技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一株能使碳酸鈣沉積的紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)及其作為生物粘結(jié)劑在建筑物裂縫的修補(bǔ)、再生混凝土的膠結(jié)的應(yīng)用。該菌已于2015年8月24日保藏于保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。地址：中國(guó).北京.北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，郵編：100101，電話：010-64807355，傳真：010-64807288，e-mail：cgmcc@im.ac.cn，其保藏號(hào)為cgmccno.11271。

背景技術(shù)：
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傳統(tǒng)巖土工程加固材料的高能耗，高污染問(wèn)題成為了世界各國(guó)關(guān)注的焦點(diǎn)。研發(fā)能耗低、環(huán)境友好的巖土工程加固新技術(shù)，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。微生物和巖土工程交叉催生的微生物巖土工程學(xué)科，以其環(huán)境友好、能耗低的優(yōu)點(diǎn)，目前已成為微生物巖土工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，2006年被美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)確定為21世紀(jì)重要研究領(lǐng)域。巖土工程加固技術(shù)是世界各國(guó)研究的重點(diǎn)之一，也是巖土工程領(lǐng)域的重要課題之一。在節(jié)能環(huán)保的時(shí)代大背景下，水泥、水玻璃及其他有機(jī)材料作為傳統(tǒng)的巖土工程加固材料所帶來(lái)的高排放、高能耗、易造成污染等問(wèn)題，越來(lái)越被人們所關(guān)注。微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉積(micp)技術(shù)成為巖土工程加固領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

該技術(shù)的基于微生物誘導(dǎo)的鈣沉積，利用產(chǎn)脲酶細(xì)菌代謝活動(dòng)中產(chǎn)生大量的高活性脲酶，專(zhuān)性水解尿素產(chǎn)生co3^2-，并改變環(huán)境ph值，在外源ca²⁺引入下產(chǎn)生碳酸鈣沉淀，起到膠結(jié)和封堵的作用。

本發(fā)明涉及一株具有高效產(chǎn)脲酶能力可誘導(dǎo)的鈣沉積的紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)，該菌株分離自果園土壤?，F(xiàn)已于2015年8月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)是cgmccno.11271，名稱(chēng)為紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌(lysinibacillusfusiformis)。

本發(fā)明所述的lysinibacillusfusiformislz1的特征如下：

(1)形態(tài)特征：

該菌株為桿狀，菌體大小約為1.0-2.0×0.4-1.0μm，革蘭氏染色陰性菌。

(2)培養(yǎng)特征：

該菌株在nh4-ye平板培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)2天后，出現(xiàn)乳白色圓形菌落，直徑約1-2mm，菌落表面光滑濕潤(rùn)。

(3)菌株的生理生化特征：

氧化酶反應(yīng)呈陽(yáng)性，酯酶(c4)、類(lèi)脂酯酶(c8)、a-糜蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-as-bi-磷酸水解酶、β-半乳糖甙酶、a-葡萄糖苷酶呈陽(yáng)性，水解明膠。

菌株可產(chǎn)生脲酶，分解尿素，形成co3^2-和nh4⁺。當(dāng)溶液中含有一定濃度鈣離子時(shí)，鈣離子會(huì)被細(xì)胞吸附，從而以細(xì)胞為晶核，在細(xì)菌周?chē)蜁?huì)形成具有膠凝作用的碳酸鈣結(jié)晶。

最適生長(zhǎng)ph為6.0-9.5，最適生長(zhǎng)溫度為30-37℃。

(4)遺傳學(xué)特征：

本發(fā)明公開(kāi)的菌株的16srdna基因序列為：

tggcgcgcgctatacatgctagtcgagcgaacagagaaggagcttgctccttcgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctaccttatagtttgggataactccgggaaaccggggctaataccgaataatctgtttcacctcatggtgaaacactgaaagacggtttcggctgtcgctataggatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggatttcggttcgtaaaactctgttgtaagggaagaacaagtacagtagtaactggctgtaccttgacggtaccttattagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggatagtggaattccaagtgtagcggtgaaatgcgtagagatttggaggaacaccagtggcgaaggcgactatctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccgttgaccactgtagagatatggtttccccttcgggggcaacggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccatcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacgatacaaacggttgccaactcgcgagagggagctaatccgataaagtcgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttggagccagccgctcgaagtggatg

在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi上，用blast軟件將紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)的16srdna基因序列與genbank的已知序列進(jìn)行比較。結(jié)果表明紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)與賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬(lysinibacillussp.e416sribosomalrnagene,partialsequence)的序列同源性達(dá)到99％，證明所述紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)屬于賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬。

本發(fā)明所述紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)可產(chǎn)生脲酶，分解尿素，形成co3^2-和nh⁴⁺。當(dāng)溶液中含有一定濃度鈣離子時(shí)，鈣離子會(huì)被細(xì)胞吸附，從而以細(xì)胞為晶核，在細(xì)菌周?chē)蜁?huì)形成具有膠凝作用的碳酸鈣結(jié)晶。該菌具有良好的碳酸鈣沉積性能，與對(duì)照菌株巴氏芽孢桿菌(sporosarcinapasteurii，s.pasteuri，atcc11859)進(jìn)行碳酸鈣沉積量的比較，lz1為11.57g/l,s.pasteuri為10.55g/l.lz1比常用的碳酸鹽礦化菌s.pasteurii高10﹪。可作為生物粘結(jié)劑，進(jìn)行建筑物裂縫的修補(bǔ)、再生混凝土的膠結(jié)等。

附圖說(shuō)明

圖1紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)革蘭氏染色

圖2紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)的透射電鏡圖(放大倍數(shù):7000倍，標(biāo)尺：200nm，電鏡型號(hào)：feitecnaig2tf20)

