專利名稱：Dac hyp組合物和方法
DAC HYP組合物和方法I.發(fā)明背景 達珠單抗(Daclizumab, DAC)是人源化IgG1單克隆抗體，結合人高親和性白介素-2(IL_2)受體a亞基(CD25或Tac)，其在活化的而不是靜息的t-和B-淋巴細胞表面表達。當與活化的細胞上的CD25結合時，DAC阻斷高親和力IL-2受體復合物的形成，從而阻斷IL-2誘導的活化細胞的增殖。如對PHA胚細胞的直接結合測試所測定，DAC以0. 3nM的近似結合親和力(Kd)與⑶25結合，并以劑量依賴的方式抑制PHA胚細胞增殖(Hakimi等，1993，J. Immunol. 151(2)1075-85)。在次最優(yōu)的IL-2劑量(2. 5ng/mL)下，15nM DAC對IL-2依賴性細胞系Kit225/K6 的增殖抑制了 50% (Pilson 等，1997，J. Immunol. 159(3) =1543-56) 在 IL-2 依賴性、抗原誘導的T細胞增殖測試中，使用0. 5-1 u g/mL(3-7nM)范圍內(nèi)的DAC時觀察到50%的增殖抑制(Junghans 等，1990, Cancer Res. 50 (5) :1495-502)。一種形式的DAC之前由Hoffman-La公司以ZENAPAX 的商品名上市銷售，其用作免疫抑制方案(包括環(huán)孢素和皮質類固醇)的佐劑以治療腎移植患者的急性同種異體移植物排斥。ZENAPAX被提供為用于進一步稀釋且靜脈施用的濃縮物。每管濃縮物含有5mL溶液，所述溶液含有5mg/mL DAC、3. 6mg/mL 一水合磷酸二氫鈉、llmg/mL十二水合磷酸氫二鈉、4. 6mg/mL氯化鈉、0. 2mg/mL聚山梨酯80以及足以將pH調(diào)節(jié)至pH 6. 9的HCl和/或NaOH0成人和兒童患者推薦劑量為I. Omg/kg，其通過使用50mL無菌的0. 9%氯化鈉溶液稀釋經(jīng)計算的體積的25mg/5mL ZENAPAX濃縮物，并在15分鐘的時間內(nèi)通過外周或中央靜脈進行靜脈內(nèi)施用來實現(xiàn)。DAC 還顯不出治療葡萄膜炎(Nussenblatt 等，2004, FOCIS 2004meeting ；Jul18-23, Montreal, QC. Abstract 4688 ；Nussenblatt 等，2003, J.Autoimmun. 21 :283-93)和多發(fā)性硬化癥(參見如 Bielekova 等，2004，Proc. Nat' I. Acad. Sci. USA 101(23)8705-8708 ;Rose 等，2OO7, Neurology 69 :785-789 ;美國專利 No. 7，258，859)的效力，目前治療多發(fā)性硬化癥的課題正在進行臨床實驗。盡管已經(jīng)證實DAC是安全且有效的，仍希望獲得具有長儲存壽命并且無需進一步配制或操作即可方便地施用的高濃度液體制劑，以及與ZENAPAX DAC相比具有改進特性(如安全性增強)的新的達珠單抗分子。2.發(fā)明簡述如發(fā)明背景部分提到的，達珠單抗是與人白介素-2受體(IL-2R) a亞基(也被稱為CD25或Tac)特異性結合的人源化IgG1抗體，所述人白介素_2受體是淋巴細胞活化的重要介導者。一種形式的達珠單抗之前由Hoffman-La公司以ZENAPAX 的商品名上市銷售，當其用作免疫抑制方案(包括環(huán)孢素和皮質類固醇)的佐劑時，其在治療腎同種異體移植物排斥中顯示是安全且有效的(參見如歐洲藥品局(“EMEA”)對ZENAPAX的市場授權)，在治療多發(fā)性硬化癥中也顯示有效(參見如Bielekova等，2004，Proc. NaC I. Acad. Sci. USA101(23) :8705-8708 ;Rose 等，2007，Neurology 69 :785-789 ;美國專利 No. 7，258，859)。根據(jù)EMEA，ZENAPAX DAC在GS-NSO (鼠骨髓瘤)細胞中表達，并利用包括Q-S^harose層析、
S-Sepharose層析、滲濾、Q-Sepharose II層析、超濾、S-300凝膠過濾層析和超濾的過程進行純化。現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在無血清、無膽固醇和無其他動物產(chǎn)物的培養(yǎng)基中適應性生長的NSO細胞系中表達并通過不同的過程分離的達珠單抗具有不同于、在某些情況下優(yōu)于ZENAPAX達珠單抗(“ZENAPAX DAC")的特性和性質。這種新的達珠單抗在本文中被稱為DAC HYP,其具有與ZENAPAX DAC不同的同等型譜(如通過陽離子交換層析所確定)；與ZENAPAXDAC不同的N-連接的糖基化譜(即使兩種形式的達珠單抗均在NSO細胞中表達)；和在生物測試中低于ZENAPAX DAC的ADCC細胞毒性。如，達珠單抗的同等型可能源于重鏈N-和C-末端的異質性。達珠單抗成熟Vh鏈的氨基酸序列起始于圖2所示氨基酸序列(SEQ ID NO 4)的位置20。成熟Vh鏈的N-末端谷氨酰胺(Q)(圖2中粗體、下劃線文本)可以環(huán)化，形成焦谷氨酸(pE)。在某些情況下，信 號肽序列可以截短，剩余與成熟Vh鏈的N-末端谷氨酰胺殘基相連的纈氨酸-組氨酸-絲氨酸(VHS)序列。由于每個達珠單抗分子包含兩條Vh鏈，達珠單抗的多種N-末端同等型可以包括含有以下的形式(I)兩個谷氨酰胺殘基(Q/Q) ；(2) 一個谷氨酰胺殘基和一個VHS序列(Q/VHS或VHS/Q) ；(3)兩個VHS序列(VHS/VHS) ； (4) 一個谷氨酰胺殘基和一個焦谷氨酸殘基(Q/pE或pE/Q) ；(5) 一個焦谷氨酸殘基和一個VHS序列(pE/VHS或VHS/pE);和
(6)兩個焦谷氨酸殘基(pE/pE)。還可能有不同的C-末端同等型，其含有0、1或2個C-末端賴氨酸(K)殘基(0K，IK或2K)，產(chǎn)生復雜的同等型譜。相當令人驚奇的是，當ZENAPAX DAC Vh鏈的N末端谷氨酰胺完全環(huán)化為焦谷氨酸時，DAC HYP并沒有達到完全環(huán)化。因此DAC HYP陽離子交換層析的特征在于pE/Q同等型峰和Q/VHS同等型峰。盡管不希望受任何理論的束縛，據(jù)信這些獨特的pE/Q和Q/VHS同等型可以受到用于表達DAC HYP的先導序列的影響。因此，在一個方面中，本文公開的內(nèi)容提供了一種達珠單抗組合物，如陽離子交換層析所確定，其中PE/Q同等型占N-末端同等型的3% -17%,3% -15%,5% -15%，更優(yōu)選 5% -12%或 7% -12%，和 / 或其中 Q/VHS 同等型占N-末端同等型的1% -15%，更優(yōu)選3% -12%。在某些實施方式中，達珠單抗組合物的特征在于與

