本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株具有分泌生產(chǎn)高酶活堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，在自然界中分布廣泛，可產(chǎn)生多種酶類和抗生物質(zhì)。目前，地衣芽孢桿菌已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)、食品、飼料加工、環(huán)境污染治理等各個行業(yè)，是芽孢桿菌中較具有應(yīng)用潛力的菌種之一。地衣芽孢桿菌能用于高效發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶。

堿性蛋白酶廣泛應(yīng)用于食品和飼料工業(yè)，應(yīng)用于水解蛋白質(zhì)，其水解產(chǎn)物作為高營養(yǎng)物質(zhì)用于添加在嬰兒食品、食療產(chǎn)品、果汁、飼料中。堿性蛋白酶具有角蛋白酶活，用于降解含有角蛋白的物質(zhì)添加到飼料中；利用蛋白酶水解作用的逆反應(yīng)合成短肽；堿性蛋白酶處理皮革，如浸泡、脫毛、軟化工序，不僅能夠減少對環(huán)境的危害而且在一些方面具有優(yōu)勢,如容易控制、速度快、廢液少，屬于環(huán)境友好型的加工方式；降解廢棄物中的蛋白質(zhì),從而降低水生態(tài)系統(tǒng)的需氧量。在家禽屠宰工業(yè)中,用具有角蛋白水解作用的堿性蛋白酶處理羽毛廢棄物,處理后的廢棄物能夠作為飼料的添加物,提高家禽的利用功能；堿性蛋白酶應(yīng)用于洗滌劑，不僅有出色的清潔能力，還具有全新的性能收益、織物恢復(fù)、高性能等優(yōu)點。

蛋白酶的廣泛使用改進(jìn)了有關(guān)行業(yè)的生產(chǎn)工藝,降低原材料的消耗,節(jié)約了成本,提高了產(chǎn)品的質(zhì)量,且減少了對環(huán)境的影響。與中性蛋白酶相比,堿性蛋白酶具有著更強(qiáng)的水解能力和耐堿能力,而堿性蛋白酶銷量又占蛋白酶總銷量的50%以上,所以堿性蛋白酶的研究成為蛋白酶研究的熱點?，F(xiàn)今，國際酶制劑公司占據(jù)全球蛋白酶供應(yīng)量的95%，與之相比,嚴(yán)格的說我國現(xiàn)有的很多酶制劑實際上沒有達(dá)到質(zhì)量要求,很多都是酶的粗制品,這有多方面的原因,一是我國的純化工藝與國外水平有一定的差距,二是沒有建立新的堿性蛋白酶高產(chǎn)表達(dá)宿主系統(tǒng),也沒有解決革蘭氏陽性菌胞外酶的分泌問題,導(dǎo)致現(xiàn)今國外的公司在蛋白酶銷售領(lǐng)域的壟斷。蛋白酶的表達(dá)和純化問題是我國蛋白酶生產(chǎn)和研究亟待解決的一個問題。國外對堿性蛋白酶的研究比較早,一些產(chǎn)品化的堿性蛋白酶類,都已經(jīng)研究得比較透徹,諾維信公司對其酶產(chǎn)品進(jìn)行了很多突變研究，且都申請了專利,所以要篩選新的堿性蛋白酶生產(chǎn)菌株并對其蛋白酶進(jìn)行研究十分必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的地衣芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明是從天津濱海新區(qū)大港水庫的土壤中分離篩選出一株堿性蛋白酶高產(chǎn)菌株，該高產(chǎn)菌株能高效分泌表達(dá)堿性蛋白酶，酶活力較高，為低成本、規(guī)模化生產(chǎn)堿性蛋白酶奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明的優(yōu)勢是：（1）地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BLP-1 是從天津濱海新區(qū)大港水庫的土壤中分離出來的，在發(fā)酵過程中能產(chǎn)生高活性的堿性蛋白酶。（2）地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BLP-1生長迅速，具有較強(qiáng)分解蛋白的能力。

