專利名稱：一種分離、純化裂壺藻油中dha和飽和脂肪酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種油脂的分離純化技術(shù)，尤其涉及一種裂壺藻油中DHA和飽和脂肪酸分離純化的制備方法。
背景技術(shù)：
DHA是二十二碳六烯酸，俗稱“腦黃金”，是一種重要的《 - 3多不飽和脂肪酸，是構(gòu)成腦磷脂的重要成分，具有抗心血管疾病、降血脂、降血壓、預防癌癥、保護視力、促進智力發(fā)育、防治老年癡呆等多種重要生理功能。DHA不足，會導致嬰幼兒腦發(fā)育障礙，青少年智力低下，中老年腦神經(jīng)過早退化。DPA即二十二碳五烯酸，同屬于Co — 3多不飽和脂肪酸，是人類初乳中才有的長鏈不飽和脂肪酸，它同樣是人腦組織的、神經(jīng)細胞的主要組成成份；與DHA起協(xié)同作用，對II型糖尿病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬、哮喘病、潰瘍性大小腸炎等有較好治療作用。 裂殖壺菌又稱裂壺藻，是破囊壺菌科的一類海洋真菌，積累大量對人體有用的活性物質(zhì)，如油脂、色素、角鯊烯等，其中油脂占細胞干重的70%以上，而且油脂脂肪酸組成比較簡單，主要是DHA、DPA和飽和脂肪酸，EPA及其他不飽和脂肪酸含量不到0. 5%，其中DHA達到35%-40%。裂殖壺菌的安全性已經(jīng)得到美國食品和藥品部(FDA)的認可，并開發(fā)了醫(yī)藥、食品以及飼料等一系列產(chǎn)品。DHA的主要傳統(tǒng)來源深海魚油由于存在DHA含量低，成分復雜、產(chǎn)量低等問題，再加上海洋環(huán)境污染的惡化，DHA已無法滿足市場需求。且魚油含有豐富的DHA同時還有大量的EPA，不宜作為嬰幼兒及青少年的食品添加成分。再者，目前由于微藻培養(yǎng)需要光照和CO2,生產(chǎn)工藝繁雜，成本高，利用微藻生產(chǎn)DHA具有局限性。而裂殖壺菌沒有上述條件制約，是一種能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)DHA的微生物，前景廣闊。近年來，全球已普遍開展裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA的研究和規(guī)模化生產(chǎn)，目前對裂殖壺菌的研究主要是集中在發(fā)酵生產(chǎn)方法、油脂提取工藝的改進與選優(yōu)上，提取出的油脂不僅含有DHA，還有較多的飽和脂肪酸(含量達到30%-40%)，無法達到高度純化的目的。目前，我國對裂殖壺菌油脂中DHA、飽和脂肪酸的分離和純化研究報道甚少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供了一種可規(guī)?；a(chǎn)、產(chǎn)品純度高的分離、純化裂壺藻油中DHA和飽和脂肪酸的方法，該方法分離效果好，得到的產(chǎn)品純度高。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種分離、純化裂壺藻油中DHA和飽和脂肪酸的方法，即在氮氣保護下，先將裂壺藻油皂化、鹽析、酸化，得到游離混合脂肪酸，然后采用尿素包合法分離飽和度不同的脂肪酸，過濾得濾液和固體；濾液經(jīng)濃縮、萃取得到富含DHA和DPA的多不飽和脂肪酸；固體經(jīng)酸解浸出、萃取提取飽和脂肪酸以及回收尿素，尿素可循環(huán)使用，包括以下步驟
(I)制備游離混合脂肪酸
按質(zhì)量體積比為I : 3-5的比例在裂壺藻油中加入4%的NaOH-95%乙醇溶液，充氮氣保護，于50-60°C的水浴攪拌回流1-1. 5h，冷卻至室溫后，加入氯化鈉，攪拌、靜置、過濾得濾液和固體，濾液棄去，固體加水至完全溶解，用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH至2-3，然后加正己烷萃取，取上層有機相，用蒸餾水洗至中性，加無水硫酸鈉脫水，抽濾，濾液減壓濃縮回收正己烷，得游離混合脂肪酸；