圖18或圖23的DAC HYP曲線基本相似的陽離子交換層析曲線。達珠單抗具有與重鏈殘基Asn296相連的N-連接的寡糖。當利用酰胺酶PNGaseF使這些N-連接的寡糖釋放并通過HPLC進行分析時，盡管事實上二者均是在NSO細胞系中重組產(chǎn)生，DAC HYP呈現(xiàn)與ZENAPAX DAC不同的糖基化譜。的確，DAC HYP的糖基化譜異常均一。參考圖21的上面的圖，ZENAPAX DAC的糖基化譜的特征在于代表寡糖G0_GlcNAc、G0、Gl、Man5、G2、Man6、Man7和唾液酸化寡糖的峰。圖21的下面的圖顯示DAC HYP的糖基化譜的特征在于對應于GO-GlcNAc糖型和GO糖型的兩個主峰以及對應于Gl糖型的次要峰。GO-GIcNAc糖型可占AUC的約5%至約20%，更通常占AUC的約7. 2%至14. 6%。GO糖型可占AUC的70%至99. 2%，更通常占AUC的80. 9%至99. 2%。Gl糖型可占AUC的1%至9%，更通常占AUC的I. 4%至3.8%。唾液酸化寡糖占總AUC的1.0%或更少。免疫原性和效應器功能的高水平對于長期施用的藥物是個難題。此外，快速清除率可以降低藥物的可用性。如技術人員所熟知的，治療性抗體的糖基化方式的差異可以導致免疫原性的差異。具有高度均一的糖基化方式的抗體(如DAC HYP)可以提供有益的免疫原性譜、ADCC水平和清除率。此外，具有更加均一的糖基化方式的生物制劑減少了批次間的變化，并且可以改善一致性和穩(wěn)定性。
因此，在另一個方面中，本文公開的內(nèi)容提供了達珠單抗組合物，其特征在于均一的N-連接的糖基化譜。在一個實施方式中，達珠單抗組合物的特征在于N-連接的糖基化譜，如通過HPLC所測定，其包括總AUC約5-20%的GO-GlcNAc糖型，在某些實施方式中為總AUC 約 5%-18%或約 7-15% (如 7. 2%-14. 6%或 6. 9%至 14. 7%)的 GO-GIcNAc 糖型(在某些具體的實施方式中為總AUC 7. 3%的GO-GlcNAc糖型)，以及總AUC約70% -99. 2%的GO糖型，在某些實施方式中為總AUC約75% -90%、約75-92%或約81-88%的GO糖型(在某些具體實施方式
中總AUC 86%的GO糖型)?？蛇x的，Gl峰少于總AUC的約10%、少于總AUC的約5%、少于總AUC的約4%或少于總AUC的約3%，在某些實施方式中為約1%至約4% (如I. 4%至3.8% )或約1%至約3%。Man5糖型優(yōu)選占總AUC的約3%或更少。在其他實施方式中，達珠單抗組合物的特征在于與圖19中所顯示的譜實質相似的HPLC N-連接的糖型譜。在某些方面中，公開的達珠單抗組合物的特征在于總數(shù)為兩個以上的糖型峰。在 某些實施方式中，公開的達珠單抗組合物的特征在于(a)對應于GO-GlcNAc糖型和GO糖型的兩個主峰，其總共占總AUC的約75%至約100%、約80%至約100%或約85%至約100%和/或(b)對應于Man5，Man6，和Man7糖型的峰，其總共占總AUC的約6%或更少和/或(c)對應于Man6和Man7糖型的峰，其總共占總AUC的約2%或更少。在這樣的實施方式中，G0-GlcNAc,G0,Gl和/或Man5的百分數(shù)可以以前段中所描述的量存在。DAC HYP的結合和抑制性質，以及如在測定對IL-2誘導的T細胞增殖的抑制的測試中所評價的DAC HYP功能效力，與ZENAPAX DAC的那些類似。然而，相當令人驚奇的是，DAC HYP顯示出明顯低于ZENAPAX DAC的ADCC細胞毒性，這可能是由于，至少部分地由于它們的非巖藻糖化甘露糖糖基化水平的差異(參見圖21)。如圖22A和圖22B所示，如細胞測試中所測定，DAC HYP顯示比ZENAPAX DAC低至少25%的ADCC細胞毒性。如技術人員可以認識到的，DAC HYP的降低的ADCC細胞毒性對于涉及不期望細胞死亡的長期給藥的適應癥有益，如治療多發(fā)性硬化癥和葡萄膜炎。在這些長期應用療法的情況下，如，如在多發(fā)性硬化癥和其他非腫瘤適應癥的治療中，DAC HYP療法可以比使用ZENAPAX 的療法更安全。因此，在另一個方面中，公開的內(nèi)容提供了達珠單抗組合物，其特征在于在Iiig/1^的濃度下，顯示低于約30%、25%、20%、15%、10%、5%或甚至更低的40(1細胞毒性，其中ADCC細胞毒性在利用25 1,40 1,50 I或60 I的效應細胞與靶細胞比率，如當利用KU225/K6作為靶細胞時和/或當利用來自3個或以上、6個或以上、10個以上或或50個或以上健康供體的PBMC效應細胞時的體外試驗中測定。在具體實施方式
中，公開的內(nèi)容提供了達珠單抗組合物，其特征在于在Iu g/mL的濃度下，顯示5-30%、10-30%、15-30%、15-30%、5-25%、10-25%、20-30%、15-25%、15-35%或 20-35%范圍的 ADCC 細胞毒性，其中ADCC細胞毒性在利用25 1,40 1,50 I或60 I的效應細胞與靶細胞比率，如當利用KU225/K6作為靶細胞時和/或當利用來自3個或以上、6個或以上、10個或以上或50個或以上健康供體的PBMC效應細胞時的體外試驗中測定。考慮到DAC HYP是IgG1免疫球蛋白并且不含已知的能降低ADCC細胞毒性的框架突變，利用DAC HYP觀察到的、與ZENAPAXDAC相比較低水平的ADCC細胞毒性是令人驚訝的。與ZENAPAX DAC相比，DAC HYP的安全性可以通過使用高產(chǎn)無血清過程進一步改善，該過程允許生產(chǎn)無牛血清白蛋白(BSA)的高純產(chǎn)品。因此，本文公開的內(nèi)容提供了達珠單抗組合物，其無BSA和/或是不存在BSA的細胞培養(yǎng)過程的產(chǎn)物。特征在于有I個或多個上面討論特性的達珠單抗組合物(DAC HYP組合物)可以通過在哺乳動物細胞中重組表達方便地獲得。盡管不希望受任何特定操作理論的束縛，據(jù)信I個或多個上面討論的獨特的特點和/或特性可能由于，至少部分地由于高產(chǎn)重組表達系統(tǒng)的使用。這可以以任何方法實現(xiàn)，如通過利用DHFR進行基因擴增，或利用處于弱啟動子控制下的選擇標記基因，所述弱啟動子優(yōu)選與驅動目標蛋白(優(yōu)選分泌蛋白)表達的強啟動子聯(lián)合使用。不受理論的束縛，據(jù)信處于弱啟動子控制下的標記選擇有利于鑒定穩(wěn)定轉染子，在所述穩(wěn)定轉染子中，表達載體整合入轉錄活躍的染色體區(qū)域，從而獲得高表達水平的目標蛋白。在一個實施方式中，驅動選擇標記表達的弱啟動子是SV40啟動子(Reddy等，1978，Science 200 :494-502)，其中一個或兩個增強子區(qū)域的活性已經(jīng)如通過部分或完全缺失而降低或消除，可選的其與驅動目標蛋白表達的強啟動子，如CMV IE啟動子聯(lián)合使用(Boshart 等，1985，Cell 41(2) :52130)。
