本發(fā)明涉及一種微生物制劑，特別是一種用于河道水質(zhì)修復(fù)的微生物制劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著城市對環(huán)境資源開發(fā)利用力度的增加，大量含有氮、磷營養(yǎng)物質(zhì)的污染物不斷排入城市內(nèi)的河流，使得河流富營養(yǎng)化現(xiàn)象日益嚴(yán)重，部分河段甚至發(fā)黑發(fā)臭，嚴(yán)重影響了周邊居民的生活健康。

河流水質(zhì)惡化，主要原因為城區(qū)污水處理廠的處理水排放。盡管通過提標(biāo)改造，污水廠排水可達(dá)到國家一級A標(biāo)準(zhǔn)，但處理水進(jìn)入河流后，僅依靠河流的自凈能力，很難由一級A標(biāo)準(zhǔn)達(dá)到地表水Ⅳ類水標(biāo)準(zhǔn)。這里所提到的自凈能力，指的是污染物隨污水排入水體后，水體自身經(jīng)過物理的、化學(xué)的與生物化學(xué)的作用，使污染的濃度降低或總量減少，受污染的水體部分地或完全地恢復(fù)原狀的能力。一級A標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的化學(xué)需氧量濃度為50mg/L，氨氮濃度為5mg/L，總磷濃度為0.5mg/L，而地表水Ⅳ類水標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定化學(xué)需氧量濃度為30mg/L，氨氮濃度為1.5mg/L，總磷濃度為0.3mg/L，兩類標(biāo)準(zhǔn)中各指標(biāo)之間的差距十分明顯。并由于城市人口的過度膨脹，污水處理廠的處理水量愈來愈大，處理水中所含的污染物量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了水體自凈能力的范圍之內(nèi)。加上城區(qū)排水設(shè)施老化，雨污分流管網(wǎng)全覆蓋可行性低，偷排、亂排現(xiàn)象時有發(fā)生，使得部分污水直接排入河流。此外，城區(qū)內(nèi)水域面積的縮小，河道護(hù)岸的硬質(zhì)化，防洪閘門修建對河流流動性的影響，均造成水體的自凈能力大幅降低。本發(fā)明提供一種以河道底泥為初始菌種源，制備一種復(fù)合微生物菌劑，用于直接噴灑到河道水體中，實現(xiàn)水質(zhì)快速改善，消除河道黑臭現(xiàn)象。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種治理黑臭河道的微生物菌液制備方法。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種治理黑臭河道的微生物菌液制備方法，其特點是，包括以下步驟 ：

（1）采集河道底泥，通過高通量測序?qū)嶒炦M(jìn)行底泥微生物群落多樣性分析，高通量測序流程包括對底泥DNA提取、PCR擴增和產(chǎn)物純化、Miseq上機測序；

（2）初期篩選，取河道底泥5~10g，接種于無菌脫氮菌富集培養(yǎng)液中，置于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)3~4d，接入新鮮的富集培養(yǎng)液中，擴大培養(yǎng)三次，獲得優(yōu)勢菌群初步篩選，檢測培養(yǎng)基中氨氮、硝酸鹽氮含量，取氮類積累少的混合菌液作為初篩的具有脫氮作用的菌群；

（3）優(yōu)化富集篩選，向新鮮的優(yōu)化富集培養(yǎng)基接入初期篩選的優(yōu)勢脫氮菌液，置于30~35℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，如此反復(fù)富集培養(yǎng)，直到獲得優(yōu)勢混合脫氮菌液，

（4） 在混合菌液中加入微量元素溶液，所述微量元素溶液包括ZnSO4·7H2O濃度3.93g/L、CaCl2濃度為5.5g/L、MnSO4·H2O濃度為4.32g/L、FeSO4·7H2O濃度5.0g/L、(NH4)6Mo7O2·4H2O濃度1.1g/L、CuSO4·5H2O濃度1.57g/L；CoCl2·6H2O濃度1.61g/L；

（5） 將加入微量元素的混合菌液接種于碳酸鈣和檸檬酸鈉為碳源的液體培養(yǎng)基中，碳源濃度為3g/L,設(shè)置溫度為30~35℃，進(jìn)行培養(yǎng)，得到混合菌液；

（6）混合菌液制成均勻的繁殖稀釋液，并接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，使其均勻分布于平板中，進(jìn)行培養(yǎng)。

本發(fā)明一種治理黑臭河道的微生物菌液制備方法中，進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案特征是：

１、所述脫氮菌富集培養(yǎng)基為(NH4)2SO4(132)1g，KNO3(101)2g，檸檬酸鈉（C6H5Na3O7·2H2O，294.07）6g(C/N>5)，K2HPO4 1g，七水硫酸鎂 0.2g，蒸餾水 1000ml，121℃，滅菌 20min；