(2)尿素包合處理
按混合脂肪酸質(zhì)量、尿素質(zhì)量和95%乙醇體積比為I : 2 8-12的比例稱量，先將尿素加入到95%乙醇溶液中，50-55°C水浴攪拌至尿素完全溶解，然后加入混合脂肪酸，充氮氣保護，繼續(xù)攪拌回流30-40min，自然冷卻至25°C后，低溫放置，抽濾分離得濾液和晶體；
(3)提取多不飽和脂肪酸
將步驟(2)所得濾液減壓濃縮回收乙醇，濃縮物加2-4倍量體積的水溶解，用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH至2-3,然后用正己燒萃取,水相溶液備用，有機相水洗至無尿素,然后加入無水硫 酸鈉脫水，抽濾，濾液減壓濃縮回收正己烷，得到富集后的多不飽和脂肪酸；
(4)提取飽和脂肪酸
將步驟(2)所得的晶體按質(zhì)量體積比為I : 3-5加入5%的鹽酸，于40-50°C水浴中加熱至固體完全溶解，冷卻至室溫后加入正己烷萃取，分離，水相溶液備用，有機相水洗至中性，然后加入無水硫酸鈉脫水，抽濾，濾液減壓濃縮回收正己烷，得到富集后的飽和脂肪酸；
(5)回收尿素
將步驟(3)與(4)的水相溶液合并，于2-6°C放置結(jié)晶2-4 h，抽濾，濾液濃縮至1/4體積后，2-6°C放置二次結(jié)晶2-4 h，抽濾，合并兩次抽濾所得固體，干燥得到尿素晶體，可循環(huán)使用。步驟(2)中的低溫放置條件為①25V 5°C，降溫速率為0. 2°C /min ’②5°C保持 3-4h ;(D 5°C -5°C，降溫速率為 0. rc /min _5°C保持 3_4h。本發(fā)明的有益效果
(I)本發(fā)明不僅將裂壺藻油中多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸有效分離，而且分別得到純化的多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸，其中多不飽和脂肪酸主要含DHA和DPA，兩者含量高達93%以上，幾乎不含EPA，尤其適合作為嬰幼兒和孕產(chǎn)婦的營養(yǎng)食品、保健品的添加原料；飽和脂肪酸中棕櫚酸含量達82%以上。產(chǎn)品純度高，不僅彌補了目前魚油、微藻提取制備DHA資源的不足，而且可以作為藥品、保健品、食品添加及聞級化工廣品的原料。(2)本發(fā)明始終在相對低溫下進行，避免了不飽和脂肪酸被氧化，比較完整保留其生物活性和營養(yǎng)，也不存在溶劑殘留問題，且操作簡單易行，產(chǎn)品得率高。(3)本發(fā)明利用尿素包合分離富集出裂壺藻油中多不飽和脂肪酸的同時，也從尿素包合物中回收大量的飽和脂肪酸和尿素，尿素的回收率達到70%以上。該發(fā)明達到資源再利用的效果，具有可觀的經(jīng)濟價值。


圖I是本發(fā)明的工藝流程圖。
具體實施例方式以下為本發(fā)明的具體實施方式
，但不以任何方式限制本發(fā)明。實施例I :(I)制備游離混合脂肪酸
取IOOg裂壺藻油放入燒瓶中，加入400mL已配制好的4%的NaOH-95%乙醇溶液,充氮氣保護，于55°C的水浴攪拌回流I. 5h，冷卻至室溫后，加入Sg氯化鈉，攪拌、靜置15min，過濾得濾液和固體，濾液棄去，固體加水攪拌至完全溶解，用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH至2. 5，然后加入2倍體積的正己烷用分液漏斗萃取分離，取上層有機相油狀物，用蒸餾水洗至中性，加無水硫酸鈉脫水，抽濾，濾液于40°C，真空度為0. OSMPa的條件減壓濃縮，回收正己烷，得到87g游離混合脂肪酸。(2)尿素包合處理
稱取174g尿素加入到裝有870mL的95%乙醇溶液的燒瓶中，置于50°C水浴攪拌至尿素完全溶解，然后加入步驟(I)所得的游離混合脂肪酸，充氮氣保護，