因此，在另一個方面中，公開的內(nèi)容提供了用于產(chǎn)生重組細胞系的載體，重組細胞系能穩(wěn)定表達高水平的達珠單抗，如DAC HYP，其中選擇標記的表達處于SV40啟動子的控制下，所述SV40啟動子中增強子功能已經(jīng)如通過一個或兩個增強子序列的部分缺失而降低(命名為dE-SV40)?？梢杂糜诋a(chǎn)生穩(wěn)定表達細胞系的具體的dE-SV40啟動子序列位于載體 pHAT. IgGl. rg. dE(SEQ ID NO 5)的位置 6536-6735，其在圖 3A-圖 3D 和圖 3E (SEQ IDNO 12)中顯不?？梢杂糜诋a(chǎn)生穩(wěn)定表達細胞系的具體載體的多種實施方式描述于2011年11月30日提交的美國申請61/565，419號和2011年11月30日提交的國際申請PCT/US11/62720號中，其通過引用并入本文。一般地講，用于表達達珠單抗如DAC HYP的載體將包含由pHAT. IgGl. rg. dE所示例的一個或多個特征(描述于下面5. I節(jié)中)，如啟動子。達珠單抗的兩條鏈可以置于獨立的轉錄調(diào)控下，但優(yōu)選位于相同的載體上，而其編碼區(qū)可以是含有內(nèi)含子和外顯子的基因組DNA或cDNA。作為獨立的轉錄調(diào)控的替代方案，兩條鏈可以表達為單個轉錄本或單個開放讀碼框，其編碼區(qū)被內(nèi)部核糖體進入位點或自切割內(nèi)蛋白序列分開，在這種情況下，重鏈和輕鏈編碼序列位于單個啟動子的控制下。示例性啟動子是CMV IE啟動子和增強子(位于 pHAT. IgGl.rg. dE (SEQ ID NO 5)的位置 0001-0632 和 3982-4604 處)。其他特征包括轉錄起始位點(如果沒有選擇的啟動子)，轉錄終止位點和復制起點。這些特征的示例展示于表I中，其中概述了 pHAT. IgGl.rg. dE的元件。用于在NSO細胞中由單個外源核酸表達達珠單抗如DAC HYP的重鏈和輕鏈的具體實施方式
，使用在哺乳動物細胞中可操作的選擇標記，如新霉素磷酸轉移酶(nec/)、潮霉素B磷酸轉移酶(hyf)、潮霉素B磷酸轉移酶(Hph)、嘌呤霉素-N-乙酰轉移酶(puix/)、殺稻瘟素S脫氨酶(bsf)、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(gpt)、谷氨酰胺合成酶(GS)或單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)。在優(yōu)選的實施方式中，公開的載體中的選擇標記是處于增強子減弱的SV40啟動子控制下的大腸桿菌鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶選擇標記，其編碼序列可以在圖3A-圖3D中所示pHAT. IgGl. rg. dE (SEQ ID NO 5)的位置6935-7793處找到。在另一個方面中，本文公開的內(nèi)容提供了宿主細胞，其經(jīng)用于重組生產(chǎn)達珠單抗如如DAC HYP的載體轉染。宿主細胞可以是任何哺乳動物細胞，包括如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NSO鼠骨髓瘤細胞、Sp2/0細胞、PER. C6細胞、Vero細胞、BHK細胞、HT1080細胞、C0S7細胞、WI38細胞、CV-1/EBNA細胞、L細胞、3T3細胞、HEPG2細胞、MDCK細胞和293細胞。一經(jīng)轉染，載體可以整合入基因組從而產(chǎn)生穩(wěn)定生產(chǎn)的細胞系。技術人員將領會的是，在指定施用于人的組合物中包含動物產(chǎn)物是不理想的。因此，優(yōu)選不需要血清或其他動物產(chǎn)物(如膽固醇)來生長的宿主細胞?？梢允剐枰@樣動物產(chǎn)物的宿主細胞適應利用無血清和無其他動物產(chǎn)物的培養(yǎng)基。使鼠骨髓瘤NSO細胞適應在無血清和膽固醇的培養(yǎng)基中生長的方法描述于 Hartman 等，2007，Biotech. &Bioeng. 96(2) :294-306 和 Burky 等，2007，Biotech. &Bioeng. 96 (2) :281-293中。適應在無血清和無膽固醇培養(yǎng)基中生長的具體NSO細胞株已經(jīng)使用上面描述的可用于產(chǎn)生DAC HYP的載體穩(wěn)定轉染(克隆7A11-5H7-14-43)。
如技術人員將認識到的，用于培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白的細胞的基礎和補料培養(yǎng)基以及其他變量如補料時間表、生長速率、溫度和氧水平，可能影響表達的蛋白的產(chǎn)量和質量。優(yōu)化這些條件的方法在技術人員所知范圍內(nèi)；示例性條件列于公開內(nèi)容的示例性實施方式中。優(yōu)選使細胞適應生長于無膽固醇、血清和其他動物源性成分的培養(yǎng)基中；在這種情況下基礎和補料培養(yǎng)基優(yōu)選包括能替代這些成分的限定性化學物質。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有高水平葡萄糖，如10-35g/L葡萄糖的培養(yǎng)基有利地使細胞培養(yǎng)的生產(chǎn)力增加。在具體的實施方式中，基礎培養(yǎng)基具有約10-20g/L，更優(yōu)選約15g/L的葡萄糖和/或補料培養(yǎng)基具有22-35g/L，更優(yōu)選約28g/L的葡萄糖。如本領域已知的，可以按照逐漸上升的補料時間表在8-15天，優(yōu)選9-13天，或最優(yōu)選10-13天的時間內(nèi)將補料培養(yǎng)基加入細胞中。對于在NSO生產(chǎn)株7A11-5H7-14-43中表達的DAC HYP,生長和補料培養(yǎng)基的組分以及其他影響表達和生產(chǎn)的變量已經(jīng)被優(yōu)化。因此，公開的內(nèi)容還提供了經(jīng)優(yōu)化的基礎培養(yǎng)基、補料培養(yǎng)基、補料時間表以及用于以高產(chǎn)量和純度生產(chǎn)達珠單抗的其他培養(yǎng)方法和條件。這些培養(yǎng)基以及培養(yǎng)參數(shù)和方法更詳細地描述于5. 3節(jié)中。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)利用某些層析步驟的組合從細胞培養(yǎng)物中純化達珠單抗得到了經(jīng)純化的達珠單抗和DAC HYP藥物物質組合物，以及在高濃度下以液體形式中穩(wěn)定儲存的液體達珠單抗和DAC HYP藥物制劑，其中通常達珠單抗或DAC HYP的額定濃度為至少約IOOmg/mL±10-15%，在一些實施方式中為150mg/mL±10-15% (如通過UV光譜學或折光率所測定)。一般通過用具有約267-327m0sm/kg范圍內(nèi)的摩爾滲透壓濃度(如270-3IOmOsm/kg)和25°C時約pH 5. 8-6. 2范圍內(nèi)的pH (如25°C時5. 9-6. I)的交換緩沖液與濃縮的達珠單抗制劑發(fā)生交換以產(chǎn)生中間制劑，接著用聚山梨酯稀釋緩沖液稀釋中間制劑以獲得穩(wěn)定的高濃度液體制劑，從而制備穩(wěn)定的高濃度達珠單抗藥物制劑，其中如通過UV光譜學或折光率所測定，所述高濃度液體制劑包含約100mg/mL±10%達珠單抗(如DAC HYP)，在某些實施方式中包含至少約150mg/mL達珠單抗(如DAC HYP)。稀釋緩沖液與交換緩沖液相同，但含有約0-10% (w/v)的聚山梨酯80，其以一定量使用以使最終穩(wěn)定的高濃度達珠單抗制劑具有計算的聚山梨酯80濃度(額定濃度)，其在0. 02-0. 04%范圍內(nèi)，在某些實施方式中為約0.03% (w/v) 0交換和稀釋緩沖液中可以包含多種不同的緩沖劑和賦形劑以得到限定范圍內(nèi)的摩爾滲透壓濃度和pH。