本發(fā)明屬于微生物篩選及應用技術領域，具體涉及一株耐高溫產纖維素酶菌及其應用，主要用于產纖維素酶和秸稈類農業(yè)固體廢棄物的資源化。

背景技術：

纖維素是自然界中分布最廣、儲量最大的碳水化合物。植物細胞壁主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，其中纖維素和半纖維素的最小組成單元為葡萄糖、木糖、半乳糖和阿拉伯糖。只有將這些戊糖和己糖由植物纖維中提取和分離出來，纖維素資源才能得到有效的利用。然而，作為一種可再生資源，纖維素并沒有得到充分開發(fā)和高效利用，如農業(yè)固體廢棄物中的秸稈、稻草和蔗渣等利用率不高。

我國每年伴隨農業(yè)活動產生的秸稈數(shù)量巨大，其中玉米秸稈在北方地區(qū)最為常見。蠟質化后，玉米秸稈的纖維素和半纖維素總含量能夠達到其干重的50%以上，經過有效的處理能夠用于制取肥料、飼料、生活燃料和食用菌基料等。

自然界中存在大量能夠產生纖維素酶的真菌和細菌，這類微生物資源經分離、篩選和馴化后一般具有纖維素降解效率高、對人畜無害、作用條件溫和等優(yōu)點，在農業(yè)固體廢棄物資源化方面具有廣闊的應用前景。因此，不斷篩選高產纖維素酶的菌株并開發(fā)相應的技術應用對于我國農業(yè)資源再利用意義重大。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株耐高溫產纖維素酶菌及其應用,以纖維素為底物時高溫培養(yǎng)能夠獲得較高的產酶能力，提高秸稈類農業(yè)廢棄物堆肥或制取食用菌培養(yǎng)基等再利用的效率。

本發(fā)明中的耐高溫產纖維素酶菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），命名為AW1601，2016年6月24日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路中科院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.12650。

菌株AW1601分離自蚯蚓養(yǎng)殖場牛糞與秸稈混合物，革蘭氏染色為陽性，菌落呈乳白色、圓形無凸起，單個菌體成桿狀，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后菌體長1.5-2.5 μm。采用引物27F和1448R進行16S rRNA基因的PCR擴增，得到rDNA序列提交GenBank獲得菌株序列號JQ973708，BLAST同源性比對與至少30種枯草芽孢桿菌具有99%的同源性，鑒定AW1601為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

使用LB培養(yǎng)基時，菌株存活條件為：溫度20-75℃，pH 6.5-8.0。

使用玉米秸稈作為碳源（每1000 mL水中含秸稈10.0 g，NaCl 5.0 g，KH₂PO₄ 1.0 g，MgSO₄ 0.2 g，蛋白胨1.0 g，酵母粉1.0 g），菌株AW1601最佳產酶條件為溫度50℃，pH 7.0。培養(yǎng)3 d后CMC酶活力達到138.0 IU/mL，F(xiàn)PA酶活力達到178.4 IU/mL。

使用玉米秸稈作為底物，底物濃度5%-10%，液態(tài)發(fā)酵時的最佳溫度為50℃，經過7 d底物降解28.4%，底物中纖維素和半纖維素含量分別減少61.5%和59.9%；固態(tài)發(fā)酵的最佳溫度為55℃，經過7 d底物降解19.5%，底物中纖維素和半纖維素含量分別減少了37.2%和41.1%。

本發(fā)明涉及的菌株AW1601屬新發(fā)現(xiàn)菌種，分離于蚯蚓養(yǎng)殖場牛糞和玉米秸稈混合物，蚯蚓通過對混合物的破碎、加工與消化從而改善微生物生長基質，改變混合物中微生物群落組成和活性，因此菌株AW1601對玉米秸稈的利用具有非常強的專一性，高效降解底物中的纖維成分。以往纖維素降解菌一般取自反芻動物糞便、腐爛枯樹葉、樹枝或深山腐殖質豐富的土壤，對于秸稈的專一性相比較弱。

菌株AW1601在較高培養(yǎng)溫度下具有高纖維素酶產酶能力，相比常溫菌，其應用于生物質固廢堆肥、食用菌培養(yǎng)基材料生產中更具優(yōu)勢，3 d即達到產酶峰值，CMC酶活力達到138.0 IU/mL，濾紙酶活力達到178.4 IU/mL，適合應用于纖維素酶的生產中，縮短生產周期，降低成本。