繼續(xù)攪拌回流40min，自然冷卻至25°C后，低溫放置冷卻結(jié)晶，設(shè)置程序降溫條件為①25°C 5°C，降溫速率為0. 2 V /min ；(2) 5°C保持4h ;(D 5°C _5°C，降溫速率為0. 1°C /min _5°C保持4h。然后抽濾，分離得濾液和晶體。(3)提取多不飽和脂肪酸
將步驟(2)所得濾液減壓濃縮，回收乙醇，濃縮物加3倍量體積的水溶解，然后用10%鹽酸調(diào)節(jié)PH至2. 6，然后加入等體積的正己烷萃取分離，水相溶液備用，有機相水洗至無尿素，然后加入無水硫酸鈉脫水，抽濾，濾液減壓濃縮，回收正己燒，得到44g多不飽和脂肪酸。(4)富集飽和脂肪酸
將步驟(2)所得的晶體加入4倍體積的5%的鹽酸，于45°C水浴中加熱至固體完全溶解，冷卻至室溫后加入正己烷萃取，分離，水相溶液備用，有機相水洗至中性，然后加入無水硫酸鈉脫水，抽濾，濾液減壓濃縮，回收正己烷，得到28g飽和脂肪酸。(5)回收尿素
將步驟(3)與(4)的水相溶液合并，于4°C放置結(jié)晶4h，抽濾得晶體和濾液，濾液濃縮至1/4體積后，4°C放置二次結(jié)晶4h，抽濾，合并兩次抽濾所得固體，干燥得到131g尿素晶體。實施例2:
(I)制備游離混合脂肪酸
取IOOg裂壺藻油放入燒瓶中，加入500mL已配制好的4%的NaOH-95%乙醇溶液,充氮氣保護，于50°C的水浴攪拌回流lh，冷卻至室溫后，加入IOg氯化鈉，攪拌、靜置15min，過濾得濾液和固體，濾液棄去，固體加水攪拌至完全溶解，用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH至2. 6，然后加入2倍體積的正己烷用分液漏斗萃取分離，取上層有機相油狀物，用蒸餾水洗至中性，加無水硫酸鈉脫水，抽濾，濾液于40°C，真空度為0. 08MPa的條件減壓濃縮，回收正己烷，得到85g游離混合脂肪酸。(2)尿素包合處理
稱取170g尿素加入到裝有765mL的95%乙醇溶液的燒瓶中，置于50°C水浴攪拌至尿素完全溶解，然后加入步驟(I)所得的游離混合脂肪酸，充氮氣保護，繼續(xù)攪拌回流30min，自然冷卻至25°C后，低溫放置冷卻結(jié)晶，設(shè)置程序降溫條件為①25V 5°C，降溫速率為
0.2V /min ’② 5°C保持 4h 5°C _5°C，降溫速率為 0. 1°C /min _5°C保持 4h。然后抽濾，分離得濾液和晶體。
(3)提取多不飽和脂肪酸
將步驟(2)所得濾液減壓濃縮，回收乙醇，濃縮物加3倍量體積的水溶解，然后用10%鹽酸調(diào)節(jié)PH至2. 6，然后加入等體積的正己烷萃取分離，水相溶液備用，有機相水洗至無尿素，然后加入無水硫酸鈉脫水，抽濾，濾液減壓濃縮，回收正己烷，得到42g多不飽和脂肪酸。(4)提取飽和脂肪酸
將步驟(2)所得的晶體加入3倍體積的5%的鹽酸，于40°C水浴中加熱至固體完全溶解，冷卻至室溫后加入正己烷萃取，分離，水相溶液備用，有機相水洗至中性，然后加入無水硫酸鈉脫水，抽濾，濾液減壓濃縮，回收正己烷，得到26g飽和脂肪酸。(5)回收尿素 將步驟(3)與(4)的水相溶液合并，于4°C放置結(jié)晶3h，抽濾得晶體和濾液，濾液濃縮至1/4體積后，4°C放置二次結(jié)晶3h，抽濾，合并兩次抽濾所得固體，干燥得到127g尿素晶體。實施例3
對本發(fā)明的裂壺藻油原料以及實施例1、2所得產(chǎn)品用氣相色譜法進行含量分析，其中DHA、DPA、棕櫚酸的含量見表I :
表I脂肪酸含量分析
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3、結(jié)論