適于配制穩(wěn)定的高濃度液體達珠單抗和DAC HYP藥物制劑的交換緩沖液的具體非限定性示例含有約40mM琥珀酸鹽和約IOmM NaCl并在25°C時具有約6. 0的pH。適于與該交換緩沖液使用的稀釋緩沖液的具體非限定性示例含有約40mM琥珀酸鹽、約IOOmMNaCl和約1% (w/v)聚山梨酯80，并在25°C時具有約6. 0的pH?？梢允褂盟峄驂A調(diào)節(jié)最終制劑的PH以獲得25°C時約6. O的實際pH。穩(wěn)定的高濃度液體達珠單抗制劑的特征在于聚集水平低，如通過大小排阻層析所測定，其通常含有至少95 %的單體和少于3 %的聚集體，有時少于I. 5 %的聚集體，更通常大于99%的單體和少于0. 8%的聚集體。高濃度液體達珠單抗藥物制劑的其他純度特征更詳細地描述于5. 6節(jié)中。高濃度達珠單抗藥物制劑的特征還在于儲存期長，在不會產(chǎn)生大于5%的降解和形成大于3%的聚集體(如分別通過SDS-PAGE和大小排阻層析所測定)的情況下，其儲存在2-8 °C時能夠穩(wěn)定長達54個月或更長時間，如至少5年，在加速條件下(23-270C /60±5 %的相對濕度)儲存時能夠穩(wěn)定長達9個月的時間，而在加壓條件下(38-420C /75±5%的相對濕度)儲存時能夠穩(wěn)定長達3個月的時間。如上所述，可以通過用聚山梨酯稀釋緩沖液稀釋中間制劑以獲得已完成的達珠單抗藥物制劑，從而制備穩(wěn)定的高濃度液體達珠單抗制劑。因此，在另一個方面中，公開的內(nèi) 容提供了無聚山梨酯的經(jīng)純化的達珠單抗(優(yōu)選DAC HYP)中間制劑，其含有至少150mg/mL達珠單抗，在某些實施方式中含有約170-190mg/mL達珠單抗，其可以用聚山梨酯稀釋緩沖液進行稀釋以獲得本文描述的穩(wěn)定的高濃度達珠單抗液體藥物制劑。在具體的實施方式中，濃縮的無聚山梨酯中間制劑額定含有約155mg/mL或約180mg/mL的達珠單抗(優(yōu)選DACHYP)、約40mM檸檬酸鈉和約IOOmM NaCl，在25°C時pH為6. O。在具體的實施方式中，濃縮的無聚山梨酯中間制劑額定含有約155mg/mL或約180mg/mL達珠單抗(優(yōu)選DAC HYP)、約40mM琥珀酸鈉和約IOOmMNaCl，在25°C時pH為6. O。達珠單抗組合物的特征在于聚集物水平低，其在下面進一步描述。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過超濾濃縮的達珠單抗會誘導形成聚集體，其會導致高濃度達珠單抗藥物制劑含有不可接受水平(如>3%)的聚集體。因此，優(yōu)選在濃縮達珠單抗藥物物質之前利用“精煉”步驟以去除聚集體。濃縮前可接受的聚集體水平將取決于將被濃縮的達珠單抗藥物物質的濃度、最終達珠單抗藥物制劑中的期望濃度以及最終達珠單抗藥物制劑中可接受的聚集體水平。如，如果期望獲得含有少于3%聚集體的150mg/mL達珠單抗制劑，并且達珠單抗藥物物質必須被濃縮10到30倍(如20倍)以實現(xiàn)該已完成的達珠單抗制劑，則將被濃縮的達珠單抗組合物應當含有< 0. 3%的聚集體，優(yōu)選< 0. 2%的聚集體，優(yōu)選甚至更低水平，如約0. I %的聚集體。可以利用多種已知技術獲得含有可接受聚集體水平的起始達珠單抗藥物物質組合物，以用于濃縮成本文描述的經(jīng)濃縮的達珠單抗中間制劑和最終藥物制劑，所述技術包括，如強陽離子交換層析和疏水相互作用層析。然而，已經(jīng)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，弱陽離子交換層析將含有4-12mg/mL范圍內(nèi)的達珠單抗和高至2. 5%聚集體的達珠單抗組合物的聚集體水平降至極低水平，通常降至約0. I %聚集體。與利用含氮溶液(如硫酸銨溶液)的疏水相互作用層析相比，使用弱陽離子交換以去除聚集體在環(huán)境上更加溫和。因此，在另一個方面中，公開的內(nèi)容提供了精煉達珠單抗組合物以去除聚集體的方法，這樣得到的精煉組合物通常包含約4至15mg/mL的達珠單抗，如通過大小排阻層析所測定，其中0.3%或更少(如0.2%或更少或者0.1%或更少)是聚集體形式。該方法通常包括使含有約4-10mg/mL,通常約8-9mg/mL,優(yōu)選約8. 5mg/mL達珠單抗和> 0. 5%聚集體的達珠單抗組合物在適宜緩沖液中流經(jīng)弱陽離子交換樹脂以吸附達珠單抗，并用洗脫緩沖液洗脫被吸附的達珠單抗?？捎玫娜蹶栯x子交換樹脂包括但不限于CM-650M(ToSohBiosciences)、CM-Sepharose、CM-HyperD。平衡、清洗和洗脫緩沖液的組分取決于所使用的弱陽離子交換樹脂，這對于本領域技術人員來說是顯而易見的。對于CM-650M樹脂(TosohBiosciences，產(chǎn)品編號101392)，含有約20mM檸檬酸鈉、pH為4. 5的平衡和清洗緩沖液，以及含有20mM檸檬酸鈉和75mM硫酸鈉、pH為4. 5的洗脫緩沖液運作良好。所用流速取決于樹脂的選擇和柱尺寸。對于具有約10-30cm(如17-19cm)范圍內(nèi)的床高的CM-650M樹脂圓柱形柱，約50-200cm/hr范圍內(nèi)(如90_110cm/hr,優(yōu)選約100cm/hr)的流速運作良好。層析可以于室溫或者更低溫度下進行，如4°、10°、15°、20°或25°C范圍內(nèi)的溫度。通常使用的溫度范圍是18-25 °C (如18-22 °C )。依據(jù)ZENAPAX EMEA, ZENAPAX DAC的純化過程包括以下12個步驟(i)培養(yǎng)基濃縮；
(ii) Q-Sepharose 層析；(iii) S-Sepharose 層析；(iv)低pH處理以失活病毒；(V)濃縮/滲濾；(vi)DV50過濾以去除病毒；(vii)Q-Sepharose II 層析；(viii) Viresolve 層析以去除病毒；(ix)超濾濃縮；(xi) S-300凝膠過濾層析；(xii)超濾濃縮(xiii)無菌灌裝入瓶。該過程效率低，純化產(chǎn)率低。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)利用較少步驟的過程可以實現(xiàn)較高的產(chǎn)量，同時獲得較高的純度，這使得所得達珠單抗藥物物質能夠配制成上面描述的高濃度藥物制齊U。因此，本文公開的內(nèi)容還提供了分離和/或純化達珠單抗藥物物質和高濃度藥物制劑的改進的方法。該過程聯(lián)合利用蛋白A親和層析、強陰離子交換層析(Q-Sepharose)和弱陽離子交換層析(CM-650M)，這使得進行連續(xù)性流動處理而無需稀釋過程中間產(chǎn)物。獲得經(jīng)純化的達珠單抗藥物物質的改進的方法包括以下步驟(i)蛋白A親和層析，以從其他細胞培養(yǎng)組分中分離達珠單抗；(ii)低pH病毒失活；(iii)強陰離子交換(Q-Sepharose)層析，以去除DNA(iv)弱陽離子交換(CM-650M)層析，以減少聚集體；和(V)過濾，以去除病毒。如本領域公知，確切的體積、柱尺寸和操作參數(shù)將部分取決于純化的規(guī)模。用于大規(guī)模純化的具體體積、柱尺寸和操作參數(shù)描述于5. 4節(jié)中。可以利用多種常規(guī)方法，如微過濾、離心和直接從生物反應器中深度過濾，從細胞培養(yǎng)物中收獲將通過上述方法被純化和可選地被配制的粗達珠單抗。然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以通過在低于15°C的溫度下將細胞培養(yǎng)物的pH降至約pH5以使細胞絮凝，從而方便地收獲粗達珠單抗，所述絮凝的細胞可以通過離心去除。在一個具體實施方式
