專利名稱：肽、該肽的用途和生產(chǎn)方法以及固定有該肽的固相和其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型肽、該肽的用途和生產(chǎn)方法，尤其涉及對親水性的固相表現(xiàn)出特異性結(jié)合功能的肽、該肽的用途和生產(chǎn)方法。此外 ，本發(fā)明涉及能夠用于使用固相化法檢出或測定化合物的肽、和利用該肽檢出或測定化合物的方法。此外，本發(fā)明涉及包含形成抗原結(jié)合部位的可變區(qū)的肽，涉及免疫球蛋白分子、以及包含可變區(qū)的單鏈抗體(scFv)、多價單鏈抗體(80$￥)11)、恒定區(qū)融合型單鏈抗體(80 ￥- 0)、？3&片段或F(ab’ )2片段以及固定有這些肽的固相和該固相的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
抗體(免疫球蛋白)是與抗原特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，是生物體內(nèi)的體液免疫中的主角。圖6的(a)為表示抗體(免疫球蛋白)基本結(jié)構(gòu)的示意圖?？贵w分子61是2條分子量5萬 7萬的重鏈(H鏈)62和2條分子量2. 3萬的輕鏈(L鏈)63這4條鏈狀多肽通過二硫鍵和非共價鍵結(jié)合而成的，整體呈Y字型。重鏈(H鏈)62由4或5個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，N末端側(cè)配置有可變區(qū)(Vh)的結(jié)構(gòu)域，朝向C末端側(cè)配置有3 4個恒定區(qū)(Ch1、Ch2、Ch3、Ch4)的結(jié)構(gòu)域。圖6的(8)中，示出由4個結(jié)構(gòu)域(￥11、011、012、013)構(gòu)成的重鏈62。輕鏈(L鏈)63由2個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，N末端側(cè)配置有可變區(qū)(')的結(jié)構(gòu)域，C末端側(cè)配置有恒定區(qū)(CJ的結(jié)構(gòu)域。重鏈62和輕鏈63的可變區(qū)(Vh和被配置于N末端側(cè)的2處，兩者一體化，形成與抗原特異性結(jié)合的立體抗原結(jié)合部位。因此，抗體的特異性取決于重鏈和輕鏈的可變區(qū)(Vh和的氨基酸序列和組合，可變區(qū)(Vh和的氨基酸序列、組合根據(jù)所對應的抗原不同而不同。在各類型或亞型中，重鏈和輕鏈的恒定區(qū)(CH1、CH2、CH3、CH4和CJ為幾乎恒定的結(jié)構(gòu)?？贵w分子61被蛋白酶中的木瓜蛋白酶在重鏈的ChI和Ch2結(jié)構(gòu)域之間的鉸鏈部64處分解，如圖6的(b)所示，被分解為2個Fab片段65和一個Fe片段66。通過另一種蛋白酶胃蛋白酶分解抗體分子61時，如圖6的(c)所示，能獲得的是2個Fab片段65在鉸鏈部64通過二硫鍵連接而成的結(jié)構(gòu)即F(ab’)2片段67。Fab片段65、F(ab’)2片段67具有由重鏈和輕鏈的可變區(qū)(Vh和 ')形成的抗原結(jié)合部位，因此，具有針對抗原的特異性，能夠用于抗原抗體反應。進而，將重鏈的可變區(qū)(Vh)和輕鏈的可變區(qū)(')通過連接肽69連接而成的結(jié)構(gòu)即單鏈抗體(scFv) 68,也能形成由重鏈和輕鏈的可變區(qū)(Vh和形成的立體抗原結(jié)合部位，因此，具有針對抗原的特異性，能夠用于抗原抗體反應。圖6的(d)是表示單鏈抗體(scFv)68的基本結(jié)構(gòu)的示意圖。圖6的(d)中，重鏈的可變區(qū)(Vh)的C末端通過鏈狀的連接肽69而連接到輕鏈的可變區(qū)(')的N末端。由于抗原抗體反應中抗原和抗體的特異性強，如果抗原結(jié)合部位發(fā)生變化則對應的抗原也會變化，因此需要對100萬種以上的重鏈和輕鏈的可變區(qū)(V1^P ')的組合進行基礎(chǔ)性實驗以驗證其顯示何種抗原抗體反應 。此外，利用抗原和抗體的特異性強這一點，可將抗原抗體反應用于各種用途和領(lǐng)域中。一直以來，作為檢出或測定微量物質(zhì)的方法，已知有利用了抗原和抗體間的特異性親和力的免疫測定法(immunoassay)。免疫測定法由于抗原抗體反應的多樣性而能夠分析各種生物體成分，已被用于廣闊的領(lǐng)域。進而，已知的是，為了提高免疫測定法的測定靈敏度而使用放射性化合物、熒光物質(zhì)、酶等標記的各種方法，根據(jù)各自的標記而分別稱為放射免疫測定法(radioimmuno assay :RIA)、免疫突光測定法(fluorescence immunoassay FIA)、酶免疫測定法(ELISA :Enzyme_Linked ImmunoSorbent Assay ;也稱為酶聯(lián)免疫測定)等。尤其是，ELISA靈敏度高且定量性優(yōu)異，無需純化和前處理這些復雜步驟，是一種通用性高的檢出法，因此被用于醫(yī)療診斷、環(huán)境激素和殘留農(nóng)藥的定量、瘋牛病(BSE)檢查、蛋白質(zhì)組解析等各種分析中。這些免疫測定法中的微量測定中，利用了如下的固相化法利用物理吸附、化學結(jié)合而將抗原、抗體或酶等蛋白質(zhì)固定在試管、微孔板(microplate)等固相上。固相通常使用疏水性的塑料。疏水性的固相由于能通過疏水性相互作用而牢固結(jié)合蛋白質(zhì)，因此能夠應用于多種蛋白質(zhì)，從這點來看其是優(yōu)異的。目前，疏水性的塑料多用疏水性的聚苯乙烯(PS)。此外，任意一種免疫測定法中均需要多次進行吸附/反應處理和洗滌處理，至檢出目標物質(zhì)為止需要較長時間。在驗證抗原抗體反應的實驗中，通常也將抗體等固定在試管、微孔板等固相上進行實驗，也利用了固相化法。例如，ELISA大體分為直接吸附法、夾心法和競爭法，夾心法的ELISA的情況下，專利文獻I公開了如下內(nèi)容。第一，使針對目標物質(zhì)的抗體結(jié)合在固相上，然后多次洗滌固相。第二，使固相上殘留的未結(jié)合部位與不參與抗原抗體反應和酶反應的試劑(以下稱為“封閉劑”。)結(jié)合而進行封閉，使得其它試劑不會結(jié)合在固相表面，然后多次洗滌固相。第三，使包含目標物質(zhì)的試樣和固相上所結(jié)合的抗體反應，然后多次洗滌固相。第四，使二抗和目標物質(zhì)反應，然后多次洗滌固相。第五，使二抗和酶標記反應，然后多次洗滌固相。第六，使酶標記和底物反應，測定吸光度，檢出試樣中的目標物質(zhì)或測定濃度(參照專利文獻I的段落0039)。第四處理中用于反應的二抗如果使用的是經(jīng)過酶標記后的抗體，則不需第五處理。專利文獻I :日本特表2002-526777號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題如上所述，重鏈和輕鏈的可變區(qū)(V1^P 的組合甚至存在100萬種以上，為了驗證抗原抗體反應，需要進行海量的實驗。然而，抗體分子的分子量很大，為了生產(chǎn)抗體需要動物細胞，生產(chǎn)成本高。
此外，驗證實驗、免疫測定法等固相化法中，通常使用疏水性的塑料，是一種利用疏水性相互作用的結(jié)合，因此無法對抗原、抗體或酶等蛋白質(zhì)的何種部位與固相結(jié)合進行限定，與固相結(jié)合的部位會導致結(jié)構(gòu)變化、失活。例如，酶中的0 —乙酰絲氨酸硫化氫解酶A(0-acetyl serine sulfhydryrase_A)與疏水性聚苯乙烯結(jié)合的話,幾乎完全失活。進而，蛋白質(zhì)和固相的這種無序結(jié)合會導致測定靈敏度降低，測定精度也變差。如圖6所示，抗體分子61整體呈Y字形，在其上側(cè)的2個N末端側(cè)形成有由重鏈和輕鏈的可變區(qū)(V1^P ')形成的立體抗原結(jié)合部位。固定抗體時，如果C末端側(cè)垂直地接合在固相表面則抗原結(jié)合部位朝向外側(cè)，且立體上為正常的配置，因此，能夠進行抗原抗體反應。然而，如果N末端側(cè)與固相結(jié)合的話，至少發(fā)生結(jié)合的N末端側(cè)所配置的抗原結(jié)合部位無法與抗原反應。此外，在與固相結(jié)合時，抗原結(jié)合部位的立體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使得抗體變性，導致有時無法表現(xiàn)出抗原抗體反應。Fab片段65、F (ab’ )2片段67與抗體分子61相比分子量小,它們本身是能夠用大 腸桿菌、酵母等生產(chǎn)的，但抗原結(jié)合部位所占的比例高，因此無序地結(jié)合于固相表面的情況 下，無法表現(xiàn)出抗原抗體反應的可能性很高。至于單鏈抗體(scFv) 68,由于其基本僅由抗原結(jié)合部位構(gòu)成，能夠排除Fe區(qū)域、恒定區(qū)的影響，因此是一種優(yōu)選的作為用于研究抗原抗體反應的抗體方面的物質(zhì)形態(tài)，但對于固定是極不利的，即使以其本身的狀態(tài)固定在疏水性的基板上也幾乎不顯示抗原抗體反應。此外，通過通常公知的克隆化技術(shù)制造的蛋白質(zhì)，在分離、純化從而回收制造物即目的蛋白質(zhì)的工序中需要花費大量的時間和功夫。例如，使用大腸桿菌作為宿主的情況下，大腸桿菌內(nèi)不僅存在目的蛋白，而且存在各種雜質(zhì)。因此，培養(yǎng)大腸桿菌后，需要將大腸桿菌的菌體破碎并進行離心分離，從而獲取菌體內(nèi)可溶性組分，用柱對其純化而回收目的蛋白質(zhì)。此外，通過導入重組DNA而在宿主內(nèi)大量表達異種基因的情況下，為了避免生成的蛋白質(zhì)對宿主的不良影響，有時生成不溶且無活性的聚集物也就是包涵體(inclusionbody)。該包涵體(inclusion body)在通過離心分離而回收后，即使增溶也維持原狀沒有活性，因此，需要進行稱為重折疊的操作，以使蛋白質(zhì)活化、使蛋白質(zhì)的折疊結(jié)構(gòu)恢復正常狀態(tài)。進而，如上所述，免疫測定法需要進行多次吸附/反應處理和洗滌處理，檢出目標物質(zhì)需要較長時間，期望開發(fā)出能在短時間內(nèi)檢出或測定微量物質(zhì)的方法。本發(fā)明是為了解決上述課題和問題中的一個或幾個而進行的，提供一種能用于抗原抗體反應的包含可變區(qū)的肽、固定有這些肽的固相和該固相的生產(chǎn)方法。此外，本發(fā)明目的在于提供使生產(chǎn)效率提高的包含可變區(qū)的肽；即使進行固定也不易發(fā)生結(jié)構(gòu)變化和失活的包含可變區(qū)的肽；能更好地維持被固定的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、更好地保持活性且能夠用于免疫測定法的包含可變區(qū)的肽；使測定靈敏度提高且具有穩(wěn)定的測定精度并能夠用于免疫測定法的包含可變區(qū)的肽，或能夠用于與以前相比能夠在短時間內(nèi)檢出或測定微量物質(zhì)的方法的包含可變區(qū)的肽；以及固定有這些肽的固相和所述固相的生產(chǎn)方法。本說明書中還公開了新型的、有用的肽和該肽的用途。此外，本發(fā)明還公開了對親水性的固相表現(xiàn)出特異性結(jié)合功能的肽和該肽的用途。進而，本發(fā)明還公開了能夠用于使用固相化法檢出或測定化合物的肽和該肽的用途。
用于解決問題的手段為了達到前述目的，所述肽包含能形成抗原結(jié)合部位的可變區(qū)，在比重鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)或比輕鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)，具有對固相表現(xiàn)出特異性吸附功能的氨基酸序列。此外，本發(fā)明的肽包含能形成抗原結(jié)合部位的可變區(qū)，在比重鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)或比輕鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)，具有序列表中的序列號I 20所不的氨基酸序列中的任意一個序列。進而，本發(fā)明的肽優(yōu)選為單鏈抗體(scFv)、多價單鏈抗體(8(3$￥)11)、恒定區(qū)融合型單鏈抗體(80 ￥- 0)、？3&片段或F(ab’ )2片段。本發(fā)明的肽中，優(yōu)選前述氨基酸序列對親水性的樹脂表面表現(xiàn)出特異性吸附功
能，前述樹脂表面可以是親水性的聚苯乙烯表面。進而，更優(yōu)選的是，所述肽為前述重鏈和輕鏈這兩者具有前述氨基酸序列的單鏈抗體(scFv)、多價單鏈抗體(sc (Fv)n)、恒定區(qū)融合型單鏈抗體(scFv-Fc)、Fab片段或F(ab’)2片段。本發(fā)明的肽具有用于連接前述重鏈可變區(qū)和前述輕鏈可變區(qū)的連接肽，在前述連接肽和前述可變區(qū)之間或在前述連接肽內(nèi)具有前述氨基酸序列。此外，在本發(fā)明的得以純化的肽的生產(chǎn)方法中，使包含具有對固相表現(xiàn)出特異性吸附功能的氨基酸序列的肽和雜質(zhì)的溶液接觸前述固相表面，從而使前述肽直接吸附在前述固相表面，而將前述肽純化。進而，在本發(fā)明的得以復性的肽的生產(chǎn)方法中，使包含具有對固相表現(xiàn)出特異性吸附功能的氨基酸序列的變性的肽和變性劑的溶液接觸前述固相表面，從而使前述肽直接吸附在前述固相表面，而使前述變性的肽復性。在此，前述變性的肽可以是包涵體。在上述肽的生產(chǎn)方法中，前述肽包含能形成抗原結(jié)合部位的可變區(qū)，在比重鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)或比輕鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)，可以具有前述氨基酸序列。此夕卜，前述溶液可以包含生成了前述肽的宿主的破碎物、培養(yǎng)基或分泌物。并且，前述氨基酸序列可以使用序列表中的序列號I 20所示的氨基酸序列。此外，本發(fā)明中，也可以將下述基因?qū)胨拗髦行纬赊D(zhuǎn)化體，并使包含其生成物的溶液與前述固相表面接觸，從而使前述肽直接吸附在前述固相表面，而生產(chǎn)固定有肽的固相，所述基因包含編碼具有對固相表現(xiàn)出特異性吸附功能的氨基酸序列的肽的堿基序列。在此，前述肽包含能形成抗原結(jié)合部位的可變區(qū)，在比重鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)或比輕鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)具有對固相表現(xiàn)出特異性吸附功能的氨基酸序列，前述包含生成物的溶液可以包含前述宿主的破碎物，也可以包含前述宿主的培養(yǎng)基，還可以包含酵母分泌產(chǎn)生的分泌物。此外，本發(fā)明的對象也可以是包含編碼下述肽的堿基序列的基因、利用該基因制得的載體或?qū)胗性摶虻乃拗鳎鲭陌苄纬煽乖Y(jié)合部位的可變區(qū)，在比重鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)或比輕鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)，具有對固相表現(xiàn)出特異性吸附功能的氨基酸序列。此外，本發(fā)明的肽優(yōu)選為包含序列表中的序列號I所示的氨基酸序列的肽。此外，也可以是固定在免疫測定法中的固相且包含序列表中的序列號I所示的氨基酸序列的肽。這些序列號I所示的氨基酸序列也可以是序列表中的序列號2 10所示的氨基酸序列。前述固相可以具有親水性的樹脂表面，前述固相可以具有親水性的聚苯乙烯表面。前述免疫測定法可以是酶聯(lián)免疫測定。