附圖說明

圖1為菌株AW1601剛果紅平板染色結果。

圖2為電子顯微鏡下菌株AW1601的形態(tài)，其中A放大倍數(shù)為3000倍，B為9000倍。

圖3為溫度和時間對菌株AW1601 CMC酶活力的影響。

圖4為溫度和時間對菌株AW1601 FPA酶活力的影響。

圖5為溫度對菌株AW1601降解玉米秸稈效果的影響。

具體實施方式

實施例1：菌株的分離、篩選與鑒定

菌株AW1601分離于天津市某蚯蚓養(yǎng)殖場牛糞與秸稈混合物。取土樣5 g，無菌水過濾去除殘渣，收集濾液，取上清液按照1/10、1/100、1/1000、1/10000倍的梯度稀釋，將稀釋液涂在LB固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)，出現(xiàn)菌落后反復劃線分離，得到純菌株后移至LB試管培養(yǎng)基4℃保存。

將純化后的菌株分別點種在羧甲基纖維素鈉平板培養(yǎng)基（CMC-Na 15 g，NaCl 5 g，KH₂PO₄ 1 g，MgSO₄ 0.2 g，蛋白胨1.0 g，酵母粉1.0 g，瓊脂18 g，去離子水1000 mL，pH7.2）上，每個培養(yǎng)基點3個樣，37℃靜置培養(yǎng)4 d，用1 mg/mL剛果紅染液染色20 min，棄去染液后加入1 mol/L NaCl溶液，洗滌20 min后測量菌落與透明圈直徑，分別用D和H來表示（圖1）。根據(jù)H/D初步判斷各菌株產纖維素酶能力，經測定AW1601透明圈直徑最大，為27.4 mm，H/D為6.0，因此對AW1601進行菌種鑒定和進一步的產酶研究。

菌株AW1601革蘭氏染色顯陽性，菌落呈乳白色、圓形無凸起，電子顯微鏡3000倍和9000倍放大后的照片如圖2A和2B，使用LB培養(yǎng)基時，菌株存活條件為溫度20-75℃、pH 6.5-8.0，初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。采用引物27F和1448R進行16S rRNA基因的PCR擴增，得到的rDNA序列提交GenBank獲得菌株序列號JQ973708，依照BLAST進行同源性比對與至少30種枯草芽孢桿菌具有99%的同源性，最終鑒定AW1601為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

實施例2：菌株AW1601的產酶條件

制作玉米秸稈產酶培養(yǎng)基：秸稈10.0 g，NaCl 5.0 g，KH₂PO₄ 1.0 g，MgSO₄ 0.2 g，蛋白胨1.0 g，酵母粉1.0 g，1000 mL去離子水，121℃滅菌20 min。由于已測定菌株AW1601在不同pH下的生長曲線，顯示pH為7時生長最旺盛，因此玉米秸稈產酶培養(yǎng)基pH調制至7。

用3 mL無菌水將菌體制成菌懸液，取0.5 mL分別接種于產酶培養(yǎng)基中，于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃下120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)。每24 h取菌液，5000 r/min下離心15 min，收集上清液測定酶活。將纖維素酶每分鐘催化底物水解生成1μg葡萄糖定義為一個酶活力單位，用IU/mL表示。

CMC酶活力的測定步驟：取CMC緩沖液2.0 mL于比色管中，加入0.5 mL稀釋10倍的酶液，于50℃恒溫水浴鍋中30 min，加入3.0 mL DNS試劑，沸水浴10 min，冷卻后定容至25.0 mL，在540 nm處測OD值。FPA酶活力的測定步驟：將50 mg新華1號濾紙放入比色管，加入0.5 mL稀釋10倍的酶液，加入2.0 mL HAc-NaAc緩沖液，于50℃恒溫水浴鍋中60 min，加入3.0 mL DNS溶液，沸水浴10 min，冷卻后定容至25.0 mL，在540 nm處測OD值。測得OD值后查閱葡萄糖標準曲線，求出酶解所得葡萄糖含量，換算成相應酶活力值。

圖3和圖4為AW1601在不同溫度下培養(yǎng)5 d的酶活力曲線，由圖可知，50℃下培養(yǎng)3 d后CMC酶活力達到138.0 IU/mL，F(xiàn)PA酶活力達到178.4 IU/mL。因此最佳產酶條件為溫度50℃，pH 7.0。

實施例3：液態(tài)發(fā)酵

將菌種AW1601由斜面培養(yǎng)基接至LB培養(yǎng)基，37℃下120 r/min培養(yǎng)24 h制成種子液。

將5 g秸稈裝于100 mL蒸餾水的搖瓶中，菌種接種量為3%，發(fā)酵溫度設定為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃，120 r/min下?lián)u床培養(yǎng)7 d。