中，通過將細胞培養(yǎng)物的pH降至約pH 5，將培養(yǎng)物冷卻至低于15°C (如4°C ) 30-90分鐘，并對所得懸液進行離心以去除細胞，從而收獲粗達珠單抗。該過程通常適用于任何向培養(yǎng)基中分泌重組蛋白的細胞培養(yǎng)物，而不是特定適用于產(chǎn)生達珠單抗或治療性抗體的培養(yǎng)物。可以使用多種不同的酸，包括弱或強的有機酸，或者弱或強的無機酸來調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH。對于達珠單抗培養(yǎng)物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)檸檬酸作用良好。收獲前可以使用濃縮的檸檬酸溶液，如0. 5M-2M溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH。
通過利用三個層析步驟、病毒失活、病毒過濾和最終超濾來完成DAC HYP的純化。蛋白A親和層析是純化過程中的第一個步驟，其清除大部分過程相關的雜質。為使蛋白A親和柱能夠再利用，必須使其再生并消毒。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NaOH水溶液能夠有效地完成柱的再生和消毒。然而，使用NaOH溶液可能使蛋白A樹脂降解，增加總生產(chǎn)成本。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用含有NaOH和苯甲醇的溶液對蛋白A親和層析樹脂進行消毒能夠得到良好的結果，并使純化循環(huán)數(shù)顯著增加。因此，公開的內(nèi)容還提供了使蛋白A親和柱和樹脂再生和消毒的消毒溶液和方法。緩沖液通常含有約100至500mM檸檬酸鈉、約10至30mM NaOH和約0. 5至3%(v/v)苯甲醇，并具有約pH 10至13范圍內(nèi)的pH。緩沖液還可以可選地包括其他組分，如鹽和/或洗滌劑。檸檬酸鈉和苯甲醇對于保護蛋白A樹脂免受NaOH破壞和增強殺微生物活性均很重要。在具體實施方式
中，蛋白A消毒緩沖液包含約200mM檸檬酸鈉、約20mM NaOH和約1% (v/v)苯甲醇。如5. 4.2節(jié)所描述，含有苯甲醇和氫氧化鈉的消毒溶液具有有益的抗微生物效果，并可以用于在任何抗體純化過程中對蛋白A柱進行消毒。消毒緩沖液可以用于在分批式過程中對蛋白A層析樹脂進行消毒，其中用過量的(如I. 5-2X體積)消毒緩沖液清洗樹脂，隨后在過量的(如I. 5-2倍體積)消毒緩沖液中孵育約30-45分鐘，隨后用平衡緩沖液或儲存緩沖液平衡。消毒緩沖液還可以用于對制備好的蛋白A層析柱進行消毒，其中用過量的(如I. 5-2倍柱體積)消毒緩沖液以適宜流速(如約110-190cm/hr或135-165cm/hr)對柱進行清洗,使柱在零流動的條件下保持約30-40min,隨后用平衡緩沖液或儲存緩沖液對柱進行清洗。適宜的平衡和儲存緩沖液描述于0節(jié)中。用本文描述的消毒緩沖液對蛋白A柱進行消毒使單批樹脂可以使用的純化次數(shù)顯著增加。如用常規(guī)NaOH緩沖液消毒(如50mM NaOH,0. 5M NaCl)時，單批蛋白A樹脂通常僅可維持約30個純化循環(huán)，而用本文描述的消毒緩沖液消毒的蛋白A柱可以使用多于100個純化循環(huán)。盡管不希望受任何操作理論的束縛，據(jù)信本文描述的消毒緩沖液部分地保護了經(jīng)固定化的蛋白A免受NaOH誘導的降解，從而使樹脂的使用壽命增加。因此，盡管預期對所有蛋白A樹脂都有改善，包括使用設計為抵抗NaOH降解的蛋白A突變株的那些(如MabSuRe樹脂)，然而當用于對使用未修飾的經(jīng)固定化蛋白A或未經(jīng)改造為對NaOH穩(wěn)定的蛋白A的蛋白A樹脂和柱進行消毒時，本文描述的消毒緩沖液特別有益。公開的內(nèi)容進一步提供了包括使用蛋白A親和樹脂進行多于30、多于35或多于40個抗體純化運行以及在一些情況下高達50個或高達100個蛋白純化循環(huán)的方法，其包括如本文中所公開進行純化運行并用消毒溶液清洗樹脂。如上所述，達珠單抗與活化的而非靜息的T和B淋巴細胞上表達的的⑶25特異性結合，并阻斷IL-2與CD25的結合，從而抑制高親和力IL-2受體復合物的形成，抑制活化的T-和B-細胞的增殖。本文中描述的DAC組合物和制劑，特別是DAC HYP組合物和制劑，同樣與⑶25特異性結合并顯示類似的生物學性質。因此本文中描述的DAC組合物和制劑，特別是DAC HYP,因而可以用于通常針對達珠單抗特別是ZENAPAX描述的任何測試和治療方法中。因此，本文公開的內(nèi)容還提供了利用本文中描述的DAC組合物和制劑，特別是DACHYP組合物和高濃度穩(wěn)定液體制劑抑制活化的T-和B-細胞增殖的方法，其在體外應用中和體內(nèi)作為治療方法來治療活化的T-和B-細胞增殖在其中發(fā)揮作用的疾病，如治療和預防同種異體移植物排異，治療葡萄膜炎和治療多發(fā)性硬化癥。該方法通常包括使活化的T-和/或B-細胞與足以抑制其增殖的量的本文中描述的達珠單抗組合物或制劑接觸。對于治療方法，該方法通常包括對受試者施用一定量的達珠單抗組合物，如本文中描述的DAC HYP組合物或高濃度DAC制劑，以提供治療效果。在一個具體的實施方式中，達珠單抗組合物和制劑可以單獨或與其他藥劑如3干擾素聯(lián)合用于治療多發(fā)性硬化癥。本文描述的DAC組合物可以每周至每月(如每周、每兩周、每月兩次、每四周或每月)以75mg 至 300mg (如 75mg、lOOmg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg 或 300mg)或lmg/kg至4mg/kg范圍內(nèi)的劑量對患者皮下施用。組合物可以提供于便于皮下使用的預充注射器中，優(yōu)選以100mg/mL± 10-15%或150mg/mL± 10-15%的達珠單抗額定濃度。還可以對經(jīng)濃縮的DAC組合物進行稀釋以用于靜脈施用。3.附圖簡述圖I提供了 DAC-HYP輕鏈cDNA (·SEQ ID NO : I)和已翻譯的氨基酸序列(SEQ IDNO 2) o粗體、下劃線的天門冬氨酸(D)殘基是經(jīng)恰當加工的成熟蛋白的首個氨基酸，該殘基上游的氨基酸序列對應于信號序列。圖2提供了 DAC-HYP輕鏈cDNA (SEQ ID NO :3)和已翻譯的氨基酸序列(SEQ IDNO 4) 0粗體、下劃線的谷氨酰胺(Q)殘基是經(jīng)恰當加工的成熟蛋白的首個氨基酸，該殘基上游的氨基酸序列對應于信號序列。圖3A-圖3D共同提供了載體pHAT. IgGl. rg. dE的全長核苷酸序列(SEQ ID NO 5)。圖3E提供了可以用于選擇高產(chǎn)生產(chǎn)株的dESV40啟動子(SEQ ID NO 12)的具體實施方式