此外，本發(fā)明還公開了 包含序列表中的序列號I所示的氨基酸序列的固定化酶、包含編碼序列表中的序列號I所不的氣基酸序列的喊基序列的基因、利用該基因制得的載體或?qū)胗性摶虻乃拗鳌２⑶?，這些序列號I所示的氨基酸序列也可以是序列表中的序列號2 10所示的氨基酸序列。發(fā)明效果本發(fā)明的肽對特定的固相表面顯示出優(yōu)異的結(jié)合性能，能夠直接固定在特定的固相，因此，能夠容易地分離、純化本發(fā)明的肽。即，本發(fā)明的肽在生產(chǎn)之后，即使不進行充分的純化，而僅使包含本發(fā)明的肽的溶液與特定的固相接觸，就能使本發(fā)明的肽直接結(jié)合在固相，能夠同時進行從溶液分離、純化本發(fā)明的肽和將其固定在固相。其結(jié)果是，能夠省去以前需要較長時間的分離、純化工序(例如，使用親和柱進行的純化工序)，能夠大幅縮短本 發(fā)明的肽從生產(chǎn)到固定在固相所需要的時間，因此，本發(fā)明的肽極大提高了生產(chǎn)效率。并且，在該過程中，生成的包涵體(inclusion body)狀態(tài)的蛋白質(zhì)、變性的蛋白質(zhì)還能進行重折疊。此外，本發(fā)明的肽能夠用于使用固相化法檢出或測定化合物。尤其是，免疫測定法中，與以前相比，能通過特異性吸附功能而縮短測定時間，并且能以保持原肽活性的狀態(tài)進行固定，能夠提高測定靈敏度、獲得穩(wěn)定的測定精度。


圖I是表示BSA存在下對親水性的聚苯乙烯表面的固定率的圖表；圖2的(a) (d)分別是表示Tween20的添加量為0、0. I、I、10%的條件下對親水性的聚苯乙烯板的結(jié)合性能的圖表；圖3的(a) (d)分別是表示Tween20的添加量為0、0. I、I、10%的條件下對疏水性聚苯乙烯板的結(jié)合性能的圖表；圖4的(a) (f)是表示多種雜質(zhì)存在下對親水性的聚苯乙烯板和疏水性聚苯乙烯板的結(jié)合性能的圖表；(a)是表示親水性的板(僅PBS)，(b)是表示親水性的板(PBS+Tween20), (c)是表示親水性的板(PBS+Tween20+BSA), (d)是表示疏水性的板(僅PBS), Ce)是表示疏水性的板(PBS+Tween20)，(f)是表示疏水性的板(PBS+Tween20+BSA)。圖5的(a) (f)是表示多種雜質(zhì)存在下對親水性的聚苯乙烯板和疏水性聚苯乙烯板的活性值的圖表；(a)是表示親水性的板(僅PBS)，(b)是表示親水性的板(PBS+Tween20), (c)是表示親水性的板(PBS+Tween20+BSA), (d)是表示疏水性的板(僅PBS), Ce)是表示疏水性的板(PBS+Tween20)，(f)是表示疏水性的板(PBS+Tween20+BSA)。圖6的(a)是表示抗體的基本結(jié)構(gòu)的示意圖，(b)是表示Fab片段和Fe片段的結(jié)構(gòu)的示意圖，(C)是表示F(ab’)2片段的結(jié)構(gòu)的示意圖，Cd)是表示單鏈抗體(scFv)的基本結(jié)構(gòu)的示意圖；圖7是表示BSA存在下對親水性的聚苯乙烯表面的固定率的圖表；圖8的(a)和(b)是表示多種雜質(zhì)存在下對親水性的聚苯乙烯板的活性值的圖表;圖9是表示BSA存在下對親水性的聚苯乙烯表面的固定率的圖表；圖10的(a)和(b)是表示多種雜質(zhì)存在下對親水性的聚苯乙烯板的活性值的圖表;圖11的(a)和(b)分別是表示培養(yǎng)本發(fā)明的肽和原肽而得的菌落中的菌體濃度，
(c)和(d)分別是表示本發(fā)明的肽和原肽的結(jié)合性能的圖表；圖12是表示添加各種培養(yǎng)基作為雜質(zhì)的狀態(tài)下對親水性的聚苯乙烯表面的結(jié)合性能的圖表；圖13是表示將本發(fā)明的氨基酸序列導入單鏈抗體時的活性值的圖表；圖14是表示本發(fā)明的氨基酸序列在單鏈抗體中的導入位置和活性值間的關(guān)系的圖表；圖15是表示本發(fā)明的氨基酸序列在單鏈抗體中的導入位置和活性值間的關(guān)系的圖表； 圖16是表示單鏈抗體的量和對親水性的聚苯乙烯基板的活性值間的關(guān)系的圖表;圖17是表示未純化的變性狀態(tài)的本發(fā)明的肽對聚苯乙烯基板的結(jié)合性能和活性值的圖表。
具體實施例方式下面詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明的肽具有對固相表現(xiàn)出特異性吸附功能的氨基酸序列(以下稱為“本發(fā)明的氨基酸序列”)。本發(fā)明的氨基酸序列為例如序列表中的序列號I 20所示的氨基酸序列(以下，分別稱為“本發(fā)明的氨基酸序列I” “本發(fā)明的氨基酸序列20”)。將具有本發(fā)明的氨基酸序列的肽稱為“本發(fā)明的肽”。本發(fā)明的氨基酸序列對特定的固相(例如，具有親水性的樹脂表面的固相)表現(xiàn)出特異性吸附功能，因此本發(fā)明的肽對特定的固相表面顯示出優(yōu)異的結(jié)合性能，能夠直接固定在特定的固相，因此能夠容易地分離、純化本發(fā)明的肽。即，本發(fā)明的肽在生產(chǎn)之后，即使不進行充分的純化，而僅使包含本發(fā)明的肽的溶液與特定的固相接觸，就能使本發(fā)明的肽直接結(jié)合在固相，能夠同時進行從溶液分離、純化本發(fā)明的肽和將其固定在固相的工序。其結(jié)果是，能夠省去以前需要較長時間的分離、純化工序(例如，使用親和柱進行的純化工序)，能夠大幅縮短本發(fā)明的肽從生產(chǎn)到固定在固相所需要的時間，因此，本發(fā)明的肽極大提高了生產(chǎn)效率。并且，在該過程中，生成的包涵體(inclusion body)狀態(tài)的蛋白質(zhì)、變性的蛋白質(zhì)還能進行重折疊。此外，本發(fā)明的肽還能夠用于使用固相化法檢出或測定化合物。對化合物的檢出或測定中所利用的抗原、抗體或酶導入本發(fā)明的氨基酸序列，從而能夠?qū)⒖乖?、抗體或酶直接固定在特定的固相，能夠進行化合物的檢出或測定。尤其是，本發(fā)明的肽優(yōu)選用于利用免疫測定法進行的微量物質(zhì)的檢出或測定中。進而，本發(fā)明的肽即使在雜質(zhì)存在下也能特異性地且本發(fā)明的氨基酸序列的導入位置優(yōu)先直接結(jié)合在特定的固相上，因此能夠在控制取向和結(jié)構(gòu)的狀態(tài)下固定在特定的固相上，因此與以前相比，能夠在保持原肽活性的狀態(tài)下進行固定，能夠提高測定靈敏度，獲得穩(wěn)定的測定精度。例如，應用于夾心法ELISA時，對與目標物質(zhì)顯示特異性抗原抗體反應的抗體導入本發(fā)明的氨基酸序列的肽，準備作為本發(fā)明的肽的抗體。第一，將該抗體直接結(jié)合在特定的固相后，多次洗滌固相。第二，使固相上殘留的未結(jié)合部位與封閉劑結(jié)合進行封閉后，多次洗滌固相。第三，使包含目標物質(zhì)的試樣與固相上所結(jié)合的作為本發(fā)明的肽的抗體反應后，多次洗滌固相。第四，使并非作為本發(fā)明的肽的二抗與目標物質(zhì)反應后，多次洗滌固相。第五，使二抗與酶標記反應后，多次洗滌固相。第六，使酶標記與底物反應，測定吸光度來檢出試樣中的目標物質(zhì)或測定其濃度。這樣，利用本發(fā)明的肽通過免疫測定法能夠進行化合物的檢出或測定。若作為第四處理中反應的二抗使用經(jīng)酶標記過的抗體，則不需要第五處理。此外，本發(fā)明的肽即使在封閉劑存在下也能特異性結(jié)合，因此上述第一處理中，通過使特定的固相與作為本發(fā)明的肽的抗體和封閉劑同時結(jié)合，能夠省略第二處理，能夠縮短化合物的檢出或測定時間。進而，最初在溶液中使作為本發(fā)明的肽的抗體與目標物質(zhì)進行抗原抗體反應形成免疫復合物后，將免疫復合物固定在特定的固相上，從而能夠?qū)崿F(xiàn)一種化合物的檢出或測定的新方法，其能夠顯著縮短化合物的檢出或測定時間。即，能夠通過一次處理來實現(xiàn)上述夾心法中的第一處理和第三處理。若溶液中還預先添加了封閉劑，則能夠通過一次處理來實現(xiàn)上述第一、第二和第三處理。更優(yōu)選的是，在作為本發(fā)明的肽的抗體和目標物質(zhì)形成免 疫復合物之后，在溶液中再與酶標記過的二抗進行抗原抗體反應，以形成更大的免疫復合物，將其固定在特定的固相上，則能夠通過一次處理來實現(xiàn)上述第一 第五處理。 本發(fā)明的肽即使在雜質(zhì)存在下也能特異性地且能在控制取向和結(jié)構(gòu)的狀態(tài)下直接固定在特定的固相上，因此，即使存在封閉劑、即使為免疫復合物的狀態(tài)，也能將免疫復合物固定，進行目標物質(zhì)的檢出或測定。加之，在溶液中不存在空間位阻，能極迅速地進行抗原抗體反應，因此與以前的固定狀態(tài)下的抗原抗體反應相比，能極大增加反應速度、提高測定靈敏度，能獲得穩(wěn)定的測定精度。此外，本發(fā)明的肽的其它用途是，使用酶作為本發(fā)明的肽的話，能夠以親水性的樹脂表面的固定化酶形式加以利用。通常，酶為水溶性的，因此利用時是一次性的，但通過將酶結(jié)合在固相而將其固定則能夠與水溶性的反應產(chǎn)物分離，能夠連續(xù)且反復地進行反應。如序列表中的序列號I所示，本發(fā)明的氨基酸序列I的序列如下從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RXXXRRXRR (R :精氨酸，X :異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、纈氨酸(V)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)、絲氨酸(S)或蘇氨酸(T)中的一個或多個的組合)。因此，本發(fā)明的氨基酸序列I中至少包括本發(fā)明的氨基酸序列2 10。本發(fā)明的氨基酸序列2是本發(fā)明的氨基酸序列I中的X全部為異亮氨酸(I)的序列，是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RIIIRRIRR (R:精氨酸、I :異亮氨酸)的序列。本發(fā)明的氨基酸序列3是本發(fā)明的氨基酸序列I中的X為丙氨酸(A)和異亮氨酸(I)的組合的序列，是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RAIARRIRR (R :精氨酸、A :丙氨酸、I :異亮氨酸)的序列。本發(fā)明的氨基酸序列4是本發(fā)明的氨基酸序列I中的X全部為亮氨酸(L)的序列，是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RLLLRRLRR (R :精氨酸、L :亮氨酸)的序列。本發(fā)明的氨基酸序列5是本發(fā)明的氨基酸序列I中的X全部為纈氨酸(V)的序列，是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RVVVRRVRR (R :精氨酸、V :纈氨酸)的序列。本發(fā)明的氨基酸序列6是本發(fā)明的氨基酸序列I中的X全部為丙氨酸(A)的序列，是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RAAARRARR (R :精氨酸、A :丙氨酸)的序列。本發(fā)明的氨基酸序列7是本發(fā)明的氨基酸序列I中的X全部為甘氨酸(G)的序列，是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RGGGRRGRR(R :精氨酸、G :甘氨酸)的序列。
如后述的實施例I 6所示，能夠確認的是，具有本發(fā)明的氨基酸序列2 7的肽均對特定的固相表面表現(xiàn)出特異性吸附功能。本發(fā)明的氨基酸序列2 7均為精氨酸(R)的配置為從N末端側(cè)起第1、5，6、8、9位，這是共通的，配置于其間的氨基酸(本發(fā)明的氨基酸序列I中的X)發(fā)生改變。本發(fā)明的氨基酸序列2，4 7配置了單一的氨基酸，本發(fā)明的氨基酸序列3則組合配置了丙氨酸(A)和異亮氨酸(I)。這些全部都顯示了共通的性質(zhì)，因此，可預測出，通過使本發(fā)明的氨基酸序列I中的X為異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、纈氨酸(V)、丙氨酸(A)或甘氨酸(G)中的一個或組合，能夠使其對特定的固相表面表現(xiàn)出特異性吸附功能。進而，本發(fā)明的氨基酸序列8是本發(fā)明的氨基酸序列I中的X全部為甲硫氨酸(M)的序列，是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RMMMRRMRR (R :精氨酸、M 甲硫氨酸)的序列。本發(fā)明的氨基酸序列9是本發(fā)明的氨基酸序列I中的X全部為絲氨酸(S)的序列，是從N末