2、所述微量元素溶液的pH值為8。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過提取河底泥中硝化菌、反硝化細(xì)菌在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，完成不同生長周期的協(xié)同作用，有利于維持菌群的生長穩(wěn)定和增強抗擊外界環(huán)境波動的能力。隨后，菌液從渾濁開始減小，菌體生長率小于死亡率，活細(xì)胞數(shù)顯著下降，菌體衰亡并自溶。優(yōu)化培養(yǎng)基中同時存在有機和無機碳源可以同時滿足好氧反硝化、異養(yǎng)硝化和部分自養(yǎng)硝化的需求，迅速達(dá)到脫氮效果，河道底泥為初始菌種源，用于直接噴灑到河道水體中，實現(xiàn)水質(zhì)快速改善，消除河道黑臭現(xiàn)象。

具體實施方式

進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成其權(quán)力的限制。

實施例1，一種治理黑臭河道的微生物菌液制備方法，其特點是，包括以下步驟 ：

（1） 采集河道底泥，通過高通量測序?qū)嶒炦M(jìn)行底泥微生物群落多樣性分析，高通量測序流程包括對底泥DNA提取、PCR擴增和產(chǎn)物純化、Miseq上機測序；

（2） 初期篩選，取河道底泥5~10g，接種于無菌脫氮菌富集培養(yǎng)液中，置于30℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)3~4d，接入新鮮的富集培養(yǎng)液中，擴大培養(yǎng)三次，獲得優(yōu)勢菌群初步篩選，檢測培養(yǎng)基中氨氮、硝酸鹽氮含量，取氮類積累少的混合菌液作為初篩的具有脫氮作用的菌群；

（3） 優(yōu)化富集篩選，向新鮮的優(yōu)化富集培養(yǎng)基接入初期篩選的優(yōu)勢脫氮菌液，置于30~35℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，如此反復(fù)富集培養(yǎng)，直到獲得優(yōu)勢混合脫氮菌液，

（4） 在混合菌液中加入微量元素溶液，所述微量元素溶液包括ZnSO4·7H2O濃度3.93g/L、CaCl2濃度為5.5g/L、MnSO4·H2O濃度為4.32g/L、FeSO4·7H2O濃度5.0g/L、(NH4)6Mo7O2·4H2O濃度1.1g/L、CuSO4·5H2O濃度1.57g/L；CoCl2·6H2O濃度1.61g/L；

（5） 將加入微量元素的混合菌液接種于碳酸鈣和檸檬酸鈉為碳源的液體培養(yǎng)基中，碳源濃度為3g/L,設(shè)置溫度為30~35℃，進(jìn)行培養(yǎng)，得到混合菌液；

（6） 混合菌液制成均勻的繁殖稀釋液，并接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，使其均勻分布于平板中，進(jìn)行培養(yǎng)。

實施例2，實施例1所述的一種治理黑臭河道的微生物菌液制備方法，所述脫氮菌富集培養(yǎng)基為(NH4)2SO4(132)1g，KNO3(101)2g，檸檬酸鈉（C6H5Na3O7·2H2O，294.07）6g(C/N>5)，K2HPO4 1g，七水硫酸鎂 0.2g，蒸餾水 1000ml，121℃，滅菌 20min。

實施例3，實施例1所述的一種用于河道水質(zhì)修復(fù)的微生物制劑，所述微量元素溶液的pH值為8。

實施例4選用平板計數(shù)法，利用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行分離。將待測菌液經(jīng)適當(dāng)稀釋之后，其中的微生物充分分散成單個細(xì)胞，取定量的稀釋樣液接種到平板上，經(jīng)過培養(yǎng)，由單個細(xì)胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落代表一個單細(xì)胞。統(tǒng)計菌數(shù)，根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣換算出混合菌液中的含菌數(shù)。

改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基中碳源、溫度、pH、硝氮等條件，培養(yǎng)5d~7d，檢測培養(yǎng)基中氨氮、總氮含量考察菌群效果。