。圖4A-4B提供了載體pHAT. IgGl. rg. dE的示意圖(圖4A)，其源于經(jīng)調(diào)節(jié)以表達任何重和輕鏈基因或甚至非抗體多肽的載體pABX. gpt(圖4B)。圖5提供了 DAC HYP的示例性生產(chǎn)過程。圖6展示了蛋白A親和層析過程中產(chǎn)物級分的UV(280nm)、pH和電導率監(jiān)測。圖7展示了 Q-Sepharose層析過程中產(chǎn)物級分的UV (280nm)、pH和電導率監(jiān)測。圖8展示了 CM陽離子交換層析過程中產(chǎn)物級分的UV (280nm)、pH和電導率監(jiān)測。圖9提供了 DAC HYP超濾系統(tǒng)的示意性展示。圖10提供了 0-60分鐘的DAC HYP肽層析圖。參照譜是100mg/mL的DAC HYP制備品，批次I和批次2對應于150mg/mL的DAC HYP制備品。圖11提供了 55-115分鐘的DAC HYP肽層析圖。參照譜是100mg/mL的DAC HYP制備品，批次I和批次2對應于150mg/mL的DAC HYP制備品。圖12提供了 110-170分鐘的DAC HYP肽層析圖。參照譜是100mg/mL的DAC HYP制備品，批次I和批次2對應于150mg/mL的DAC HYP制備品。圖13提供了 DAC HYP 150mg/mL批次批次I和批次2的覆蓋圓二色光譜。參照是100mg/mL 的 DAC HYP 制備品。圖14A-圖14B分別提供了覆蓋的零級紫外光譜和覆蓋的二級導數(shù)紫外光譜。參照譜是100mg/mL的DAC HYP制備品，批次I和批次2對應于150mg/mL的DAC HYP制備品。所有三種光譜顯示于圖14A和圖14B的每一個中，但是一旦相互覆蓋即以單個光譜出現(xiàn)。圖15A-圖15B分別提供了全比例和擴展比例的大小排阻層析圖。參照譜是IOOmg/mL的DAC HYP制備品，批次I和批次2對應于150mg/mL的DAC HYP制備品。圖16是DAC HYP聚集作為時間函數(shù)的制圖。圖17顯示了還原的和非還原的SDS-PAGE (分別是左圖和右圖)。參照譜是IOOmg/mL的DAC HYP制備品，批次I和批次2對應于150mg/mL的DAC HYP制備品。圖18顯示了 DAC HYP的陽離子交換層析圖。參照譜是100mg/mL的DAC HYP制備品，批次I和批次2對應于150mg/mL的DAC HYP制備品。峰標記對應于不同的N-和C-末
端同等型。圖19顯示了從DAC HYP上酶切下的N-連接寡糖的HPLC層析圖。參照譜是IOOmg/mL的DAC HYP制備品，批次I和批次2對應于150mg/mL的DAC HYP制備品。圖20顯示了 DAC HYP的ADCC反應曲線。參照譜是100mg/mL的DAC HYP制備品，批次I和批次2對應于150mg/mL的DAC HYP制備品。圖21顯示了從DAC HYP (下圖)和ZENAPAX DAC (上圖)釋放的N-連接寡糖的HPLC層析圖，其展示它們不同的糖基化譜。圖22A-圖22B提供了兩種DAC HYP制備品(稱作DAC HYP批次3和DAC HYP批次4)、DAC Penzuburg和ZENAPAX DAC的ADCC活性之間的比較，其中利用效應細胞對靶細胞比率可變的ADCC測試方式(圖22A)以及抗體濃度可變的ADCC測試方式(圖22B)。圖23 提供了 DAC HYP、DAC Penzuburg 和 ZENAPAX DAC 電荷同等型的比較。4.發(fā)明詳述本文公開的內(nèi)容在其他事物中提供了具有特定性質的DAC組合物、在不同溫度下 穩(wěn)定儲存的特別可用于某些施用方式的高濃度DAC制劑、可用于生產(chǎn)DAC組合物的載體和宿主細胞、可用于生產(chǎn)DAC組合物的經(jīng)優(yōu)化的培養(yǎng)基肉湯和培養(yǎng)條件、純化DAC組合物和高濃度DAC制劑的方法，以及利用DAC組合物和高濃度制劑以例如抑制活化的T-和/或B-細胞增殖以及治療和/或預防活化的T-和/或B-細胞所介導的疾病(如多發(fā)性硬化癥)的方法。本文中使用的達珠單抗(DAC)是指具有圖I中展示的輕(VL)鏈序列(SEQ ID NO 2的位置21-233)和圖2中展示的重(VH)鏈序列(SEQ ID NO 4的位置20-465)的人源化IgGl單克隆抗體。DAC的⑶R序列如下VlCDR#I SASSSISYMH (SEQ ID NO 6)VlCDR#2 T T S N L A S (SEQ ID NO :7)
VlCDR#3 HQRSTYPLT (SEQ ID NO :8)VhCDR#1 S Y R M H (SEQ ID NO :9)VhCDR#2 YINPSTGYTEYNQKFKD (SEQ ID NO :10)
VhCDR#3 G G G V F D Y (SEQ ID NO :11)文獻中已經(jīng)報導了某些達珠單抗分子，一種具體形式的DAC之前由Hoffman LaRoche公司以ZENAPAX的商品名上市銷售,其作為免疫療法(包括環(huán)孢素和皮質類固醇)的佐劑用于預防腎移植患者中的同種異體移植物排斥。以ZENAPAX的商品名銷售的DAC形式在本文中被稱為“ZENAPAX DAC”。德國Penzberg的一個機構生產(chǎn)的另一種形式的DAC,盡管從未市售，已經(jīng)用于某些臨床試驗中。這種形式的DAC在本文中被稱為“DAC Penzberg”。如本文中所描述，本文公開的內(nèi)容部分地涉及新形式的DAC，其具有不同于，在一些情況下優(yōu)于ZENAPAX DAC和DAC Penzberg的特性和性質的特性和性質。因此，本文公開的內(nèi)容部分地涉及新的DAC組合物。新DAC組合物的特征在于如簡述部分中更完整描述的 一個或多個以下特征(I)特征性pE/Q和/或Q/VHS N-末端同等型；(2)以兩個主峰和一個次要峰為特征的均一的N-連接寡糖譜；(3)與ZENAPAX DAC和DAC Penzberg相比降低的ADCC細胞毒性；和(4)當配制為高達150±10_15%的額定濃度時具有低水平的聚集體形式(< 3% ) o具有一個或多個這些特性和/或性質的DAC組合物在本文中被稱為“DAC HYP”組合物。為了列舉本文中描述的本發(fā)明的多個方面和特征，描述了具有所有四項上述性質的具體DAC HYP，以及具體組合物和其生產(chǎn)和純化方法。然而，將要理解的是，DAC HYP組合物不需要具有所有四項上述特性以落入本文公開的范圍內(nèi)。在具體實施方式
中，DAC HYP具有上述特性⑴至⑷中的至少兩項(如至少⑴和⑵，⑴和⑶，⑴和⑷，⑵和⑶，
(2)和⑷或(3)和⑷的組合)或上述特性⑴至⑷中的至少三項(如至少⑴、⑵和