端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RSSSRRSRR (R :精氨酸、S :絲氨酸)的序列。本發(fā)明的氨基酸序列10是本發(fā)明的氨基酸序列I中的X全部為蘇氨酸(T)的序列，是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RTTTRRTRR (R :精氨酸、T :蘇氨酸)的序列。如后述的實施例7 9所示，能夠確認的是，具有本發(fā)明的氨基酸序列8 10的肽均對特定的固相表面表現(xiàn)出特異性吸附功能。甲硫氨酸(M)、絲氨酸(S)或蘇氨酸(T)是在氨基酸(R - CH (NH2) COOH)的R基中包含硫、羥基(OH)的氨基酸，但在部分具有鏈狀飽和烴、為中性氨基酸這點上，與R基由鏈狀的飽和烴構(gòu)成的異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、纈氨酸(V)和丙氨酸(A)是共通的。此外，甲硫氨酸(M)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)是在R基中不含環(huán)狀結(jié)構(gòu)、芳香族化合物且在立體結(jié)構(gòu)方面體積較小的氨基酸，這一點上是共通的。因此，可以預測出，選擇甲硫氨酸(M)、絲氨酸(S)或蘇氨酸(T)作為本發(fā)明的氨基酸序列I中的X能夠獲得同樣的效果。進而，如序列表中的序列號11所示，本發(fā)明的氨基酸序列11是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為KGLRGWREMISL (賴氨酸(K)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、色氨酸(W)、精氨酸(R)、谷氨酸(E)、甲硫氨酸(M)、異亮氨酸(I)、絲氨酸(S)、亮氨酸(L))的序列。如序列表中的序列號12所示，本發(fā)明的氨基酸序列12是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為ADYLSRWGSIRN (丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、酪氨酸(Y)、亮氨酸(L)、絲氨酸(S)、精氨酸(R)、色氨酸(W)、甘氨酸(G)、絲氨酸(S)、異亮氨酸(I)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N))的序列。如序列表中的序列號13所示，本發(fā)明的氨基酸序列13是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為SRVHRAVLNGVS (絲氨酸(S)、精氨酸(R)、纈氨酸(V)、組氨酸(H)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、天冬酰胺(N)、甘氨酸(G)、纈氨酸(V)、絲氨酸(S))的序列。如序列表中的序列號14所示，本發(fā)明的氨基酸序列14是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RPPGVVRRYALG (精氨酸(R)、脯氨酸(P)、脯氨酸(P)、甘氨酸(G)、纈氨酸(V)、纈氨酸(V)、精氨酸(R)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、甘氨酸(G))的序列。如序列表中的序列號15所示，本發(fā)明的氨基酸序列15是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為VRSWEEQARVTT (纈氨酸(V)、精氨酸(R)、絲氨酸(S)、色氨酸(W)、谷氨酸(E)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、精氨酸(R)、纈氨酸(V)、蘇氨酸(T)、蘇氨酸(T))的序列。
如序列表中的序列號16所示，本發(fā)明的氨基酸序列16是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RAFIASRRIKRP (精氨酸(R)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、異亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、精氨酸(R)、精氨酸(R)、異亮氨酸(I)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、脯氨酸(P))的序列。如序列表中的序列號17所示，本發(fā)明的氨基酸序列17是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RESTLKGTSRAV (精氨酸(R)、谷氨酸(E)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、甘氨酸(G)、蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V))的序列。如序列表中的序列號18所示，本發(fā)明的氨基酸序列18是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為AGLRLKKAAIHR (丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、亮氨酸(L)、精氨酸(R)、亮氨酸(L)、賴氨酸(K)、賴氨酸(K)、丙氨酸(A)、丙氨酸(A)、異亮氨酸(I)、組氨酸(H)、精氨酸(R))的序列。如序列表中的序列號19所示，本發(fā)明的氨基酸序列19是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為SSLLRAVPEPTG (絲氨酸(S)、絲氨酸(S)、亮氨酸(L)、亮氨酸(L)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、脯氨酸(P)、蘇氨酸(T)、甘氨酸(G))的序列。 如序列表中的序列號20所示，本發(fā)明的氨基酸序列20是從N末端側(cè)起向著C末端側(cè)依次為RAFIASRRIRRP (精氨酸(R)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、異亮氨酸(I)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、精氨酸(R)、精氨酸(R)、異亮氨酸(I)、精氨酸(R)、精氨酸(R)、脯氨酸(P))的序列。本發(fā)明的氨基酸序列I 20對特定的固相能表現(xiàn)出特異性吸附功能。在目前能夠確認的范圍中，特定的固相是指具有親水性的樹脂表面的固相。即，與原肽相比，本發(fā)明的肽對親水性的樹脂表面的結(jié)合性能得到提高。尤其是，本發(fā)明的肽對親水性的聚苯乙烯表面顯示出優(yōu)異的結(jié)合性能。結(jié)合性能是與和其競爭的雜質(zhì)相比優(yōu)先結(jié)合的性能，可通過在與其競爭的雜質(zhì)例如其它肽、高分子化合物、表面活性劑等存在下，比較與固相結(jié)合的本發(fā)明的肽的量來進行評價。具有親水性的樹脂表面的固相可使用對聚苯乙烯、聚碳酸脂、聚丙烯、聚乙烯、聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)等塑料樹脂表面進行改性而實現(xiàn)親水化處理的固相。通常，所制造的塑料樹脂表面為疏水性，但通過對該表面進行各種親水化處理，能夠制得具有親水性的樹脂表面的固相。例如，可通過對聚苯乙烯表面進行UV + O3處理、等離子體氧化處理，來準備具有親水性的聚苯乙烯表面的固相。固相的形態(tài)既可以為板狀(包括容器、孔的壁面和底面)也可以為粒狀。如日本特開2007 - 279018號公報所述，如果在微孔板的流體處理部(各孔)內(nèi)填充表面經(jīng)親水化處理過的粒狀塑料基板，則通過僅向孔內(nèi)注入包含本發(fā)明的肽的溶液，即能將本發(fā)明的肽固定在粒狀塑料基板表面。本說明書中，“肽”是指2個以上氨基酸通過肽鍵連接而成的物質(zhì)，包括寡肽、多肽、蛋白質(zhì)、同聚肽和雜聚肽。此外，本發(fā)明的肽有時在電場下呈中性的形態(tài)、或呈成鹽的形態(tài)，其可以是僅由序列表中的本發(fā)明的氨基酸序列構(gòu)成的形態(tài)，將本發(fā)明的肽融合到特定蛋白質(zhì)的末端部或內(nèi)部而成的融合蛋白形態(tài)，添加有糖、聚乙二醇、NCS基(isothiocyanate,異硫氰酸酯)、NHS基(N-Hydroxy succinimide ester, N-輕基琥拍酰亞胺酯)、馬來酰亞胺基、硫醇基、生物素、熒光染料等而獲得的復合體形態(tài)，以及將肽乙?；?、酰胺化和/或通過多官能試驗進行交聯(lián)聚合而得的衍生物或聚合物形態(tài)。
序列表中的序列號21所示的堿基序列是編碼本發(fā)明的氨基酸序列2的堿基序列的一例。即，其為包含從5’末端側(cè)起向著3’末端側(cè)依次為cgt ate ate ate cga agg attcga cga (a :腺嘌呤、g :鳥嘌呤、c :胞嘧啶、t :胸腺嘧啶)的堿基序列的DNA。序列號22所示的堿基序列是編碼本發(fā)明的氨基酸序列3的堿基序列的一例。即，其為包含從5’末端側(cè)起向著3’末端側(cè)依次為cgt gcg att gcg cga agg att cga cga (a :腺嘌呤、g :鳥嘌呤、c :胞嘧啶、t :胸腺嘧啶)的堿基序列的DNA。編碼本發(fā)明的氨基酸序列2或3的堿基序列并非限定于序列號21或22所示的堿基序列，此外也可以采用與本發(fā)明的氨基酸序列2或3的各氨基酸對應的各密碼子的序列?？赏ㄟ^利用噬菌體、質(zhì)粒等載體，使包含編碼本發(fā)明的氨基酸序列的喊基序列的基因在宿王內(nèi)表達，或通過向宿王的基因組DNA中導入包含編碼本發(fā)明的氨基酸序列的堿基序列的基因，使其在宿主內(nèi)表達，從而能夠生物合成本發(fā)明的肽。本發(fā)明的肽能夠利用各種蛋白質(zhì)，能夠用于多種抗原、抗體、凝集素、酶或受體蛋白質(zhì)等中。例如，能夠用于谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST :Glutathione S_Transferase)、麥芽 糖結(jié)合蛋白(MBP)、堿性磷酸酶(ALP)、過氧化物酶(POD)、熒光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、3 —半乳糖苷酶(0 — Gal)、胰蛋白酶、糜蛋白酶、凝血酶、Factor Xa、血管緊張肽素轉(zhuǎn)化酶、酪氨酸激酶、胰島素受體、EGF受體、鏈霉親和素(SA)、單克隆抗體(Mab)、多克隆抗體( 813)、單鏈抗體(80 ￥)、多價單鏈抗體(80 (FV)n)(例如,雙價單鏈抗體(SC (Fv)2))、恒定區(qū)融合型單鏈抗體(scFv-FC)、Fab片段以及F(ab’)2片段(包含抗原結(jié)合部位的抗體片段)、補體系統(tǒng)蛋白Clq、伴刀豆球蛋白A(ConA)、扁小扁豆凝集素(LCA)、抗體結(jié)合蛋白質(zhì)(ProteinA、ZZ、Protein G、Protein L等)等。本說明書中，為了與本發(fā)明的肽進行比較，以下將從本發(fā)明的肽中除去本發(fā)明的氨基酸序列的肽(包括導入本發(fā)明的氨基酸序列前的肽在內(nèi))稱為“原肽”。當本發(fā)明的肽為包含能形成抗原結(jié)合部位的可變區(qū)的肽時，還包括抗體分子自身，優(yōu)選為能夠通過大腸桿菌、酵母生產(chǎn)的單鏈抗體(scFv)、多價單鏈抗體(sc (Fv)n)、恒定區(qū)融合型單鏈抗體(scFv_Fc)、Fab片段、F(ab’)2片段。多價單鏈抗體(sc (Fv)n)是通過連接肽將多個單鏈抗體(scFv)連接而成的抗體，是分子內(nèi)具有多個抗原結(jié)合部位(重鏈可變區(qū)(Vh)和輕鏈可變區(qū)(')結(jié)構(gòu)域)的肽的總稱。多個抗原結(jié)合部位可以相同也可以不同。2價單鏈抗體(sc (Fv)2)是將2個單鏈抗體(scFv)用連接肽連接而成的抗體。恒定區(qū)融合型單鏈抗體(scFv-Fc)是單鏈抗體(scFvM^ C末端側(cè)具有Fe結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)的總稱。Fab片段是指將抗體分子用木瓜蛋白酶消化而得的片段中，由\、Q構(gòu)成的輕鏈和由VH、ChI結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的重鏈締合而成的部分，但也可通過基因重組技術(shù)制作。F(ab’)2片段是指抗體分子被胃蛋白酶消化后獲得的片段中的一個，是2分子的Fab通過鉸鏈部的二硫鍵連接而成的，但也可通過基因重組技術(shù)制作。本發(fā)明的肽中，本發(fā)明的氨基酸序列的導入部位為不妨礙原肽原本具有的生理活性的部位，例如，為抗原時，導入部位為抗原決定簇以外的部位，為抗體時，導入部位為起到抗體活性的部位的以外的部位。尤其是，為了以維持原肽的立體結(jié)構(gòu)的狀態(tài)固定在固相，優(yōu)選在原肽的C末端或N末端附近的部位導入本發(fā)明的氨基酸序列。本發(fā)明的肽中，除了本發(fā)明的氨基酸序列以外，還可另外導入標記用的親和標簽等。尤其是，在本發(fā)明的肽為包含能形成抗原結(jié)合部位的可變區(qū)的肽時，在比重鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)或比輕鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)(包括兩者)導入本發(fā)明的氨基酸序列。比可變區(qū)靠近C末端一側(cè)是指從重鏈或輕鏈可變區(qū)中的C末端起直至本發(fā)明的肽整體的C末端為止的位置，指不妨礙可變區(qū)的結(jié)合抗原的全部位置。在為抗體分子的情況下(參照圖6的(a))，優(yōu)選在下述位置中的一處或多處進行導入位于比重鏈(H鏈)62的可變區(qū)(Vh)靠近C末端一側(cè)的恒定區(qū)(Ch1、Ch2、Ch3、Ch4)的結(jié)構(gòu)域中的N末端、C末端，輕鏈(L鏈)63的恒定區(qū)(CJ的結(jié)構(gòu)域中的N末端、C末端；尤其優(yōu)選在下述位置中的一處或多處進行導入重鏈62的Fe區(qū)域的恒定區(qū)(CH2、CH3、CH4)的結(jié)構(gòu)域中的N末端、C末端、輕鏈63的C末端。在為Fab片段或F (ab ’)2片段的情況下(參照圖6的(b )和(c ))，優(yōu)選在下述位置中的一處或多處進行導入重鏈62或輕鏈63的可變區(qū)的結(jié)構(gòu)域(V1^P 中的C末端、恒定區(qū)(ChI和CJ的域中的N末端、C末端，尤其優(yōu)選在下述位置中的一處或多處進行導入重鏈62的C末端或輕鏈63的C末端。