圖3紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)沉積碳酸鈣晶體的x射線衍射圖

圖4紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)沉積碳酸鈣晶體的掃描電鏡圖

圖5紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)沉積晶體的edx圖譜

圖6紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)與對(duì)照菌株s.pasteurii的碳酸鈣沉積量比較

具體實(shí)施方式：

實(shí)施例1從土壤中用稀釋平板法分離紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)

(1)土壤樣本的采集：土壤樣本于2014年3月采集自山東省萊州市程郭鎮(zhèn)的果園。

(2)樣品稀釋與培養(yǎng)：取土樣10g，用無(wú)菌水稀釋為10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6共6個(gè)濃度，取稀釋液涂布于尿素平板(l^-1:5gnacl,2gkh2po4,1g葡萄糖,0.012g酚紅,0.2g蛋白胨,20g尿素,15g瓊脂,ph6.8)于30℃培養(yǎng)。

(3)菌株的分離、純化：2-3天后，待平板長(zhǎng)出菌落后，挑取顏色變紅的單菌落于10ml尿素液體培養(yǎng)基中搖床上30℃恒溫振蕩培養(yǎng)。采用平板劃線分離法純化，將搖瓶培養(yǎng)物劃線于尿素液體固體培養(yǎng)基上進(jìn)行分離，固液交替培養(yǎng)2-3次，直至純化得到單一的菌落，獲得紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)。該菌培養(yǎng)物在nh4-ye固體培養(yǎng)上呈乳白色圓形菌落，直徑約1-2mm，菌落表面光滑濕潤(rùn)。

(4)保藏方式：分離純化的紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)用20％甘油-80℃保藏。

該菌株已于2015年8月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)是cgmccno.11271，名稱(chēng)為紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌(lysinibacillusfusiformis)。

實(shí)施例2紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)的特征鑒定

菌體形態(tài)觀察和染色反應(yīng)：

將紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)接種于液體培養(yǎng)基30℃恒溫培養(yǎng)適合時(shí)間后，染色鏡檢。

染色與鏡檢結(jié)果(圖1)：紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)為桿狀細(xì)菌，革蘭氏染色結(jié)果顯示為革蘭氏陰性菌，菌體長(zhǎng)度約為2.0-3.0×0.8-1.5μm(圖2)。

(2)采用16srdna比對(duì)分析鑒定紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)：

擴(kuò)增與測(cè)序引物：

正向引物：27f5’-agagtttgatcctggctcag-3’

反向引物：1492r5’-ggttaccttgttacgactt-3’

提取紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)菌株的總dna，用引物27f和1492r進(jìn)行pcr擴(kuò)增該菌株的16srdna基因，用引物27f和1492r進(jìn)行測(cè)序，該菌株的16srdna基因序列為：

tggcgcgcgctatacatgctagtcgagcgaacagagaaggagcttgctccttcgacgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctaccttatagtttgggataactccgggaaaccggggctaataccgaataatctgtttcacctcatggtgaaacactgaaagacggtttcggctgtcgctataggatgggcccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatgggcgaaagcctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggatttcggttcgtaaaactctgttgtaagggaagaacaagtacagtagtaactggctgtaccttgacggtaccttattagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggatagtggaattccaagtgtagcggtgaaatgcgtagagatttggaggaacaccagtggcgaaggcgactatctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcccgttgaccactgtagagatatggtttccccttcgggggcaacggtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccatcatttagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacgatacaaacggttgccaactcgcgagagggagctaatccgataaagtcgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagccggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttggagccagccgctcgaagtggatg

在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi上，用blast軟件將紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)的16srdna基因序列與genbank的已知序列進(jìn)行比較。結(jié)果表明紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)與賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬16srdna基因(lysinibacillussp.e416sribosomalrnagene,partialsequence)的序列同源性達(dá)到99％，證明所述紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)屬于賴(lài)氨酸芽孢桿菌屬。

實(shí)施例3紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)的碳酸鈣沉積性能

2％的紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)菌液與對(duì)照菌株s.pasteurii，培養(yǎng)1天后，取菌液10ml，加入140mlurea-cacl2培養(yǎng)基(1l：3gnb；2.12gnahco3；20gnh4cl，余量為蒸餾水，調(diào)節(jié)ph至6.5，高壓滅菌后，再加入過(guò)濾除菌的尿素和cacl2，終濃度均為1m)，于30-37℃搖床中150rpm培養(yǎng)7天，生成白色的沉淀。lz1產(chǎn)生的沉淀經(jīng)干燥后進(jìn)行xrd(圖3)、sem(圖4)和edx分析(圖5)。結(jié)果表明該沉淀為碳酸鈣，晶體類(lèi)型為方解石。

進(jìn)行l(wèi)z1與s.pasteurii碳酸鈣沉積量的比較(圖6)，結(jié)果表明lz1為11.57g/l,s.pasteuri為10.55g/l.lz1比常用的碳酸鹽礦化菌s.pasteurii高10﹪。鈣沉積性能優(yōu)于s.pasteurii.

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，紡錘形賴(lài)氨酸芽孢桿菌lz1(lysinibacillusfusiformislz1)具有較強(qiáng)的碳酸鈣沉積性能，在尿素和外源性ca²⁺存在下，可以生成碳酸鈣，其晶體類(lèi)型為最穩(wěn)定的方解石，鈣沉積性能高于對(duì)照菌株s.pasteurii，可作為生物粘結(jié)劑，進(jìn)行建筑物裂縫的修補(bǔ)、再生混凝土的膠結(jié)等。

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