(3)，(I)、(2)和(4)，(I)、(3)和(4)，⑵、(3)和(4)的組合)。當配制為IOOmg+10-15%或甚至150±10-15%的濃度時，這樣的DAC HYP組合物還可以具有< 3%的聚集體、< 2%的聚集體以及甚至更低水平，如< I %的聚集體。此外，盡管本文中描述的發(fā)明的某些方面和實施方式使用DAC HYP進行展示和列舉，技術人員將領會的是，其不限于DAC HYP，并通常可用于達珠單抗組合物中，也不限于具有與DAC相似的⑶25特異性結合性質的IgG2、IgG3、和IgG4抗-⑶25抗體以及未經(jīng)人源化的適合施用于人體的抗-⑶25抗體。這些多種不同的抗⑶25抗體在本文中被稱為“DAC類似物”。這樣的DAC類似物常常包括上面提及的6個DAC⑶R，但可以包括其他⑶R序列?？梢岳脴藴实臏y試和方法確認DAC HYP組合物的特性和性質。例如可以利用陽離子交換層析并在220nm下檢測來評估N-末端和C-末端同等型譜。在一種具體的方法中，100 ii L測試樣品(溶于緩沖液A中的lmg/mL抗體)在室溫下，在裝配ProPac WCX-10G保護柱(Dionex公司)的ProPac WCX-10柱(Dionex公司)上利用以下分離梯度進行解析(柱用緩沖液A平衡)
權利要求
1.經(jīng)修飾的NSO細胞，其已經(jīng)適應于在無血清和膽固醇的培養(yǎng)基中生長并被改造以表達重組蛋白，所述細胞當生長于無血清和膽固醇的培養(yǎng)基中時能夠在10天分批補料方法中在100L培養(yǎng)中達到超過100mg/L/天重組蛋白的體積生產(chǎn)力。
2.權利要求I的經(jīng)修飾的NSO細胞，其能夠達到超過以下的體積生產(chǎn)力 (a)當生長于無膽固醇和動物衍生組分的培養(yǎng)基中時在10天分批補料方法中在1，000L培養(yǎng)中100mg/L/天重組蛋白； (b)當生長于無膽固醇和動物衍生組分的培養(yǎng)基中時在10天分批補料方法中在16，000L培養(yǎng)中100mg/L/天重組蛋白； (c)在13天分批補料方法中在至少100L培養(yǎng)中200mg/L/天重組蛋白； (d)當生長于無膽固醇的培養(yǎng)基中時在13天分批補料方法中在1，000L培養(yǎng)中200mg/L/天重組蛋白； (e)當生長于無血清和膽固醇的培養(yǎng)基中時在10天分批補料方法中在16，000L培養(yǎng)中100mg/L/天重組蛋白。
3.權利要求I的經(jīng)修飾的NSO細胞，其中所述分批補料方法包括按照以下時間表加入補料培養(yǎng)基，其中加入的體積代表初始細胞培養(yǎng)體積的百分數(shù):
4.權利要求I的經(jīng)修飾的NSO細胞，其用可用于表達抗⑶25單克隆抗體的核酸穩(wěn)定地轉染，可選地其中抗⑶25單克隆抗體包含序列對應于SEQ ID NO :2位置21-233的Vl鏈以及序列對應于SEQ ID NO 4位置20-465的VH鏈。
5.生產(chǎn)重組蛋白的方法，其包括培養(yǎng)權利要求I的經(jīng)修飾的NSO細胞(a)在10天分批補料方法中在100L、1，000L或16，000L培養(yǎng)中能夠產(chǎn)生至少100mg/L/天重組蛋白或在13天分批補料方法中在100L、1，000L或16，000L培養(yǎng)中產(chǎn)生至少200mg/L/天重組蛋白的條件下； (b)無血清和膽固醇存在，以及可選地無環(huán)庚三烯酚酮和氫化可的松存在； (c)在含有10-35g/L葡萄糖的基礎和/或補料培養(yǎng)基中；或 (d)在含有15g/L葡萄糖的基礎培養(yǎng)基和/或含有28g/L葡萄糖的補料培養(yǎng)基中，可選地其中所述基礎培養(yǎng)基由PFBM2±10%或PFFM3±10%的組分構成，并且其中所述細胞在基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-3天，接著在補料培養(yǎng)基中培養(yǎng)10-13天。
6.可用于重組表達目標蛋白的載體，其包括驅動在哺乳動物細胞中可操作的選擇標記表達的弱啟動子以及驅動目標蛋白表達的強啟動子，可選地其中所述載體是PAbX. gpt或pHAT. IgGl. rg. dE和/或所述目標蛋白是(a)治療性抗體；(b)抗CD25抗體；(c)包含達珠單抗(dacIizumab)⑶R的抗⑶25抗體；或(d)達珠單抗。
7.獲得具有高目標蛋白體積生產(chǎn)力的哺乳動物宿主細胞的方法，其包括用權利要求6的載體轉染細胞，并選擇能夠在10天分批補料方法中在100L、I, 000L或16，000L培養(yǎng)中產(chǎn)生至少100mg/L/天目標蛋白或能夠在13天分批補料方法中在100L、1，000L*16，000I^§養(yǎng)中產(chǎn)生至少200mg/L/天重組蛋白的細胞。
8.包含達珠單抗的組合物，其中達珠單抗的特征在于存在pE/Q重鏈N-連接的同等型和/或Q/VHS重鏈N-末端同等型，可選地其中所述pE/Q重鏈N-末端同等型占達珠單抗的約3-17%、約3-15%、約6-15%、約5-15%、約5-12%或約7-12%，或可選地其中所述Q/VHS重鏈N-末端同等型占達珠單抗的約1-15%或約3-12%。
9.權利要求8的組合物，其中所述達珠單抗重鏈存在于以下N-末端同等型中
10.權利要求8的組合物，其中所述達珠單抗的特征在于陽離子交換層析同等型譜基本與圖18類似，可選地其中所述達珠單抗是DAC HYP。
11.包含達珠單抗的組合物，其中所述達珠單抗的特征在于N-連接的糖基化HPLC譜含有兩個主峰，一個對應于寡糖GO-GlcNAc，一個對應于寡糖G0，其中這兩個峰合并的AUC占所有峰的總AUC的約75-100%、約80-100%、約85-100%或約88-99. 5%，可選地其中 (a)所述GO-GIcNAc峰的AUC占所有峰的總AUC的約5-20%、約5-18%、約7-15%或約6-16%，所述GO峰的AUC占所有峰的總AUC的約70-99. 2%、約75-92%、約75-90%、約78-90%或約81-88%，并且可選地，其中N-連接的糖基化譜具有少于約3%的Man5或少于約 0. 5 % 的 G2、Man6 和 / 或 Man7 ； (b)所述N-連接的糖基化譜含有對應于唾液酸化寡糖的第三個峰，所述唾液酸化寡糖峰的AUC占所有峰的總AUC的I %或更少，或其中N-連接的糖基化譜含有對應于寡糖Gl的第三個峰，所述Gl峰的AUC占所有峰的總AUC的少于約10%、少于約5%、少于約4%、少于約3%或約1-5%或約1-4%或約1-3% ； (c)所述N-連接糖基化譜含有對應于Man5、Man6和Man7糖型的峰，其總共少于總AUC的約6% ;或(d)所述達珠單抗具有與圖19或圖21下圖基本相似的N-連接的糖基化HPLC譜。
12.包含達珠單抗的組合物，如在體外細胞測定法中所測量，其顯示(a)低于30%、低于25%、低于20%、低于15%、低于10%或低于5%的ADCC平均細胞毒性或(b)5_30%、10-30 %、10-25 %或15-25 %的ADCC平均細胞毒性，所述體外細胞測定法利用來自至少3個健康供體的效應細胞和以KU225K6作為靶細胞，達珠單抗?jié)舛葹镮 U g/mL,效應細胞與靶細胞的比率為約25 1，可選地其中所述測試利用來自至少6個或至少10個健康供體的效應細胞。
13.權利要求12的組合物，其中所述達珠單抗是DACHYP。