此外,在為例如單鏈抗體(scFv)、多價單鏈抗體(sc (Fv)n)、恒定區(qū)融合型單鏈抗體(scFv-Fc )這類具有用于連接重鏈和輕鏈的連接肽的情況下，可以將本發(fā)明的氨基酸序列導入到連接肽和重鏈或輕鏈之間、或連接肽內(nèi)部。在此，連接肽連接重鏈或輕鏈中一者的C末端以及另一者的N末端，重鏈或輕鏈的C末端側(cè)包括了連接肽整體、即從與重鏈或輕鏈的C末端相連的部分起至另一者的N末端為止的區(qū)域。也可以在連接肽和重鏈或輕鏈之間、或連接肽內(nèi)部另外導入本發(fā)明的氨基酸序列外的標記用親和標簽等。在為圖6的(d)的單鏈抗體(scFv)的情況下，在輕鏈的可變區(qū)(VJ的C末端側(cè)或從重鏈的可變區(qū)(Vh)的C末端起直至包含連接肽69的內(nèi)部的輕鏈的可變區(qū)(')的N末端為止之間一者或兩者中導入本發(fā)明的氨基酸序列。通過在多個位置導入本發(fā)明的氨基酸序列，能夠進一步將本發(fā)明的肽的立體結(jié)構(gòu)維持在正常狀態(tài)。例如，在Fab片段或F(ab’)2片段的重鏈和輕鏈的C末端側(cè)分別導入本發(fā)明的氨基酸序列，或者在單鏈抗體(scFv)的重鏈和輕鏈的C末端側(cè)分別導入本發(fā)明的氨基酸序列，則由于該部位容易與固相表面結(jié)合，因此抗原結(jié)合部位朝向外側(cè)，容易進行抗原抗體反應。本發(fā)明的肽可通過公知的克隆技術(shù)、化學合成法制造。例如，利用克隆技術(shù)的話，制備編碼本發(fā)明的氨基酸序列的DNA，將其插入到能自主復制的載體中獲得重組DNA，將其導入大腸桿菌、枯草桿菌、放線菌、酵母、糸狀菌(filamentous bacterium)、植物細胞、昆蟲細胞、動物細胞等合適的宿主中獲得轉(zhuǎn)化體，從其培養(yǎng)物能獲得包含本發(fā)明的氨基酸序列的肽。此外，還可以制備編碼本發(fā)明的氨基酸序列的DNA，使用小麥胚芽、大腸桿菌細胞提取液等，通過無細胞蛋白質(zhì)合成體系合成本發(fā)明的肽。此外，利用“固相法”或“液相法”等常用的肽化學合成法，依次使本發(fā)明的氨基酸序列所示的氨基酸脫水縮合、延伸，能夠合成由本發(fā)明的氨基酸序列構(gòu)成的本發(fā)明的肽。進而，使該由本發(fā)明的氨基酸序列構(gòu)成的本發(fā)明的肽連接到期望的原肽上，從而可合成包含本發(fā)明的氨基酸序列的更大分子的本發(fā)明的肽。本發(fā)明的肽由于具有本發(fā)明的氨基酸序列，因此，通過使來自轉(zhuǎn)化體的包含生成物的溶液與固相表面接觸，能夠使本發(fā)明的肽直接吸附在固相表面而進行分離純化。包含生成物的溶液是指包含作為目標的本發(fā)明的肽且還存在來源于宿主的多余的雜質(zhì)的整個溶液，包括例如破碎菌體液、將破碎菌體液離心分離而得的可溶性組分、對將破碎菌體液離心分離而得的不溶性組分進行增溶后的溶液、細胞膜組分、細胞壁組分、細胞分泌產(chǎn)生的分泌物、體液、或這些的不完全純化物等。進而，通過導入重組DNA而在宿主內(nèi)大量表達異種基因時，為了避免生成的蛋白質(zhì)對宿主產(chǎn)生不良影響，有時生成不溶且無活性的聚集物也就是包涵體(inclusionbody),本發(fā)明的肽即使被生成為包涵體(inclusion body)形式,也能夠通過變性劑對包涵體(inclusion body)增溶后直接固定在固相表面,并且,通過在被固定的狀態(tài)下除去變性劑，有時本發(fā)明的肽還能進行重折疊。此外，不僅是包涵體，其它任何原因?qū)е碌牧Ⅲw結(jié)構(gòu)變性的情況下，只要是本發(fā)明的肽，都能直接固定在固相表面，并且，在固定的狀態(tài)下加入適當?shù)闹卣郫B緩沖液，從而有時能將本發(fā)明的肽重折疊。變性的原因包括加熱、冷凍、高壓、超聲波、紫外線、X射線、攪拌、吸附、稀釋等物理原因，以及極端的酸性或堿性、有機溶劑、重金屬鹽、變性劑、表面活性劑等化學原因。如上所述，本發(fā)明的氨基酸序列I 20對親水性的樹脂表面顯示優(yōu)異的結(jié)合性 能，因此，具有本發(fā)明的氨基酸序列I 20的本發(fā)明的肽能夠直接固定在具有親水性的樹脂表面的固相，因此能容易地進行分離、純化。即，使包含具有本發(fā)明的氨基酸序列I 20的本發(fā)明的肽的溶液，通過填充了具有親水性的樹脂表面的固相的柱，從而能夠使具有本發(fā)明的氨基酸序列I 20的本發(fā)明的肽直接結(jié)合于固相，能夠?qū)⑵鋸娜芤悍蛛x、純化。以下通過實施例更具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明只要不超出其主旨特定即可，并不受這些實施例的限定。實施例I 19是將本發(fā)明的氨基酸序列導入到谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)中的例子，實施例20是將本發(fā)明的氨基酸序列導入到抗體中的例子，實施例21 28是將本發(fā)明的氨基酸序列導入到單鏈抗體中的例子。在以下實施例中，本發(fā)明的肽的濃度如下求得使用來自牛血清的白蛋白(BSA)作為標準蛋白通過Lowry法進行定量。[實施例I](具有本發(fā)明的氨基酸序列2的GST的生物合成)首先，在重組有編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的基因的質(zhì)粒(GEHealthcareBiosciences有限公司制造的“pGEX-3X”、數(shù)據(jù)庫登錄號U13852)中的限制酶BamHI識別的堿基序列部位和限制酶EcoRI識別的堿基序列部位之間，導入編碼本發(fā)明的氨基酸序列2的基因(序列表的序列號21所不的喊基序列)，將其作為載體。接著，使用大腸桿菌(BL21)作為宿主，將導入了編碼本發(fā)明的氨基酸序列2的基因的載體導入宿主，對宿主進行轉(zhuǎn)化，在包含氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)基上進行篩選。然后，在50ml2xYT培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌,加入作為誘導表達物質(zhì)的異丙基-P -D-硫代半乳糖苷(IPTG Isopropyl-l-thio-^ -D(-)-galactoside)使終濃度達到 0. ImM,表達包含本發(fā)明的氨基酸序列2的GST (本發(fā)明的肽)。然后，破碎菌體后，用純化用凝膠(GSH-Sepharose6B)來純化菌體內(nèi)可溶性組分，在磷酸緩沖生理鹽水(PBS :Phosphate Buffered Saline)中透析I夜,通過滅菌過濾器除去聚集物。這樣，生物合成了作為本發(fā)明的肽的C末端導入有本發(fā)明的氨基酸序列2的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。下面，將實施例I中生物合成的具有本發(fā)明的氨基酸序列2的GST稱為本發(fā)明的肽I。[實施例2](具有本發(fā)明的氨基酸序列3的GST的生物合成)在質(zhì)?！皃GEX - 3X”的限制酶BamHI識別的堿基序列部位和限制酶EcoRI識別的堿基序列部位之間，導入編碼本發(fā)明的氨基酸序列3的基因(序列表的序列號22所示的堿基序列)，除此以外，與實施例I同樣處理，生物合成了作為本發(fā)明的肽的在C末端導入有本發(fā)明的氨基酸序列3的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。下面，將實施例2中生物合成的具有本發(fā)明的氨基酸序列3的GST稱為本發(fā)明的肽2。[實施例3 6](具有本發(fā)明的氨基酸序列4 7的GST的生物合成)在質(zhì)粒“pGEX - 3X”的限制酶BamHI識別的堿基序列部位和限制酶EcoRI識別的堿基序列部位之間，導入編碼本發(fā)明的氨基酸序列4 7的基因，除此以外，與實施例I同樣處理，分別生物合成了作為本發(fā)明的肽的在C末端導入有本發(fā)明的氨基酸序列4 7的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。實施例3中生物合成了具有本發(fā)明的氨基酸序列4的GST，實施例4中生物合成了具有本發(fā)明的氨基酸序列5的GST，實施例5中生物合成了具有本發(fā)明的氨基酸序列6的GST，實施例6中生物合成了具有本發(fā)明的氨基酸序列7的GST。下面，
將實施例3 6中生物合成的具有本發(fā)明的氨基酸序列4 7的GST分別稱為本發(fā)明的肽3 6。[實施例7 9](具有本發(fā)明的氨基酸序列8 10的GST的生物合成)在質(zhì)?！皃GEX - 3X”的限制酶BamHI識別的堿基序列部位和限制酶EcoRI識別的堿基序列部位之間，導入編碼本發(fā)明的氨基酸序列8 10的基因，除此以外，與實施例I同樣處理，分別生物合成了作為本發(fā)明的肽的在C末端導入有本發(fā)明的氨基酸序列8 10的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。實施例7中生物合成了具有本發(fā)明的氨基酸序列8的GST，實施例8中生物合成了具有本發(fā)明的氨基酸序列9的GST，實施例9中生物合成了具有本發(fā)明的氨基酸序列10的GST。下面，將實施例7 9中生物合成的具有本發(fā)明的氨基酸序列8 10的GST分別稱為本發(fā)明的肽7 9。[實施例10](本發(fā)明的肽I和2對親水性的聚苯乙烯表面的結(jié)合性能的評價，雜質(zhì)BSA)為評價本發(fā)明的肽對親水性的聚苯乙烯表面的結(jié)合性能，在作為雜質(zhì)的來自牛血清的白蛋白(BSA)存在的狀態(tài)下，測定實施例I的本發(fā)明的肽I、實施例2的本發(fā)明的肽2和原肽即GST對親水性的聚苯乙烯表面的固定率。首先，準備未添加BSA的PBS和BSA濃度為0. 003 50mg/ml的PBS，在各溶液中添加本發(fā)明的肽1，使其終濃度達到5 u g/ml，從而制備試樣。接著，將100 u I的各試樣加入到親水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式會社制造的“IWAKI微孔板# 3860 — 096”)中，在室溫下孵育I小時，將本發(fā)明的肽I固定，用包含0. 1%的Tween20的PBS (以下稱為“0. 1PBST”)洗滌5次。進而，加入300 ii I包含2% BSA的0. IPBST作為封閉劑，在室溫下孵育I小時，封閉聚苯乙烯板表面的未結(jié)合部位，用0. IPBST洗滌5次。然后，加入IOOiU用包含0.2% BSA的0. IPBST稀釋至4000倍的抗GST抗體作為抗體，在室溫下孵育I小時，使本發(fā)明的肽I中所含的GST和抗GST抗體進行抗原抗體反應，用0. IPBST洗滌5次。然后，加入 100 u I 用包含 0. 2% BSA 的 0. IPBST 稀釋至 1000 倍的 HRP-conjugated anti-rabbitIgG antibody (HRP標記的抗兔IgG抗體)作為酶標記的二抗,在室溫下孵育I小時,再次使其進行抗原抗體反應，用0. IPBST洗滌5次。最后加入ABTS(2，2’ -azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid) ,2,2' -聯(lián)氣雙(3-乙基苯并喔唑琳-6-橫酸))作為顯色底物，孵育，使用酶標儀(TECAN制“SUNRISE Remote”)，測定405nm下的吸光度。對本發(fā)明的肽2和GST進行同樣的處理并測定吸光度。圖I表示的是實施例10的測定結(jié)果。圖I中的黑色圓點( )為本發(fā)明的肽I的結(jié)果，黑色三角為本發(fā)明的肽2的結(jié)果，白色圓圈(〇)是原肽GST的結(jié)果。在圖I中，縱軸為固定率(％)，橫軸為BSA濃度，固定率是以未添加BSA的PBS的吸光度(結(jié)合的量)為基準(100 %)而將其它吸光度標準化獲得的。 由圖I能夠確認，原肽GST在雜質(zhì)BSA存在時，固定率急劇降低，結(jié)合量也減少，而本發(fā)明的肽I和2即使存在10mg/ml這樣高濃度的BSA，固定率也幾乎不變，可確認其特異性地與親水性的聚苯乙烯板結(jié)合。[實施例11](本發(fā)明的肽I對親水性的聚苯乙烯表面的結(jié)合性能評價，雜質(zhì)BSA和 Tween20)為更詳細地評價實施例I的本發(fā)明的肽I的結(jié)合性能，在雜質(zhì)Tween20存在的狀 態(tài)下，測定對疏水性的聚苯乙烯表面和親水性的聚苯乙烯表面的結(jié)合量(吸光度)。首先，準備未添加Tween20的PBS和Tween20濃度為0. I、I、10%的PBS,向各溶液中添加本發(fā)明的肽1，使得終濃度達到O I ii g/ml，從而制備試樣。接著，將100 ill的各試樣加入親水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式會社制“ IWAKI微孔板# 3860 —096”)和疏水性的聚苯乙烯板(貝克頓-迪金森公司制“BD Falcon微孔板# 351172”)，在室溫下孵育I小時，將本發(fā)明的肽I固定，用0. IPBST洗滌5次。然后，在與實施例10相同的條件下，添加封閉劑、抗體、酶標記的二抗和顯色底物并進行洗滌處理，測定吸光度。對原肽GST也進行同樣的處理并測定吸光度。圖2的(a) (d)表示實施例11的在親水性的聚苯乙烯板中的測定結(jié)果，圖3的(a) (d)表示實施例11的在疏水性的聚苯乙烯板中的測定結(jié)果。圖2和圖3的(a)