差重法計算底物降解率，公式為：

其中，X為降解率；M1為實驗組底物重量(g)；M2為空白組底物重量(g)；M為液態(tài)發(fā)酵秸稈初始添加量。

Van Soest法對測定纖維素和半纖維素含量，經測定處理前玉米秸稈纖維素和半纖維素含量分別為34.2%和25.0%。

如圖5，經7 d發(fā)酵底物在50℃下降解率最大，達到28.4%，底物中纖維素和半纖維素含量分別為18.4%和14.0%，分別減少了61.5%和59.9%。

實施例4：固態(tài)發(fā)酵

將菌種AW1601由斜面培養(yǎng)基接至LB培養(yǎng)基，37℃下120 r/min培養(yǎng)24 h制成種子液。

將秸稈粉碎至0.5-1.0 cm，取100 g干燥秸稈作為發(fā)酵底物，調整含水率至55%，菌種接種量為5%，發(fā)酵溫度設定為35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃，靜置發(fā)酵7 d。

差重法計算底物降解率，公式為：

其中，X為降解率；M1為實驗組底物重量(g)；M2為空白組底物重量(g)；M為液態(tài)發(fā)酵秸稈初始添加量。

Van Soest法對測定纖維素和半纖維素含量，經測定處理前玉米秸稈纖維素和半纖維素含量分別為34.2%和25.0%。

如圖4，經7 d發(fā)酵底物在55℃下降解率最大，達到19.5%，底物中纖維素和半纖維素含量分別為26.7%和18.3%，分別減少了37.2%和41.1%。

核苷酸或氨基序列

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）AW1601的DNA序列：

1 GCATGGGGGT GCTATACATG CAAGTCGAGC GGACAGATGG GAGCTTGCTC CCTGATGTTA

61 GCGGCGGACG GGTGAGTAAC ACGTGGGTAA CCTGCCTGTA AGACTGGGAT AACTCCGGGA

121 AACCGGGGCT AATACCGGAT GGTTGTTTGA ACCGCATGGT TCAAACATAA AAGGTGGCTT

181 CGGCTACCAC TTACAGATGG ACCCGCGGCG CATTAGCTAG TTGGTGAGGT AACGGCTCAC

241 CAAGGCAACG ATGCGTAGCC GACCTGAGAG GGTGATCGGC CACACTGGGA CTGAGACACG

301 GCCCAGACTC CTACGGGAGG CAGCAGTAGG GAATCTTCCG CAATGGACGA AAGTCTGACG

361 GAGCAACGCC GCGTGAGTGA TGAAGGTTTT CGGATCGTAA AGCTCTGTTG TTAGGGAAGA

421 ACAAGTACCG TTCGAATAGG GCGGTACCTT GACGGTACCT AACCAGAAAG CCACGGCTAA

481 CTACGTGCCA GCAGCCGCGG TAATACGTAG GTGGCAAGCG TTGTCCGGAA TTATTGGGCG

541 TAAAGGGCTC GCAGGCGGTT TCTTAAGTCT GATGTGAAAG CCCCCGGCTC AACCGGGGAG

601 GGTCATTGGA AACTGGGGAA CTTGAGTGCA GAAGAGGAGA GTGGAATTCC ACGTGTAGCG

661 GTGAAATGCG TAGAGATGTG GAGGAACACC AGTGGCGAAG GCGACTCTCT GGTCTGTAAC

721 TGACGCTGAG GAGCGAAAGC GTGGGGAGCG AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC

781 CGTAAACGAT GAGTGCTAAG TGTTAGGGGG TTTCCGCCCC TTAGTGCTGC AGCTAACGCA

841 TTAAGCACTC CGCCTGGGGA GTACGGTCGC AAGACTGAAA CTCAAAGGAA TTGACGGGGG

901 CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA TTCGAAGCAA CGCGAAGAAC CTTACCAGGT

961 CTTGACATCC TCTGACAATC CTAGAGATAG GACGTCCCCT TCGGGGGCAG AGTGACAGGT

1021 GGTGCATGGT TGTCGTCAGC TCGTGTCGTG AGATGTTGGG TTAAGTCCCG CAACGAGCGC

1081 AACCCTTGAT CTTAGTTGCC AGCATTCAGT TGGGCACTCT AAGGTGACTG CCGGTGACAA

1141 ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAATC ATCATGCCCC TTATGACCTG GGCTACACAC

1201 GTGCTACAAT GGACAGAACA AAGGGCAGCG AAACCGCGAG GTTAAGCCAA TCCCACAAAT

1261 CTGTTCTCAG TTCGGATCGC AGTCTGCAAC TCGACTGCGT GAAGCTGGAA TCGCTAGTAA

1321 TCGCGGATCA GCATGCCGCG GTGAATACGT TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA

1381 CCACGAGAGT TTGTAACACC CGAAGTCGGT GAGGTAACCT TTAGGAGCCA GCCGCCGAAG

1441 GTGAACAT