14.可用于制備達珠單抗藥物配制劑的組合物，其包含約150-190mg/mL達珠單抗和一定量的賦形劑，以使用稀釋緩沖液對所述組合物進行稀釋得到經(jīng)稀釋的組合物，所述經(jīng)稀釋的組合物含有約85-165mg/mL或85_115mg/mL或150±15mg/mL達珠單抗，并具有約267-327m0sm/kg范圍內(nèi)的摩爾滲透壓濃度和25°C時約pH 5. 8-6. 2范圍內(nèi)的pH，并且如通過大小排阻層析所測量，其中至少約95%的達珠單抗是單體形式。
15.組合物，其包含 (a)約4至15mg/mL達珠單抗,其中0.I %或更少的達珠單抗是聚集體形式,可選地其中所述組合物通過在弱陽離子交換樹脂上通過柱層析對含有約4到15mg/mL達珠單抗、其中上至2. 5%的達珠單抗是聚集體形式的達珠單抗組合物進行純化而獲得；或(b)約85_165mg/mL 或約 85_115mg/mL 或約 135_165mg/mL 達珠單抗；和約0. 02-0. 04%(w/v)聚山梨酯80,其中所述組合物具有約267-327m0sm/kg范圍內(nèi)的摩爾滲透壓濃度和25°C時約pH 5. 8-6. 2范圍內(nèi)的pH，并且如通過大小排阻層析所測量，至少約95%或至少約99%的達珠單抗是單體形式，其中所述組合物適合施用于人，可選地其中所述組合物基本由約100mg/mL或約150mg/mL達珠單抗、約40mM琥拍酸鈉、約IOOmM氯化鈉和約0. 03%(w/v)聚山梨酯80組成，并在25°C時具有約6. 0的pH。
16.適合皮下施用的藥物組合物，其包含約85-165mg/mL、約85_115mg/mL或約135-165mg/mL達珠單抗，其中在約2_8°C范圍內(nèi)的溫度下儲存約12個月時間后聚集體形式的達珠單抗的百分數(shù)不超過約2 %或約3 %，或者在約2-8°C范圍內(nèi)的溫度下儲存約18個月時間后不超過約3%。
17.從細胞培養(yǎng)物中收獲重組蛋白的方法，其包括步驟 (i)將表達并分泌重組蛋白的細胞培養(yǎng)物的pH調(diào)節(jié)至約pH4. 5-5. 5范圍內(nèi)的pH ; (ii)將經(jīng)PH調(diào)節(jié)的細胞培養(yǎng)物在約4至15°C范圍內(nèi)的溫度下孵育約30-90分鐘；并 (iii)將孵育后的經(jīng)PH調(diào)節(jié)的細胞培養(yǎng)物離心，以除去細胞碎片。
18.生產(chǎn)經(jīng)純化的達珠單抗組合物的方法，其包括步驟 (i)將達珠單抗從達珠單抗粗制品中吸收到親和層析樹脂上； (ii)用清洗緩沖液清洗親和樹脂，以去除污染物； (iii)用洗脫緩沖液洗脫已吸收的達珠單抗； (iv)通過將pH調(diào)節(jié)至約pH3-4范圍內(nèi)的pH并將經(jīng)pH調(diào)節(jié)的洗脫物在特定溫度下孵育足以使病毒失活的一段時間，從而使洗脫物中的病毒失活； (V)將病毒失活的洗脫物中和至約pH 7. 7-7.9(25°C下測量)范圍內(nèi)的pH或約pH7.7-8.5(25°〇下測量)范圍內(nèi)的pH; (vi)使經(jīng)中和的洗脫物流過強陰離子交換層析樹脂； (Vii)使步驟(Vi)的洗脫物中的達珠單抗吸收到弱陽離子交換層析樹脂上；和 (Viii)從弱陽離子交換層析樹脂上將已吸收的達珠單抗洗脫下來；可選地，包括步驟 (ix)對步驟(Viii)中洗脫下的達珠單抗組合物進行過濾，以去除病毒；和 (x)通過超濾來對經(jīng)過濾的溶液進行濃縮，以獲得包含約85-180mg/mL達珠單抗的經(jīng)純化的達珠單抗組合物。
19.權利要求18的方法，其中所述達珠單抗粗制品從細胞培養(yǎng)物中收獲，可選地利用權利要求17的方法。
20.權利要求18的方法，其中進行步驟(i)至(X)，其進一步包括用稀釋緩沖液對經(jīng)純化的達珠單抗組合物進行稀釋以獲得包含約85-165mg/mL達珠單抗和約0. 02-0. 04% (w/v)聚山梨酯80的組合物的步驟，其中所述組合物具有約267-327m0sm/kg范圍內(nèi)的摩爾滲透壓濃度和25°C時約pH 5. 8-6. 2范圍內(nèi)的pH，并且如通過大小排阻層析所測量，至少約95 %的達珠單抗是單體形式，可選地，其中所獲得的組合物具有少于50ppm的來自達珠單抗重組來源的宿主細胞蛋白、少于IOppm的蛋白A，并且組合物中不多于3%的達珠單抗是聚集體形式。
21.培養(yǎng)基，其是基礎培養(yǎng)基PFBM2或補料培養(yǎng)基PFFM3。
22.達珠單抗組合物，其通過包括在達珠單抗分泌到培養(yǎng)基中的條件下培養(yǎng)根據(jù)權利要求I的宿主細胞的步驟的方法而獲得，可選地，其中所述方法進一步包括從細胞培養(yǎng)基中分離所分泌的達珠單抗的步驟。
23.用于對蛋白A親和層析樹脂進行消毒的緩沖液，其包含約100-500mM檸檬酸鈉、約10-30mM NaOH 和約 0.5-3% (v/v)苯甲醇。
24.對蛋白A親和層析柱進行消毒的方法，其包括用權利要求23的消毒緩沖液以足以使柱消毒的流速和時間對柱進行清洗，可選地，其中用約I. 8倍柱體積的消毒緩沖液以約150cm/hr的流速對柱進行清洗，經(jīng)清洗的柱不流動孵育約30-45分鐘，接著用平衡緩沖液平衡。
25.治療患有多發(fā)性硬化癥的患者的方法，其包括對患者施用足以提供治療益處的量的 DAC HYP。
26.權利要求25的方法，其中施用DACHYP組合物 (a)靜脈內(nèi)； (b)以對應于約0. 8-0. 9mg/kg 或約 lmg/kgDAC HYP 的量； (c)每周一次,持續(xù)至少6周、至少12周、至少24周時間； (d)以單一療法；或 (e)根據(jù)(a)至⑷的任意組合。
27.權利要求26的方法，其中DACHYP以單一療法施用，并且所述患者已經(jīng)對之前^-干擾素的治療無應答或者已經(jīng)終止了之前P-干擾素的治療。
28.權利要求26的方法，其中DACHYP輔佐P -干擾素施用。
29.權利要求25的方法，其中施用DACHYP組合物 (a)皮下； (b)以對應于約lmg/kgDAC HYP的量，可選地每2周一次，或以對應于約2mg/kg DACHYP的量,可選地每4周一次； (c)持續(xù)總共約24周時間；或 (d)根據(jù)(a)至(c)的任意組合。
30.權利要求29的方法，其中所述DACHYP組合物以對應于75mg至300mg DAC HYP或150mg或300mg的量施用。
31.權利要求30的方法，其中所述DACHYP組合物每4周施用一次，可選地持續(xù)總共至少48周時間。
32.權利要求30的方法，其中所述DACHYP以單一療法施用，可選地，其中所述患者已經(jīng)對之前￠-干擾素的治療無應答或者已經(jīng)終止了之前￠-干擾素的治療。
33.權利要求30的方法，其中所述DACHYP輔佐P -干擾素施用。
全文摘要
本文公開的內(nèi)容涉及適合皮下施用的達珠單抗組合物及其制造方法。
文檔編號C07K1/18GK102796705SQ20121024726
公開日2012年11月28日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權日2011年5月27日
發(fā)明者T·哈特曼, P·W·索爾, J·E·伯基, M·C·韋森, P·Y·黃, T·J·羅賓遜, B·帕特里奇, J·Y·索 申請人:雅培生物醫(yī)療公司