(d)為Tween20的添加量分別為0、0. I、I、10%的條件下的測定結(jié)果。圖2和圖3中的黑色圓點( )為本發(fā)明的肽I的結(jié)果，白色圓圈(〇)為原肽GST的結(jié)果。圖2和3中，縱軸為405nm下的吸光度，橫軸為本發(fā)明的肽I和GST的濃度。圖2和3中，GST的結(jié)果和本發(fā)明的肽I的結(jié)果相同時，GST的結(jié)果即白色圓圈(〇)與本發(fā)明的肽I的黑色圓點( )重疊而無法確認。例如，圖3的(b) (d)中,GST的白色圓圈(〇)全部與本發(fā)明的肽I的黑色圓點( )重疊。由圖2的(a) (d)可以確認，本發(fā)明的肽I和GST中的任意一種在添加濃度增大時，結(jié)合于親水性的聚苯乙烯板的量均增加。此外，本發(fā)明的肽I即使添加有雜質(zhì)TWeen20，結(jié)合于親水性的聚苯乙烯板的量也不減少，反而有若干增加。GST在添加有雜質(zhì)TWeen20時，結(jié)合于親水性的聚苯乙烯板的量稍有減少。此外，根據(jù)圖3的(a)可知，本發(fā)明的肽I和GST中任意一種在不存在雜質(zhì)Tween20的情況下，均與疏水性的聚苯乙烯板結(jié)合。然而，如圖3的(b) (d)所示，本發(fā)明的肽I和GST中的任意一種在雜質(zhì)TWeen20存在時，均幾乎不與疏水性的聚苯乙烯板結(jié)合。這樣，本發(fā)明的肽的結(jié)合性能對具有親水性的樹脂表面的固相是特異性的。[實施例12](本發(fā)明的肽I對親水性的聚苯乙烯表面的結(jié)合性能評價，雜質(zhì)BSA和 Tween20)為更詳細地評價實施例I的本發(fā)明的肽I的結(jié)合性能，分別在雜質(zhì)Tween20存在的狀態(tài)以及TWeen20和BSA存在的狀態(tài)下，改變本發(fā)明的肽I的添加量，測定對疏水性的聚苯乙烯表面和親水性的聚苯乙烯表面結(jié)合的量(吸光度)。首先，準備PBS、0. 1PBST、包含20mg/ml的BSA的0. 1PBST，添加本發(fā)明的肽I使得各溶液中終濃度達到0 IOiI g/ml，從而制備試樣。接著，將100 ill的各試樣加入到親水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式會社制“IWAKI微孔板# 3860 一 096”)和疏水性的聚苯乙烯板(貝克頓-迪金森公司制“BD Falcon微孔板# 351172”)，在室溫下孵育2小時，將本發(fā)明的肽I固定，用0. IPBST洗滌5次。然后，在與實施例10相同的條件下，添加封閉劑、抗體、酶標記的二抗 和顯色底物并進行洗滌處理，測定吸光度。對原肽GST也進行同樣的處理并測定吸光度。圖4表示實施例12的測定結(jié)果。圖4的(a) (C)分別為PBS、0. IPBST和包含BSA的0. IPBST的對親水性的聚苯乙烯板的測定結(jié)果，圖4的(d) (f)分別為PBS、0. IPBST和包含BSA的0. IPBST的對疏水性的聚苯乙烯板的測定結(jié)果。此外，圖4中的黑色圓點(籲)為本發(fā)明的肽I的結(jié)果，白色圓圈(〇)為原肽GST的結(jié)果。圖4中，縱軸為405nm下的吸光度，橫軸為本發(fā)明的肽I和GST的濃度。圖4中，GST的結(jié)果和本發(fā)明的肽I的結(jié)果相同時，GST的結(jié)果即白色圓圈(〇)與本發(fā)明的肽I的黑色圓點( )重疊而無法確認。例如，圖4的(e)和(f)中，GST的白色圓圈(〇)全部與本發(fā)明的肽I的黑色圓點( )重疊。由圖4的(a) (C)可確認,本發(fā)明的肽I添加有雜質(zhì)Tween20時(圖4的(b))、添加有雜質(zhì)TWeen20和BSA時(圖4的(c))，結(jié)合于親水性的聚苯乙烯板的量幾乎不變(圖4的(b)和(c)的黑色圓點)。與此相對，GST在添加雜質(zhì)TWeen20時，結(jié)合于親水性的聚苯乙烯板的量稍有減少(圖4的(b)的白色圓圈)，在還添加BSA時幾乎不結(jié)合(圖4的(c)的白色圓圈)。這樣，通過導入本發(fā)明的氨基酸序列2，對親水性的聚苯乙烯板的結(jié)合性能得到提聞。此外，根據(jù)圖4的(d) (f)，本發(fā)明的肽I和GST中的任意一種在雜質(zhì)TWeen20不存在時，均與疏水性的聚苯乙烯板結(jié)合，但在雜質(zhì)TWeen20、BSA存在時，則幾乎不與疏水性的聚苯乙烯板結(jié)合。[實施例13](本發(fā)明的肽I的活性值評價)為了評價實施例I的本發(fā)明的肽I在固定狀態(tài)下的活性值，分別在雜質(zhì)Tween20存在的狀態(tài)以及TWeen20和BSA存在的狀態(tài)下，測定對疏水性的聚苯乙烯表面和親水性的聚苯乙烯表面結(jié)合而被固定的GST作為酶的活性值。首先，準備PBS、0. IPBST、包含20mg/ml的BSA的0. IPBST，向各溶液中添加本發(fā)明的肽1，使得終濃度達到10、20、40ii g/ml，從而制備試樣。接著，將100 ill的各試樣加入到親水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式會社制“IWAKI微孔板# 3860 一 096”)和疏水性的聚苯乙烯板(貝克頓-迪金森公司制“BD Falcon微孔板# 351172”)，在室溫下孵育2小時，將本發(fā)明的肽I固定，用0. IPBST洗滌5次。然后，加入200iU包含0. 1% Tween20,ImM的還原型谷胱甘妝和ImM的作為GST底物的CDNB (l-chloro-2, 4-dinitrobenzene(I-氯_2，4- 二硝基苯))的0. IM磷酸鉀緩沖液(pH6. 5)，邊在室溫下攪拌30分鐘，邊每30秒測定340nm下的吸光度。對原肽GST進行同樣的處理，測定吸光度。圖5表示實施例13的測定結(jié)果。圖5的(a) (C)分別為PBS、0. IPBST和包含BSA的0. IPBST的對親水性的聚苯乙烯板的測定結(jié)果，圖5的(d) (f)分別為PBS、0. IPBST和包含BSA的0. IPBST的對疏水性的聚苯乙烯板的測定結(jié)果。此外，圖5中的黑色圓點(籲)為本發(fā)明的肽I的結(jié)果，白色圓圈(〇)為原肽GST的結(jié)果。在圖5中，縱軸為活性值(吸光度的變化率)，橫軸為本發(fā)明的肽I和GST的濃度。圖5中，GST的結(jié)果和本發(fā)明的肽I的結(jié)果相同時，GST的結(jié)果即白色圓圈(〇)與本發(fā)明的肽I的黑色圓點( )重疊而無法確認。例如，例如，圖5的(e)和(f)中，GST的白色圓圈(〇)全部與本發(fā)明的肽I的黑色圓點( )重疊。由圖5的(a) (C)可確認，固定在親水性的聚苯乙烯板的本發(fā)明的肽I的GST在添加有雜質(zhì)Tween20時(圖5的(b))、添加有雜質(zhì)Tween20和BSA時(圖5的(c))，酶活性也非常高。與此相對，如實施例12中的圖4的(a)和(b)的白色圓圈所示，GST在未添加雜質(zhì)時和添加雜質(zhì)Tween20時,結(jié)合于親水性的聚苯乙烯板,但如圖5的(a)和(b)所示,完全不顯示酶活性。這意味著原肽GST雖固定在親水性的聚苯乙烯板，但發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化、失去活性。GST在圖5的(c)中完全不顯示酶活性，如圖4的(c)所示，這是由于本來在Tween20和BSA存在下，GST幾乎不與親水性的聚苯乙烯板結(jié)合。
此外，由圖5的(d)可知，固定在疏水性的聚苯乙烯板的本發(fā)明的肽I的GST幾乎不顯示酶活性。由實施例12中的圖4的(d)所示，可確認在雜質(zhì)不存在的狀態(tài)下，本發(fā)明的肽I能與疏水性的聚苯乙烯板結(jié)合，但由于結(jié)構(gòu)變化、失活，而失去活性。即，可確認本發(fā)明的氨基酸序列2的結(jié)合性能對親水性的聚苯乙烯板為特異性的，與以前利用疏水性的聚苯乙烯板的固定相比，將本發(fā)明的肽I固定在親水性的聚苯乙烯板能夠維持活性。在圖5的(e)和(f)中，本發(fā)明的肽I和GST中的任意一種均完全不顯示酶活性，這是由于，當雜質(zhì)TWeen20、BSA存在時，幾乎不與疏水性的聚苯乙烯板結(jié)合。[實施例14](本發(fā)明的肽3 6對親水性的聚苯乙烯表面的結(jié)合性能評價，雜質(zhì)BSA 和 Tween20)為了評價本發(fā)明的肽3 6對親水性的聚苯乙烯表面的結(jié)合性能，在雜質(zhì)BSA和Tween20存在的狀態(tài)下，對實施例3 6的本發(fā)明的肽3 6以及用于評價的本發(fā)明的肽I和原肽GST對親水性的聚苯乙烯表面的固定率進行測定。首先，準備未添加BSA的0. 1PBST.BSA濃度為0. 003 50mg/ml的0. 1PBST，在各溶液中添加本發(fā)明的肽3，使得終濃度達到5i!g/ml，從而制備試樣。接著，將IOOiU的各試樣加入到親水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式會社制“ IWAKI微孔板# 3860 —096”)，25°C下孵育3小時，將本發(fā)明的肽3固定，用0. I % PBS洗滌6次。進而，加入300 yl包含2% BSA的0. IPBST作為封閉劑，在25°C下孵育I小時，將聚苯乙烯板表面的未結(jié)合部位封閉，用0. IPBST洗滌6次。然后，加入IOOiU用包含0. 2% BSA的0. IPBST稀釋至5000倍的抗GST抗體作為抗體，在25°C下孵育I小時，使本發(fā)明的肽3中所含的GST和抗GST抗體進行抗原抗體反應，用0. IPBST洗滌6次。然后，加入100 U I用包含0. 2% BSA的
0.IPBST 稀釋至 5000 倍的 HRP-conjugatedanti-rabbit IgG antibody (HRP 標記的抗兔IgG抗體)作為酶標記的二抗，在25°C下孵育I小時，進行抗原抗體反應，再用0. IPBST洗漆 6 次。最后，力口入 ABTS (2，2’-azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid),2，2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))作為顯色底物，孵育，用酶標儀(TECAN制“ SUNRISERemote ”)測定405nm下的吸光度。對本發(fā)明的肽4 6、本發(fā)明的肽I和GST進行同樣的處理，測定吸光度。圖7表示實施例14的測定結(jié)果。圖7中的黑色三角為本發(fā)明的肽3的結(jié)果，空心三角(A)為本發(fā)明的肽4的結(jié)果，黑色正方形為本發(fā)明的肽5的結(jié)果，空心正方形(□)為本發(fā)明的肽6的結(jié)果，黑色圓點( )為本發(fā)明的肽I的結(jié)果，白色圓圈(〇)為原肽GST的結(jié)果。圖7中，縱軸為固定率(％ )，橫軸為BSA濃度，固定率是以未添加BSA的PBST中的吸光度(結(jié)合的量)為基準(100%)而將其它吸光度標準化獲得的。圖7中，本發(fā)明的肽1、3 6的結(jié)果類似，存在重疊的部分。由圖7能夠確認原肽GST在雜質(zhì)BSA和TWeen20存在時，固定率急劇降低，結(jié)合量也減少，而本發(fā)明的肽3 6即使存在10mg/ml這樣高濃度的BSA，固定率也幾乎不變，可確認其與本發(fā)明的肽I以同等水平特異性地與親水性的聚苯乙烯板結(jié)合。[實施例15](本發(fā)明的肽3 6在聚苯乙烯表面的活性值評價，雜質(zhì)BSA和Tween20)為評價本發(fā)明的肽3 6在固定在親水性的聚苯乙烯表面的狀態(tài)下的活性值，分別在雜質(zhì)Tween20存在的狀態(tài)下以及Tween20和BSA存在的狀態(tài)下，測定被固定的GST的作為酶的活性值。首先，準備PBS和0. IPBST，向各溶液中分別添加本發(fā)明的肽I、3 6，使得終濃度達到0. 5、10、20、40ii g/ml，從而制備試樣。接著，將IOOyl的各試樣加入到親水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式會社制“ IWAKI微孔板# 3860 — 096”)，在25°C下孵育2小時，將本發(fā)明的肽固定，用0. IPBST洗滌6次，再用包含0. 1% Tween20的0. IM磷酸鉀溶液(pH6. 5)洗滌I次。然后，加入200iil包含0. 1% Tween20、lmM的還原型谷胱甘肽和ImM的作為 GST 底物的 CDNB (l-chloro-2, 4-dinitrobenzene (I-氣-2，4- 二硝基苯))的 0. IM磷酸鉀緩沖液(PH6. 5)，邊在室溫下攪拌30分鐘，邊每30秒測定340nm下的吸光度。對原肽GST進行同樣的處理，測定吸光度。 圖8表示實施例15的測定結(jié)果。圖8的(a)為PBS中的測定結(jié)果，(b)為0. IPBST中的測定結(jié)果。此外，圖8中的黑色三角為本發(fā)明的肽3的結(jié)果，空心三角(A)為本發(fā)明的肽4的結(jié)果，黑色正方形為本發(fā)明的肽5的結(jié)果，空心正方形(□)為本發(fā)明的肽6的結(jié)果，黑色圓點( )為本發(fā)明的肽I的結(jié)果，白色圓圈(〇)為原肽GST的結(jié)果。圖8中，縱軸為活性值(吸光度的變化率)，橫軸為本發(fā)明的肽和GST的濃度。圖8中，本發(fā)明的肽1、3 6的結(jié)果類似，存在重疊的部分。由圖8的(a)和(b)能夠確認，固定在親水性的聚苯乙烯板的本發(fā)明的肽1、3 6的GST無論是以原有狀態(tài)(圖8的(a))、還是添加有雜質(zhì)Tween20 (圖8的(b))，都具有很高的酶活性。[實施例16](本發(fā)明的肽7 9對親水性的聚苯乙烯表面的結(jié)合性能評價,雜質(zhì)BSA 和 Tween20)為評價實施例7 9中生物合成的本發(fā)明的肽7 9對親水性的聚苯乙烯表面的結(jié)合性能，對本發(fā)明的肽7 9以及原肽GST，進行與實施例14同樣的處理并測定吸光度，評價對親水性的聚苯乙烯表面的固定率。圖9表示實施例16的測定結(jié)果。圖9中的黑色圓形為本發(fā)明的肽7的結(jié)果，黑色菱形為本發(fā)明的肽8的結(jié)果，空心三角(A)為本發(fā)明的肽9的結(jié)果，白色圓圈(〇)為原肽GST的結(jié)果。圖9中，縱軸為固定率(％)，橫軸為BSA濃度，固定率是以未添加BSA的PBST中的吸光度(結(jié)合的量)為基準(100% )而將其它吸光度標準化獲得的。