(I)裂壺藻油原料中多不飽和脂肪酸和飽和脂肪酸得到了有效分離。(2)產(chǎn)品純度高。DHA含量由42. 03%提高到73%，DPA含量由12. 11%提高到20%，在多不飽和脂肪酸產(chǎn)品中兩者含量高達93%以上，幾乎不含EPA ;棕櫚酸含量由35. 75%提聞到飽和脂肪酸廣品的82%。(3)尿素的回收得率達到70 %以上。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種分離、純化裂壺藻油中DHA和飽和脂肪酸的方法，其特征在于在氮氣保護下，先將裂壺藻油皂化、鹽析、酸化，得到游離混合脂肪酸，然后采用尿素包合法分離飽和度不同的脂肪酸，過濾得濾液和固體；濾液經(jīng)濃縮、萃取得到富含DHA和DPA的多不飽和脂肪酸；固體經(jīng)酸解浸出、萃取提取飽和脂肪酸以及回收尿素，尿素可循環(huán)使用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分離、純化裂壺藻油中DHA和飽和脂肪酸的方法，其特征在于所述的方法包括以下步驟 (1)制備游離混合脂肪酸 按質(zhì)量體積比為I : 3-5的比例在裂壺藻油中加入4%的NaOH-95%乙醇溶液，充氮氣保護，于50-60°C的水浴攪拌回流1-1. 5h，冷卻至室溫后，加入氯化鈉，攪拌、靜置、過濾得濾液和固體，濾液棄去，固體加水至完全溶解，用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH至2-3，然后加正己烷萃取，取上層有機相，用蒸餾水洗至中性，加無水硫酸鈉脫水，抽濾，濾液減壓濃縮回收正己烷，得游離混合脂肪酸；(2)尿素包合處理 按混合脂肪酸質(zhì)量、尿素質(zhì)量和95%乙醇體積比為I : 2 8-12的比例稱量，先將尿素加入到95%乙醇溶液中，50-55°C水浴攪拌至尿素完全溶解，然后加入混合脂肪酸，充氮氣保護，繼續(xù)攪拌回流30-40min，自然冷卻至25°C后，低溫放置，抽濾分離得濾液和晶體； (3)提取多不飽和脂肪酸 將步驟(2)所得濾液減壓濃縮回收乙醇，濃縮物加2-4倍量體積的水溶解，用10%鹽酸調(diào)節(jié)pH至2-3,然后用正己燒萃取,水相溶液備用，有機相水洗至無尿素,然后加入無水硫酸鈉脫水，抽濾，濾液減壓濃縮回收正己烷，得到富集后的多不飽和脂肪酸；(4)提取飽和脂肪酸 將步驟(2)所得的晶體按質(zhì)量體積比為I : 3-5加入5%的鹽酸，于40-50°C水浴中加熱至固體完全溶解，冷卻至室溫后加入正己烷萃取，分離，水相溶液備用，有機相水洗至中性，然后加入無水硫酸鈉脫水，抽濾，濾液減壓濃縮回收正己烷，得到富集后的飽和脂肪酸； (5)回收尿素 將步驟(3)與(4)的水相溶液合并，于2-6°C放置結(jié)晶2-4 h，抽濾，濾液濃縮至1/4體積后，2-6°C放置二次結(jié)晶2-4 h，抽濾，合并兩次抽濾所得固體，干燥得到尿素晶體，可循環(huán)使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分離、純化裂壺藻油中DHA和飽和脂肪酸的方法，其特征在于步驟(2)中的低溫放置條件為①25 V 5°C，降溫速率為0. 20C /min 5°C保持3-4h 5°C -5°C，降溫速率為 0. I0C /min _5°C保持 3_4h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分離、純化裂壺藻油中DHA和飽和脂肪酸的方法，在氮氣保護下，先將裂壺藻油皂化、鹽析、酸化，得到游離混合脂肪酸，然后采用尿素包合法分離飽和度不同的脂肪酸，過濾得濾液和固體；濾液經(jīng)濃縮、萃取得到富含DHA和DPA的多不飽和脂肪酸；固體經(jīng)酸解浸出、萃取提取飽和脂肪酸(主要為棕櫚酸)以及回收尿素，尿素可循環(huán)使用。本發(fā)明在相對低溫下進行，避免了不飽和脂肪酸被氧化，較完整保留其生物活性和營養(yǎng)，也不存在溶劑殘留問題。產(chǎn)品純度高，得到的多不飽和脂肪酸主要含DHA和DPA，兩者含量高達93%以上，幾乎不含EPA；飽和脂肪酸中棕櫚酸含量達82%以上。
文檔編號C07C57/03GK102746947SQ20121024784
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者吳松剛, 張河溪, 林金科, 郭耀榮, 郭震宇, 魏巧容, 黃建忠 申請人:福建華爾康生物科技有限公司