曲霉，其特征在于30°C發(fā)酵7d后，曲酸產(chǎn)量可達(dá)25g/L。
5.權(quán)利要求1-4任一所述的米曲霉應(yīng)用于生產(chǎn)曲酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于生產(chǎn)曲酸的發(fā)酵培養(yǎng)基組分為(w/v):12%葡萄糖，1.0%豆餅粉，0.3%酵母膏，0.2% KH2PO4,0.02% MgSO4.7H20。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的米曲霉在食品防腐保鮮、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工等行業(yè)有較廣泛的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株高產(chǎn)曲酸的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae QS)，保藏編號CCTCC M 2014436。該菌株自土壤中篩選得到，30℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)2d后開始產(chǎn)曲酸，發(fā)酵7d后，曲酸產(chǎn)量可達(dá)25g/L，是一株高產(chǎn)曲酸的優(yōu)良野生菌株。曲酸具有較廣泛的應(yīng)用前景，主要用于食品防腐保鮮、化妝品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化工等行業(yè)。CCTCC NO:M201443620140920
【IPC分類】C12R1-69, C12P17-06, C12N1-14
【公開號】CN104531536
【申請?zhí)枴緾N201410564556
【發(fā)明人】楊海泉, 華珊, 宋江寧, 王一恬, 沈微, 陳獻(xiàn)忠, 樊游
【申請人】江南大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年10月21日