由圖9能夠確認，原肽GST在雜質(zhì)BSA和TWeen20存在時，固定率急劇降低，結(jié)合量也減少，而本發(fā)明的肽7 9即使存在10mg/ml這樣高濃度的BSA，固定率也幾乎不變，可確認其與親水性的聚苯乙烯板特異性地結(jié)合。[實施例17](本發(fā)明的肽7 9在聚苯乙烯表面的活性值評價，雜質(zhì)BSA和Tween20)
為評價本發(fā)明的肽7 9在固定在親水性的聚苯乙烯表面的狀態(tài)下的活性值，對本發(fā)明的肽7 9以及原肽GST進行與實施例15同樣的處理，測定活性值。圖10表示實施例17的測定結(jié)果。圖10的(a)為PBS中的測定結(jié)果，(b)為0. IPBST中的測定結(jié)果。此外，圖10中的黑色圓形為本發(fā)明的肽7的結(jié)果，黑色菱形為本發(fā)明的肽8的結(jié)果，空心三角(A)為本發(fā)明的肽9的結(jié)果，白色圓圈(〇)為原肽GST的結(jié)果。圖10中，縱軸為活性值(吸光度的變化率)，橫軸為本發(fā)明的肽和GST的濃度。由圖10的(a)和(b)能夠確認，固定在親水性的聚苯乙烯板的本發(fā)明的肽7 9的GST無論是以原有狀態(tài)(圖10的(a))、還是添加有雜質(zhì)Tween20 (圖10的(b))時，都具有很聞的酶活性。[實施例18](本發(fā)明的肽I在生產(chǎn)中的分離純化工序中的應用例，雜質(zhì)破碎菌體液)在本實施例中，為評價將本發(fā)明的肽的特異性吸附功能應用于生產(chǎn)中的分離純化工序的可能性，對使用大腸桿菌表達的包含本發(fā)明的氨基酸序列2的GST，不進行特別的純化工序，直接將破碎菌體液固定在親水性的聚苯乙烯表面，測定此時的結(jié)合量(吸光度)。為進行比較，對原肽同樣測定結(jié)合量(吸光度)。首先，使用每列設(shè)有8個培養(yǎng)容器(孔)的孔板中的5列，向39個培養(yǎng)容器(孔)內(nèi)添加200 u I的2xYT培養(yǎng)基，在各孔中接種大腸桿菌(BL21 )，形成菌落，在37°C、200rpm下培養(yǎng)一夜，所述大腸桿菌(BL21)通過導入有導入了編碼與實施例I同樣的本發(fā)明的氨基酸序列2的基因的載體進行轉(zhuǎn)化。原肽GST也同樣制備40個菌落并培養(yǎng)。為確認各菌落的培養(yǎng)程度，各回收100 ill培養(yǎng)液，測定菌體濃度。圖11的(a)為培養(yǎng)本發(fā)明的肽的39個菌落的菌體濃度(630nm下的吸光度)，圖11的(b)為培養(yǎng)原肽的40集落的菌體濃度。圖11中，橫軸為孔板的列號，表示每列中的8個孔的結(jié)果。由圖11的(a)和(b)能夠確認的是，所有菌落得到同等程度的培養(yǎng)。接著，破碎菌體后，回收破碎菌體液10 iil，與90ml包含1%的10mg/ml BSA的PBS混合，加入到親水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式會社制“IWAKI微孔板# 3860 —096”)，在室溫下孵育I小時，將肽固定在固相上。然后，在與實施例7相同的條件下，添加封閉劑、抗體、酶標記的二抗和顯色底物并進行洗滌處理，測定吸光度。對原肽GST進行同樣處理并測定吸光度。圖11的(C)和(d)表示實施例18的測定結(jié)果。圖11的(C)為培養(yǎng)本發(fā)明的肽的39個菌落的吸光度(405nm)，圖11的(d)為培養(yǎng)原肽的40個菌落的吸光度(405nm)。如圖11的(d)所示，原肽GST的吸光度為背景程度，幾乎未固定在固相表面。與此相對，由圖11的(C)能夠確認，本發(fā)明的肽即使以包含于大腸桿菌的破碎菌體液的狀態(tài)與固相表面接觸，也能特異性固定在固相表面。在大腸桿菌的破碎菌體液中，作為雜質(zhì)，除了各種大小不確定的蛋白質(zhì)外，還存在蛋白質(zhì)以外的低分子化合物、脂質(zhì)等。能夠確認即使存在這些雜質(zhì)，本發(fā)明的肽也特異性地與親水性的聚苯乙烯板結(jié)合，因此能夠用于生產(chǎn)中的分離純化工序。[實施例19](本發(fā)明的肽I在生產(chǎn)中的分離純化工序中的應用例，雜質(zhì)培養(yǎng)基)在本實施例中，為評價將本發(fā)明的肽的特異性吸附功能應用于生產(chǎn)中的分離純化工序的可能性，在向本發(fā)明的肽I加入作為雜質(zhì)的各種培養(yǎng)基(YPD、BMMY、2xTY、LB)的狀態(tài)下，測定對親水性的聚苯乙烯表面的結(jié)合量(吸光度)。為進行比較，對原肽GST同樣測定結(jié)合量(吸光度)。YPD為通常的酵母培養(yǎng)培養(yǎng)基，BMMY為P. pastoris專用培養(yǎng)基，2xTY和LB為大腸桿菌專用培養(yǎng)基。首先，準備YPD、BMMY、2xTY和LB這4種培養(yǎng)基，對原液 稀釋至10000倍的溶液，分別添加本發(fā)明的肽I達到5 u g/ml，從而制備試樣。將各試樣加入到親水性的聚苯乙烯板
(AGC Techno Glass株式會社制“IWAKI微孔板# 3860 — 096”)，在室溫下孵育I小時，將肽固定在固相上。然后，在與實施例7相同的條件下添加封閉劑、抗體、酶標記的二抗和顯色底物并進行洗滌處理，測定吸光度。對原肽GST同樣進行處理，測定吸光度。對原肽GST同樣測定吸光度。圖12表示實施例19的測定結(jié)果。圖12中的黑色圓點( )為本發(fā)明的肽I和培養(yǎng)基YPD的混合試樣的結(jié)果，白色圓圈(〇)為原肽GST和培養(yǎng)基YPD的混合試樣的結(jié)果，黑色三角為本發(fā)明的肽I和培養(yǎng)基BMMY的混合試樣的結(jié)果，空心三角(A)為原肽GST和培養(yǎng)基BMMY的混合試樣的結(jié)果，黑色正方形為本發(fā)明的肽I和培養(yǎng)基2xYT的混合試樣的結(jié)果，空心正方形(□)為原肽GST和培養(yǎng)基2xYT的混合試樣的結(jié)果，菱形( )為本發(fā)明的肽I和培養(yǎng)基LB的混合試樣的結(jié)果,空心菱形( )為原肽GST和培養(yǎng)基LB的混合試樣的結(jié)果。圖12中，縱軸為吸光度(405nm)，橫軸為培養(yǎng)基的相對濃度(稀釋率)(右端的I為原液)。如圖12所示，結(jié)合于固相表面的原肽GST (白色圓圈、空心三角、空心正方形、空心菱形)量均隨著培養(yǎng)基的變濃而減少。與此相對，本發(fā)明的肽I (黑色圓點、黑色三角、黑色方形、黑色菱形)即使在培養(yǎng)基變濃時也有相當多的量被固定、結(jié)合于固相表面，沒有受到培養(yǎng)基濃度的很大影響，能夠確認特異性地固定在固相表面。尤其是，酵母使用的培養(yǎng)基即YPD和BMMY中也表現(xiàn)出特異性吸附性能，因此能夠用于酵母分泌生產(chǎn)中。即，通過使酵母的分泌液直接與固相表面接觸，能夠?qū)⒎置谝褐械谋景l(fā)明的肽固定并分離純化。進而，在單鏈抗體(scFv)的生產(chǎn)中有效的培養(yǎng)基即BMMY和2xYT中也表現(xiàn)出特異性吸附性能，因此以本發(fā)明的肽形式生產(chǎn)單鏈抗體(scFv)時，也能夠從酵母的分泌液、大腸桿菌的破碎液直接分離純化單鏈抗體(scFv)。[實施例20](用由本發(fā)明的氨基酸序列2構(gòu)成的本發(fā)明的肽標記的抗體的生產(chǎn))首先，通過固相法，合成在由本發(fā)明的氨基酸序列2構(gòu)成的本發(fā)明的肽的N末端側(cè)具有賴氨酸(K)的肽(KRIIIRRIRR)。接著，用IOOyl的25%戊二醛溶液溶解0. 5mg的由本發(fā)明的氨基酸序列2構(gòu)成的本發(fā)明的肽，在室溫下孵育10分鐘。然后，加入9ml的二乙醚和Iml的乙醇，讓用戊二醛標記的本發(fā)明的肽析出，通過離心分離回收該肽。進而，在溶解有0. 5mg的小鼠單克隆抗人CRP抗體(ORIENTAL酵母社制、
#4715500)的0. 5ml PBS中，溶解用戊二醛標記的本發(fā)明的肽，在25°C下孵育I小時。然后，加入IOOiU的2M Tris - HCl (pH8. 0)使反應停止，通過超濾法純化作為本發(fā)明的肽的由本發(fā)明的氨基酸序列2構(gòu)成的抗CRP抗體。下面，將實施例20中生成的包含本發(fā)明的氨基酸序列2的抗CRP體稱為“本發(fā)明的肽20”，將其原肽稱為“原肽20”。[實施例21](C末端側(cè)具有本發(fā)明的氨基酸序列2的單鏈抗體的生成)本實施例中，在序列表的序列號23、24、25所示的3種單鏈抗體(scFv)的C末端側(cè)導入本發(fā)明的氨基酸序列2，生成3種單鏈抗體。下面，將序列表的序列號23、24和25所示的3種單鏈抗體(原肽)分別稱為“原肽21 - 1”、“原肽21 — 2”和“原肽21 — 3”，將本實施例中生成的在原肽21 - I、原肽21 - 2和原肽21 - 3中導入了本發(fā)明的氨基酸序列2的3種單鏈抗體(本發(fā)明的肽)分別稱為“本發(fā)明的肽21 - 1”、“本發(fā)明的肽21 - 2”和“本發(fā)明的肽21 — 3”。這些單鏈抗體的任意一種均具有對C反應蛋白(C-Reactive Protein CRP)顯示出特異性抗原抗體反應的抗原結(jié)合部位。原肽21 — I 21 — 3為通過鏈狀的連接肽連接重鏈的可變區(qū)(Vh)的C末端和輕鏈的可變區(qū)(')的N末端而成的結(jié)構(gòu)，所述連接肽為3組由4個甘氨酸(G)和絲氨酸(S)的組合連接而成的(G4S)3結(jié)構(gòu)。在原肽21 —I 21 — 3中，在輕鏈的可變區(qū)(')的C末端還導入了組氨酸標簽。實施例22和23的原肽為序列號23的單鏈抗體(原肽21 — I)。首先，合成5’末端側(cè)被磷酸化的包含編碼本發(fā)明的氨基酸序列2的基因的正義鏈(PStag-sense)和反義鏈(PStag-antisense)的寡DNA,退火后導入到用限制酶NotI和XhoI消化得到的pET22b(+)載體(Novagen制)，制得包含編碼本發(fā)明的氨基酸序列2的基因的pET-PStag載體(pET22b(+)中導入有PStag的載體)。“PStag”是指表達本發(fā)明的氨基酸序列2的基因。以下也同樣。接著，合成包含編碼重鏈的可變區(qū)(Vh)的基因的正義鏈(VH-SenSe)的寡DNA和包含編碼輕鏈的可變區(qū)(')的基因的反義鏈(Vfantisense)的寡DNA。以這些合成寡DNA為引物，分別以表達序列號23，24，25所示的3種單鏈抗體的載體pET-scFv (pET22b (+)中導入有scFv的基因的載體)為模板，通過PCR法擴增3種單鏈抗體(scFv)的基因。將擴增得到的scFv基因用限制酶NdeI和NotI消化，導入到用限制酶NdeI和NotI消化過的包含編碼本發(fā)明的氨基酸序列2的基因的pET-PStag載體，制得C末端側(cè)包含編碼本發(fā)明的氨基酸序列2的基因的3種單鏈抗體的表達載體(pET-scFv-PStag載體)。使用大腸桿菌(BL21(DE3)Rosetta (Novagen))作為宿主，將上述 pET-scFv-PStag載體導入宿主，對宿主進行轉(zhuǎn)化，在包含氨芐青霉素的瓊脂培養(yǎng)基上篩選。然后，在2xYT培養(yǎng)基50ml中培養(yǎng)大腸桿菌,加入誘導表達物質(zhì)異丙基-硫代-D-半乳糖苷(IPTG Isopropyl-l-thio-^ -D (-)-galactoside)至終濃度達到ImM,使其表達C末端包含本發(fā)明的氨基酸序列2的單鏈抗體(scFv-PStag)。然后，破碎菌體后，用包含6M鹽酸胍(變性劑)和IOmM巰基乙醇(還原劑)的增溶溶液溶解菌體內(nèi)不溶性組分。這樣能夠獲得未純化的變性的在C末端包含本發(fā)明的氨基酸序列2的單鏈抗體。下面，將該狀態(tài)的實施例21的單鏈抗體稱為“未純化的變性的本發(fā)明的肽21 - I” “未純化的變性的本發(fā)明的肽21 - 3”。進而，將未純化的變性的本發(fā)明的肽21 — I 21 — 3在變性狀態(tài)下，通過使用HisTrap HP (GE HealthCare)的Ni螯合親和層析柱(IMAC)純化，生產(chǎn)在C末端側(cè)包含本發(fā)明氨基酸序列2的變性的單鏈抗體。下面，將該狀態(tài)的實施例21的單鏈抗體稱為“純化后的變性的本發(fā)明的肽21 - I” “純化后的變性的本發(fā)明的肽21 - 3”。本發(fā)明的肽21 -I的氨基酸序列在序列表的序列號26中示出，本發(fā)明的肽21 - 2的氨基酸序列在序列表的序列號27中示出，本發(fā)明的肽21 - 3的氨基酸序列在序列表的序列號28中示出。本發(fā)明的肽21 — I 21 — 3在輕鏈的可變區(qū)(')的C末端側(cè)具有本發(fā)明的氨基酸序列2，本發(fā)明的氨基酸序列2的C末端側(cè)還連接有組氨酸標簽。氨基酸序列自身無論是在純化前后還是變性前后均保持不變，均為序列號26、27、28所示那樣。[實施例22](在重鏈可變區(qū)(Vh)和連接肽之間具有本發(fā)明的氨基酸序列2的單鏈抗體的生成)本實施例中，生成的是，在對原肽21 - I (序列號23)和原肽21 — 2 (序列號24)的重鏈的可變區(qū)(Vh)和輕鏈的可變區(qū)(VJ進行連接的連接肽中導入有本發(fā)明的氨基酸序列2的單鏈抗體(以下將生成的肽分別稱為“本發(fā)明的肽22 - I”和“本發(fā)明的肽22 -2”)。首先，合成包含編碼重鏈的可變區(qū)(Vh)的基因的正義鏈(VH-senSe)的寡DNA和反義鏈(Vfantisense)的寡DNA，以這些合成寡DNA為引物，以表達序列號23的單鏈抗體的pET-scFv載體為模板，通過PCR法擴增重鏈的可變區(qū)(Vh)的基因。接著，合成包含編碼輕鏈的可變區(qū)(')的基因的正義鏈('-sense)的寡DNA和反義鏈('-antisense)的寡DNA，同樣地擴增輕鏈的可變區(qū)(')的基因。