在初期混合脫氮菌篩選中，分別選取1%、3%、4%、5%的接種污泥量。初期富集培養(yǎng)兩個周期，考察接種不同量的污泥對混合菌液脫氮效果的影響。

在有機碳ρ(C)為1.5g/L、無機碳ρ(C)為0.5g/L的條件下，考察不同碳源種類對細(xì)菌生長和總氮去除率的影響。將混合菌液分別接種于以碳酸鈣、碳酸氫鈉、乙酸鈉、檸檬酸鈉、碳酸氫鈉+檸檬酸鈉、碳酸鈣+乙酸鈉、碳酸氫鈉+乙酸鈉、碳酸鈣+檸檬酸鈉(8)作為碳源的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3~5天，取樣測定氮類指標(biāo)?；旌咸荚吹臈l件下總氮的去除率明顯高于投加單一碳源，單一投加有機碳源總氮去除率高于單一投加無機碳源。無機碳源的條件下殘留的硝態(tài)氮較多，降低了總氮去除率；有機碳源的總氮去除率較高，說明混合菌液中存在一定的異養(yǎng)反硝化菌。硝化菌群以CO32-或CO2為碳源，而反硝化菌以有機碳為碳源?；旌咸荚吹臈l件下脫氮效果較好，說明以單一的無機碳源或有機碳源均不能滿足混合微生物協(xié)同生長和降解氨氮、硝態(tài)氮的需要。以總氮去除率>50%為標(biāo)準(zhǔn)，在ρ(C)為1.5g/L的條件下，進(jìn)一步考察添加組合碳源對脫氮效果的影響。將混合菌液分別接種于以碳酸氫鈉+檸檬酸鈉(1)、碳酸鈣+乙酸鈉、碳酸氫鈉+乙酸鈉、碳酸鈣+檸檬酸鈉、檸檬酸鈉為碳源的液體培養(yǎng)基中，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5天，取樣測定氮類指標(biāo)。綜合考慮總氮及氨氮的去除效果，選擇碳酸鈣+檸檬酸鈉作為組合碳源添加。

實施例5微量元素溶液：ZnSO4·7H2O濃度3.93g/L;CaCl2濃度為5.5g/L；MnSO4·H2O濃度為4.32g/L；FeSO4·7H2O濃度5.0g/L；(NH4)6Mo7O2·4H2O濃度1.1g/L；CuSO4·5H2O濃度1.57g/L；CoCl2·6H2O濃度1.61g/L。

將混合菌液分別接種于以碳酸鈣+檸檬酸鈉為碳源，pH為7.5的液體培養(yǎng)基中，加入不同量的微量元素，體積比設(shè)置為0、0.2、0.4、0.8ml/L，在35℃生化培養(yǎng)箱下培養(yǎng)5天后取樣測定含氮量，微量元素對混合菌體的脫氮效率影響非常大，加入微量后菌體的降解效率明顯提高。微量元素配方中含有多種金屬離子，如Zn2+、Co2+、Mn2+、Fe2+，對于菌體的生物脫氮有著明顯的促進(jìn)作用。隨著微量元素投加量的增大，脫氮率有所下降，說明過多的金屬離子對菌體的反硝化性能可能會產(chǎn)生一定的抑制作用，但在0.2~0.8ml/L之間，都在78%以上。最優(yōu)條件選擇加入0.4ml/L的微量元素。

將混合細(xì)菌分別接種于碳酸鈣+檸檬酸鈉為碳源的液體培養(yǎng)基中，碳源濃度為3g/L,微量元素為0.4ml/L,設(shè)置初始pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，放在35℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)中培養(yǎng)4天后取樣測定含氮量， pH對生物脫氮影響較為明顯。pH從6增加到9時，脫氮率呈上升趨勢；當(dāng)pH在7~9時，反硝化效果無顯著差異，混合菌液中菌體適宜在偏堿性環(huán)境下生存，pH過低或過高，可能會使酶的活性下降，從而抑制其生長。在酸性條件下，硝酸根與氫離子結(jié)合生成硝酸進(jìn)入細(xì)胞膜阻礙了反硝化所需的能量合成,這使得好氧反硝化下硝酸鹽還原酶的活性受到影響，無法進(jìn)行反硝化；同時也影響了厭氧反硝化下亞硝酸還原酶的活性，產(chǎn)生一定量的亞硝酸鹽積累。后續(xù)實驗以pH為8為最優(yōu)條件。

將混合細(xì)菌分別接種于碳酸鈣+檸檬酸鈉為碳源的液體培養(yǎng)基中，碳源濃度為3g/L,微量元素為0.4ml/L，pH為8的液體培養(yǎng)基中，設(shè)置溫度分別為20、25、30、35、40℃，培養(yǎng)4天后取樣測定含氮量，研究表明，硝化菌生長溫度為25℃~30℃，低于15℃時，硝化反應(yīng)速率開始明顯降低，其活性低于5℃時幾乎會喪失。在適宜的溫度范圍內(nèi)，溫度每提高10℃，酶促反應(yīng)速率將提高1~2倍。溫度對反硝化作用有顯著的影響，25~35℃之間，溫度越高反硝化速率越高。溫度為30~35℃范圍內(nèi)，混合細(xì)菌的脫氮速率增至最大。當(dāng)溫度低于30℃時，菌群的生長緩慢，因溫度支配著酶反應(yīng)力學(xué)、微生物生長速度以及化合物的溶解度等，可能是由于溫度過低，影響了酶的活性，影響菌群(硝化)的生長和硝化作用。當(dāng)溫度高于40℃時，高溫使得亞硝酸鹽還原酶失去活性，硝酸鹽還原酶并無受到高原影響，硝酸氮的還原速率明顯高于亞硝酸氮，使得硝酸鹽全部還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽無法進(jìn)一步還原所以造成累積過多，從而導(dǎo)致總氮的去除率下降。混合細(xì)菌在30~35℃時對氮類的去除率較高，且趨于穩(wěn)定，故選擇30℃作為最優(yōu)的生化培養(yǎng)溫度。