進而，合成具有依次編碼重鏈的可變區(qū)(Vh)的C末端部、本發(fā)明的氨基酸序列2和連接肽的基因的正義鏈(V11-Pstag- (G4S) 3-sense )的寡DNA和包含依次編碼本發(fā)明的氨基酸序列2、連接肽和輕鏈的可變區(qū)(')的N末端部分的基因的反義鏈(PStag-(G4S)3-VL-antisense)的寡 DNA。使用重鏈的可變區(qū)(Vh)的基因、輕鏈的可變區(qū)(')的基因、正義鏈(Va-PStag-(G4S) 3-sense)的寡 DNA、反義鏈(PStag-(G4S) 3-VL_antisense)的寡 DNA、正義鏈(VH_sense)的寡 DNA 和反義鏈(VL_antisense)的寡 DNA,通過 Overlapping PCR 法，制 得在重鏈可變區(qū)(Vh)和連接肽(G4S)3之間具有本發(fā)明的氨基酸序列2的單鏈抗體的基因(scFv-(PStag))。將該基因用限制酶NdeI和NotI消化，導入到用限制酶NdeI和NotI消化過的pET22b(+)中，制得在連接肽(G4S)3中包含編碼本發(fā)明的氨基酸序列2的基因的單鏈抗體的表達載體(pET-scFv-(PStag)載體)。“ (PStag) ”是指在單鏈抗體中即重鏈可變區(qū)(Vh)和連接肽(G4S)3之間導入PStag。以下也相同。然后，與實施例21同樣地將該pET-scFv-(PStag)載體導入到宿主中并培養(yǎng)，破碎菌體后，用包含6M鹽酸胍(變性劑)和IOmM巰基乙醇(還原劑)的增溶溶液溶解菌體內(nèi)不溶性組分，能夠獲得未純化的變性的在連接肽(G4S)3中具有本發(fā)明的氨基酸序列2的單鏈抗體。進而，通過與實施例21同樣的方法純化，生產(chǎn)出純化的變性狀態(tài)的本發(fā)明的肽22 - I(以下稱為“純化后的變性的本發(fā)明的肽22 - I”)。本發(fā)明的肽22 - I的氨基酸序列在序列表的序列號29中示出。本發(fā)明的肽22 - I在重鏈的可變區(qū)(Vh)的結(jié)構(gòu)域和連接肽(G4S)3之間配置有本發(fā)明的氨基酸序列2。此外，通過同樣的方法，生產(chǎn)在原肽21 - 2 (序列號24)的重鏈的可變區(qū)(Vh)的結(jié)構(gòu)域和連接肽(G4S)3之間配置有本發(fā)明的氨基酸序列2的純化后的變性的本發(fā)明的肽22 - 2。本發(fā)明的肽22 - 2的氨基酸序列在序列表的序列號30中示出。[實施例23](在C末端和重鏈可變區(qū)(Vh)與連接肽之間兩處具有本發(fā)明的氨基酸序列2的單鏈抗體的生成)本實施例中，生成在原肽21 - I以及原肽21 — 2的單鏈抗體的C末端側(cè)(即輕鏈的可變區(qū)(')的C末端側(cè))和重鏈可變區(qū)(Vh)與連接肽之間(即重鏈的可變區(qū)(Vh)的C末端側(cè))的兩處導入有本發(fā)明的氨基酸序列2的單鏈抗體(以下，將生成的肽分別稱為“本發(fā)明的肽23 - I”和“本發(fā)明的肽23 - 2”)。首先，與實施例22同樣地制備在重鏈可變區(qū)(Vh)和連接肽(G4S)3之間具有本發(fā)明的氨基酸序列2的單鏈抗體的基因(scFv-(PStag))。實施例22中將該基因?qū)肓?pET22b(+)，但本實施例中，將其導入實施例21中使用的包含編碼本發(fā)明的氨基酸序列2的基因的pET-PStag載體，制作在C末端側(cè)和重鏈可變區(qū)(Vh)與連接肽(G4S)3之間兩處包含編碼本發(fā)明的氨基酸序列2的基因的單鏈抗體的表達載體(pET-scFv- (PStag) -PStag 載體)。然后，與實施例21同樣地將該pET-scFv-(PStag)-PStag載體導入宿主，培養(yǎng)，破碎菌體后，用包含6M鹽酸胍(變性劑)和IOmM巰基乙醇(還原劑)的增溶溶液溶解菌體內(nèi)不溶性組分，能夠獲得未純化的變性的在C末端側(cè)和連接肽兩處具有本發(fā)明的氨基酸序列2的單鏈抗體(scFv)。進而，與實施例21同樣地進行純化，生產(chǎn)出純化后的變性狀態(tài)的本發(fā)明的肽23 - I (以下稱為“純化后的變性的本發(fā)明的肽23 - I”)。本發(fā)明的肽23 - I的氨基酸序列在序列表的序列號31中示出。本發(fā)明的肽23 - I與本發(fā)明的肽21 - I同樣 地在輕鏈的可變區(qū)(\)的C末端側(cè)具有本發(fā)明的氨基酸序列2，在本發(fā)明的氨基酸序列2的C末端側(cè)還連接有組氨酸標簽。進而，與本發(fā)明的肽22 - I同樣地在重鏈的可變區(qū)(VhMA結(jié)構(gòu)域和連接肽(G4S)3之間具有本發(fā)明的氨基酸序列2。此外，通過同樣的方法，生產(chǎn)在原肽21 - 2 (序列號24)的輕鏈的可變區(qū)(\)的C末端側(cè)和重鏈的可變區(qū)(Vh)的結(jié)構(gòu)域與連接肽(G4S)3之間配置有本發(fā)明的氨基酸序列2的純化后的變性的本發(fā)明的肽23 - 2。本發(fā)明的肽23 — 2的氨基酸序列在序列表的序列號32中示出。[實施例24](本發(fā)明的肽21— I 21 — 3的固定后活性值的評價)本實施例中，為了評價本發(fā)明的肽21 — I 21 — 3(序列號26 28)在固定狀態(tài)下的活性值，使純化后的變性的本發(fā)明的肽21 — I 21 — 3在液相中重折疊后，使這些肽與親水性的聚苯乙烯表面結(jié)合，測定抗原抗體反應的活性值。為了進行比較，對原肽21 -I 21 — 3(序列號23 25)和并非單鏈抗體的抗體分子的本發(fā)明的肽20和原肽20，也使其與親水性的聚苯乙烯表面結(jié)合，測定活性值。進而，為了與以前進行比較，使原肽20 (抗體分子)與疏水性的聚苯乙烯表面結(jié)合，測定活性值。首先，將純化后的變性的本發(fā)明的肽21 — I 21 — 3 (序列號26 28)稀釋到包含375 ii M氧化型谷胱甘肽(GSSG)的PBS中，使得變性劑尿素為80mM，在室溫下孵育3小時，進行重折疊。通過離心分離除去聚集物后，通過使用HisTrap HP(GE HealthCare)的Ni螯合親和層析柱(IMAC)純化，用PBS透析，從而生成3種可溶性的本發(fā)明的肽21 — I 21 - 3。接著，將本發(fā)明的肽21 — I 21 — 3用0. IPBST稀釋至5iig/ml的濃度，將IOOu I該液體加入到親水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式會社制“ IWAKI微孔板
#3860 - 096”)，在室溫下孵育2小時，將本發(fā)明的肽固定。用0. IPBST洗滌6次后，通過包含2% BSA的0. IPBST(封閉劑)封閉聚苯乙烯板表面的未結(jié)合部位。進而，用0. IPBST洗滌6次后，加入100 u I的用含0. 2% BSA的0. IPBST稀釋至I 5000ng/ml的biotin-CRP(抗原)，在室溫下孵育I小時，使其與本發(fā)明的肽進行抗原抗體反應。進而，用0. IPBST洗滌6次后，加入100 u I用包含0. 2% BSA的0. IPBST稀釋至5000倍的HRP標記鏈霉親和素，在室溫下孵育30分鐘，用0. IPBST洗滌6次后，加入顯色底物顯色30分鐘。30分鐘后，用酶標儀(TECAN制“SUNRISE Remote”)測定405nm下的吸光度，對序列號23 25所示的原肽即21 — I 21 — 3單鏈抗體、實施例20中的用本發(fā)明的氨基酸序列2標記的本發(fā)明的肽20、原肽20也進行同樣的處理，測定吸光度。進而，在PBS中將5 u g/ml的原肽20固定在疏水性的聚苯乙烯板(貝克頓-迪金森公司制“BD Falcon微孔板# 351172”)，然后測定吸光度。圖13表示實施例24的測定結(jié)果。圖13中，黑色圓點( )、黑色三角和黑色正方形分別為序列號26、27、28所示的本發(fā)明的肽21 — 1、21 — 2、21 — 3的結(jié)果，白色圓圈(〇)、空心的三角(A)和空心的方形(□)分別為序列號23、24、2 5所不的原肽21 — 1、21 — 2、21 —3的結(jié)果。進而，黑色菱形( )為本發(fā)明的肽20的結(jié)果，空心的菱形( )為原肽20小鼠單克隆抗人CRP抗體(ORIENTAL酵母社制、# 4715500)的結(jié)果。X形記號為原肽20固定在疏水性的聚苯乙烯板進行實驗的結(jié)果。圖11中，縱軸為吸光度(405nm),橫軸為biotin-CRP的濃度(ng/ml)。由圖13能夠確認的是，原肽21 — 1、21 — 2、21 — 3 (O、A、□)以及原肽20 (O)在親水性的聚苯乙烯表面幾乎未被活化，而本發(fā)明的肽21 - 1、21-2、21-3(黑色圓點、黑色三角、黑色正方形)盡管單鏈抗體的氨基酸序列不同但都維持了高的抗原結(jié)合活性。此外，用本發(fā)明的氨基酸序列2標記的本發(fā)明的肽20 ( )選擇性固定在親水性的聚苯乙烯板上，也顯示出高的抗原結(jié)合活性。與以前用于ELISA的固定在疏水性聚苯乙烯板上的小鼠單克隆抗體(原肽20)的結(jié)果(X)相比，具有本發(fā)明的氨基酸序列2的本發(fā)明的肽20以及21 -
1、21 — 2和21 — 3獲得了相同或更高的信號。由以上結(jié)果能夠確認的是，通過生產(chǎn)在各種單鏈抗體的C末端側(cè)導入有本發(fā)明的氨基酸序列2的本發(fā)明的肽21 - 1、21 - 2、21 - 3，能夠以維持較高抗原結(jié)合活性的狀態(tài)固定在親水性的聚苯乙烯板。此外，能夠確認的是，通過用本發(fā)明的氨基酸序列2標記單克隆抗體，能夠以維持較高抗原結(jié)合活性的狀態(tài)固定在親水性的聚苯乙烯板。[實施例25](純化后的變性的本發(fā)明的肽21— 1，22 — I和23 — I的固相重折疊以及活性值評價)本實施例中，為了評價純化后的變性的本發(fā)明的肽21 — 1，22 — I和23 — I在固
定狀態(tài)下的重折疊和活性值，使這些肽與親水性的聚苯乙烯表面結(jié)合，測定抗原抗體反應的活性值。首先，制備各純化后的變性的本發(fā)明的肽21 - 1(序列號26)，22 — 1(序列號29)和23— 1(序列號31)，使得變性劑尿素的終濃度為4M，從而制作試樣。接著，將20iU的各試樣加入到親水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式會社制“ IWAKI微孔板# 3860 —096”)，用攪拌機攪拌后，在室溫下孵育I小時，將本發(fā)明的肽固定(每孔的scFv的重量為0. 5iig/孔)。用0. IPBST洗滌6次后，通過含2% BSA的0. IPBST (封閉劑)封閉聚苯乙烯板表面的未結(jié)合部位。進而，用0. IPBST洗滌6次后，加入IOOu I用包含0. 2% BSA的0. IPBST稀釋至I 5000ng/ml的biotin-CRP (抗原)，在室溫下孵育I小時，使其與本發(fā)明的肽進行抗原抗體反應。進而，用0. IPBST洗滌6次后，加入100 u I用包含0. 2% BSA的0. IPBST稀釋至5000倍的HRP標記鏈霉親和素，在室溫下孵育30分鐘，用0. IPBST洗滌6次后，加入顯色底物顯色30分鐘。30分鐘后，使用酶標儀(TECAN制“SUNRISE Remote”)測定405nm下的吸光度。對原肽21 — I (序列號23)進行同樣的處理，測定吸光度。圖14表示實施例25的測定結(jié)果。圖14中，黑色圓點( )為純化后的變性的本發(fā)明的肽21 - I的結(jié)果，黑色三角為純化后的變性的本發(fā)明的肽22 - I的結(jié)果，黑色正方形為純化后的變性的本發(fā)明的肽23 - I的結(jié)果，白色圓圈(〇)為原肽21 - I的結(jié)果。圖14中，縱軸為吸光度(405nm)，橫軸為biotin-CRP的濃度(ng/ml)。由圖14能夠確認的是，原肽21 - I單鏈抗體(〇)幾乎未被活化，純化后的變性的本發(fā)明的肽21 - 1、22 — I和23 — I均被活化。即，通過使用本發(fā)明的氨基酸序列，使變性的本發(fā)明的肽21 — 1、22 — I和23 — I與固相接觸，從而在固定的同時進行使變性復性
的重折疊。進而，能夠確認的是，在C末端側(cè)導入有本發(fā)明的氨基酸序列2的本發(fā)明的肽
21- I、在重鏈可變區(qū)和連接肽之間導入有本發(fā)明的氨基酸序列2的本發(fā)明的肽22 — I均為同等程度的活性，相對于此，在C末端側(cè)和重鏈可變區(qū)與連接肽之間兩處導入有本發(fā)明的氨基酸序列2的本發(fā)明的肽23 - I獲得了更高的活性。[實施例26](純化后的變性的本發(fā)明的肽21— 2、22 — 2和23 — 2的固相重折疊以及活性值評價)本實施例中，為了評價純化后的變性的本發(fā)明的肽21 — 2、22 — 2和23 — 2在固
定狀態(tài)下的重折疊和活性值，使這些肽與親水性的聚苯乙烯表面結(jié)合，測定抗原抗體反應的活性值。本實施例的基本操作與實施例25相同，為慎重起見將若干變更的條件記載如下。首先，通過包含1%的Tween20的PBS來制備溶液，使得變性劑尿素的終濃度為4M、各純化后的變性的本發(fā)明的肽21 — 2 (序列號27)、22 — 2 (序列號30)和23 — 2 (序列號32)為10 ii g/ml,從而制作試樣。接著,將100 ii I各試樣加入到親水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式會社制“IWAKI微孔板# 3860 — 096”)，用攪拌機攪拌后，在室溫下孵育3小時，將本發(fā)明的肽固定。用0. IPBST洗滌6次后，加入300 U I包含2% BSA的0. IPBST (封閉劑),在室溫下孵育I小時,封閉聚苯乙烯板表面的未結(jié)合部位。進而，用0. IPBST洗滌6次后，加入IOOu I用包含0. 2% BSA的0. IPBST稀釋至I 5000ng/ml的biotin-CRP (抗原)，在室溫下孵育I小時，使其與本發(fā)明的肽進行抗原抗體反應。進而，用0. IPBST洗滌6次后，加入100 u I用包含0. 2% BSA的0. IPBST稀釋至5000倍的HRP標記鏈霉親和素，在室溫下孵育I小時。進而，用0. IPBST洗漆后6次后,加入IOOii I顯色底物，顯色30分鐘。30分鐘后，使用酶標儀(TECAN制“SUNRISE Remote”)測定405nm下的吸光度。對原肽21 —2 (序列號24)也進行同樣的處理，測定吸光度。圖15表示實施例26的測定結(jié)果。圖15中，黑色圓點( )為純化后的變性的本發(fā)明的肽21 - 2的結(jié)果，黑色三角為純化后的變性的本發(fā)明的肽22 - 2的結(jié)果，黑色正方形為純化后的變性的本發(fā)明的肽23 - 2的結(jié)果，白色圓圈(〇)為原肽21 - 2的結(jié)果。圖15中，縱軸為吸光度(405nm)，橫軸為biotin-CRP的濃度(ng/ml)。由圖15能夠確定的是，原肽21 — 2單鏈抗體(〇)幾乎未被活化，純化后的變性的本發(fā)明的肽21 — 2，22 — 2和23 — 2均被活化。S卩，與實施例25同樣地，本實施例也能夠確認通過使用本發(fā)明的氨基酸序列，使變性的本發(fā)明的肽21 — 2, 22 — 2和23 — 2與固相接觸，從而在固定的同時對變性進行復性并進行重折疊。進而，能夠確認的是，在C末端側(cè)導入有本發(fā)明的氨基酸序列2的本發(fā)明的肽
21- 2的活性，比在重鏈可變區(qū)和連接肽之間導入有本發(fā)明的氨基酸序列2的本發(fā)明的肽
22- 2的活性高，但在此之上，在C末端側(cè)和重鏈可變區(qū)與連接肽之間兩處導入有本發(fā)明的氨基酸序列2的本發(fā)明的肽23 - 2獲得了更高的活性。[實施例27](純化后的變性的本發(fā)明 的肽21— I對固相的結(jié)合性能以及活性值評價)本實施例中，評價純化后的變性的本發(fā)明的肽21 — I (序列號26)的量與對親水性的聚苯乙烯表面的結(jié)合性能和活性值的關(guān)系。首先，用SM尿素進行調(diào)整，使得純化后的變性的本發(fā)明的肽21 — I濃度分別達到3. 2 ii g/ml、32 v- g/ml和320 u g/ml,從而制成試樣。接著,將10 y I的各試樣分別加入到親水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式會社制“ IWAKI微孔板# 3860 — 096”)，再向各孔加入90iil0. IPBST稀釋至10倍，在4°C下孵育一夜，將本發(fā)明的肽21-1固定。用0. IPBST洗滌6次后，通過含2% BSA的0. IPBST (封閉劑)封閉聚苯乙烯板表面的未結(jié)合部位。進而，用0. IPBST洗滌6次后，加入100 ill用含0. 2 % BSA的0. IPBST稀釋至I 5000ng/ml的biotin-CRP(抗原),在室溫下孵育I小時,使其與本發(fā)明的肽進行抗原抗體反應。進而，用0. IPBST洗滌6次后，加入IOOiU用含0. 2% BSA的0. IPBST稀釋至1000倍的HRP標記鏈霉親和素，在室溫下孵育30分鐘，用0. IPBST洗滌6次后，加入顯色底物顯色30分鐘。30分鐘后，使用酶標儀(TECAN制“SUNRISE Remote”)測定405nm下的吸光度。圖16表示實施例27的測定結(jié)果。圖16中，黑色圓點( )是純化后的變性的本發(fā)明的肽21 - I的量在每孔中為0. 032 ii g時的結(jié)果，黑色三角是每孔中為0. 32iig時的結(jié)果，黑色正方形是每孔中為3. g時的結(jié)果。圖16中，縱軸為吸光度(405nm)，橫軸為biotin-CRP 的濃度(ng/ml)。由圖16能夠確認的是，純化后的變性的本發(fā)明的肽21 - I在親水性的聚苯乙烯表面被活化。即，通過使用本發(fā)明的氨基酸序列，對親水性的聚苯乙烯基板顯示出特異性結(jié)合性能，從而在固定的同時也能夠進行對變性復性的重折疊。[實施例28](利用固定未純化的變性的本發(fā)明的肽21— I 21 — 3進行的分離純化以及活性值評價)本實施例中，評價利用將未純化的變性的本發(fā)明的肽21 — I 21 — 3(序列號26、27、28)固定在親水性的聚苯乙烯表面進行分離純化的可能性和在固定狀態(tài)下的活性值。首先，用0. 1PBST,對未純化的變性的本發(fā)明的肽21 — I 21 — 3以及3. 2mg/ml的純化后的變性的本發(fā)明的肽21 — I進行稀釋，獲得稀釋至10倍的試樣以及稀釋至100倍的試樣，將上述試樣分別以200 ii I的量加入到親水性的聚苯乙烯板(AGC Techno Glass株式會社制“IWAKI微孔板# 3860 — 096”)，在4°C下孵育一夜，將本發(fā)明的肽固定。用0. IPBST洗滌6次后，通過含2% BSA的0. IPBST (封閉劑)封閉聚苯乙烯板表面的未結(jié)合部位。進而，用0. IPBST洗滌6次后，加入100 ill用含0. 2 % BSA的0. IPBST稀釋至I 5000ng/ml的biotin-CRP(抗原),在室溫下孵育I小時,使其與本發(fā)明的肽進行抗原抗體反應。進而，用0. IPBST洗滌6次后，加入IOOiU用含0. 2% BSA的0. IPBST稀釋至1000倍的HRP標記鏈霉親和素，在室溫下孵育30分鐘，用0. IPBST洗滌6次后，加入顯色底物顯色30分鐘。30分鐘后，使用酶標儀(TECAN制造“SUNRISE Remote”)測定405nm下的吸光度。圖17的(a)為稀釋至10倍時的測定結(jié)果，圖17的(b)為稀釋至100倍時的測定結(jié)果。圖17的(a)和(b)中，黑色圓點( )為未純化的變性的本發(fā)明的肽21 - I的結(jié)果，黑色三角為未純化的變性的本發(fā)明的肽21 - 2的結(jié)果，黑色正方形為未純化的變性的本發(fā)明的肽21 - 3的結(jié)果，白色圓圈(〇)為純化后的變性的本發(fā)明的肽21 - I的結(jié)果。圖17的(a)和(b)中，縱軸為吸光度(405nm)，橫軸為biotin-CRP的濃度(ng/ml)。由圖17能夠確認的是，即使是未純化的狀態(tài)也能固定 親水性的聚苯乙烯表面并被活化。即，通過使用本發(fā)明的氨基酸序列，本發(fā)明的肽與親水性的聚苯乙烯板特異性結(jié)合，因此能夠作為生產(chǎn)中的分離純化工序來利用，并且，由于能被活化，因此還能進行重折疊。序列表自由文本序列號I :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號2 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號3 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號4 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號5 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號6 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號7 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號8 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號9 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號10 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號11 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號12 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號13 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號14 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號15 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號16 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號17 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號18 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號19 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號20 :對親水性的固體表面具有特異親和性的肽。序列號21 :合成DNA。序列號22 :合成DNA。序列號23 :單鏈抗體。序列號24 :單鏈抗體。序列號25 :單鏈抗體。序列號26 :對親水性的固體表面具有特異親和性的單鏈抗體。序列號27 :對親水性的固體表面具有特異親和性的單鏈抗體。序列號28 :對親水性的固體表面具有特異親和性的單鏈抗體。
序列號29 :對親水性的固體表面具有特異親和性的單鏈抗體。序列號30 :對親水性的固體表面具有特異親和性的單鏈抗體。序列號31 :對親水性的固體表面具有特異親和性的單鏈抗體。序列號32 :對親水性的固體表面具有 特異親和性的單鏈抗體。
權(quán)利要求
1.一種復性肽的生產(chǎn)方法，其特征在于，使包含(a)具有對固相表現(xiàn)出特異性吸附功能的氨基酸序列且包涵體狀態(tài)的變性的肽、(b)變性劑和(c)雜質(zhì)的溶液接觸所述固相表面，從而使所述肽直接吸附在所述固相表面，對所述變性的肽的立體結(jié)構(gòu)進行復性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述肽包含形成抗原結(jié)合部位的可變區(qū)，在比重鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)或比輕鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)，具有所述氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述溶液含有生成了所述肽的宿主的破碎物、培養(yǎng)基或分泌物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述氨基酸序列為序列表中的序列號I 20所不的任一氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4中任一項所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，在所述肽直接吸附在所 述固相表面的狀態(tài)下，除去所述變性劑從而對所述變性的肽的立體結(jié)構(gòu)進行復性。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 5中任一項所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述氨基酸序列對經(jīng)過親水化處理的樹脂表面的固相表現(xiàn)出特異性吸附功能，所述肽直接吸附在所述樹脂表面的固相。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述樹脂表面為親水性的聚苯乙烯表面。
8.一種固定有肽的固相的生產(chǎn)方法，其特征在于，將包含編碼肽的堿基序列的基因?qū)胨拗髦行纬赊D(zhuǎn)化體，并使包含其生成物的溶液與所述固相表面接觸，從而使所述肽直接吸附在所述固相表面，所述肽具有對所述固相表現(xiàn)出特異性吸附功能的氨基酸序列。
9.一種固定有肽的固相的生產(chǎn)方法，其特征在于，使包含具有對固相表現(xiàn)出特異性吸附功能的氨基酸序列且包涵體狀態(tài)的變性的肽、變性劑和雜質(zhì)的溶液接觸所述固相表面，從而使所述肽直接吸附在所述固相表面，對所述變性的肽的立體結(jié)構(gòu)進行復性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的固定有肽的固相的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述溶液包含生成了所述肽的宿主的破碎物、培養(yǎng)基或分泌物。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的固定有肽的固相的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述宿主為酵母。
12.根據(jù)權(quán)利要求8 11中任一項所述的固定有肽的固相的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述肽包含形成抗原結(jié)合部位的可變區(qū)，在比重鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)或比輕鏈的可變區(qū)靠近C末端一側(cè)，具有所述氨基酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求8 12中任一項所述的固定有肽的固相的生產(chǎn)方法，其特征在于，所述氨基酸序列為序列表中的序列號I 20所示的任一氨基酸序列。
全文摘要
本發(fā)明提供一種肽、該肽的用途和生產(chǎn)方法以及固定有該肽的固相和其生產(chǎn)方法。該肽的生產(chǎn)方法為使包含(a)具有對固相表現(xiàn)出特異性吸附功能的氨基酸序列且包涵體狀態(tài)的變性的肽、(b)變性劑和(c)雜質(zhì)的溶液接觸所述固相表面，從而使所述肽直接吸附在所述固相表面，對所述變性的肽的立體結(jié)構(gòu)進行復性。
文檔編號C07K1/14GK102746374SQ20121024578
公開日2012年10月24日 申請日期2009年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月14日
發(fā)明者大瀨琢人, 小池充烈, 尻谷優(yōu)希, 岸本通雅, 濱崎今日子, 熊田陽一 申請人:國立大學法人京都工藝纖維大學, 恩普樂股份有限公司