本發(fā)明通過分離篩選的方法獲得了一株高產(chǎn)堿性性蛋白酶的地衣芽孢桿菌。所述菌株能顯著提高堿性性蛋白酶的產(chǎn)量，搖瓶發(fā)酵酶活高達(dá)2200U/ml，且該菌株株表達(dá)的堿性蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，具有良好的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BLP-1 菌落在脫脂牛奶培養(yǎng)基平板上水解圈圖；

圖2：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BLP-1 16SrDNA電泳圖；

圖3：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BLP-1生長曲線；

圖4：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BLP-1發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶酶活圖；

圖5：地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）BLP-1在不同的發(fā)酵條件下，生產(chǎn)堿性蛋白酶酶活圖。

為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

具體實施方式

下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。

實施例1 地衣芽孢桿菌的篩選:

（1）蛋白酶菌株初篩。

將采集的土樣稱取 10 g，加入裝有 90 ml 無菌水并放有玻璃珠的 250 ml 三角瓶中，80℃水浴30 min，再充分振蕩 30 min，制成10^-5，10^-6，10^-7 g/ml的土壤懸液。分別涂布于用于初篩的加有脫脂牛奶的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)2-4天，觀察透明圈的有無。如果產(chǎn)生透明圈，分別測量透明圈和菌落的直徑并計算其比值，選擇比值較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。附圖1中1和2為篩選到的地衣芽孢桿菌在脫脂牛奶平板中形成的透明圈，3和4為不分泌蛋白酶的芽孢桿菌對照組。

（2）蛋白酶菌株復(fù)篩。

取初篩獲得的堿性蛋白酶菌株分別接種到30mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，220 rpm培養(yǎng)48 h，用福林（Folin）法測定（參照《中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》SB/T 10317-1999蛋白酶活力測定法），其原理是蛋白質(zhì)或多肽分子中有帶酚基酪氨酸或色氨酸，在堿性條件下，可使酚試劑中的磷鉬酸化合物還原成藍(lán)色（生成鉬藍(lán)和鎢藍(lán)化合物）。藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的含量成正比，可用比色法測定。從中選擇出酶活力最高的菌株作為目的菌株，進(jìn)行革蘭氏染色和生理生化鑒定。

（3）菌種的確認(rèn)。

采用常規(guī)生理生化反應(yīng)與分子16S rRNA技術(shù)對從土壤中篩選出來的菌株進(jìn)行鑒定。根據(jù)地衣芽孢桿菌在Genebank中的16S rRNA進(jìn)行分子鑒定，電泳結(jié)果如附圖2所示；再結(jié)合生理生化反應(yīng)篩選到的產(chǎn)堿性蛋白酶的菌株為革蘭氏陽性，桿狀，有芽孢，氧化酶與過氧化氫酶均為陽性，且具運動性，進(jìn)一步采用法國生物梅里埃細(xì)菌鑒定儀(參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》)，最終確定其為地衣芽孢桿菌。

(4)生長曲線的測定。

從-80℃甘油管保存的地衣芽孢桿菌BLP-1用三區(qū)劃線法接種于固體LB平板上在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，接種在LB固體平板上活化的單菌落至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h后，以1%的接種量接種到30mL的LB培養(yǎng)基中，每隔30 min取樣測定其OD₆₀₀得到其生長曲線，結(jié)果附圖3所示。

實施例2．地衣芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶

(1)發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶酶活測定。

從-80甘油管保存的地衣芽孢桿菌BLP-1用三區(qū)劃線法接種于固體LB平板上在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，接種在LB固體平板上活化的單菌落至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h后，以1%的接種量接種到30mL發(fā)酵培養(yǎng)基2×SR中37℃，220 rpm培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，每間隔12h后，將發(fā)酵液離心，以福林酚法測定粗酶液活力，結(jié)果附圖4所示。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化條件下生產(chǎn)堿性蛋白酶。

在原來發(fā)酵培養(yǎng)基2×SR的基礎(chǔ)上添加不同濃度的不同的碳源或氮源，發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶，具體方法同上。這些碳源或氮源的終濃度分別為1%的棉籽粉，1%的淀粉，0.3%的牛肉膏，0.5%的蛋白胨，0.5%的酵母膏和0.5%的葡萄糖，標(biāo)記為BLP-1-a，BLP-1-b，BLP-1-c，BLP-1-d，BLP-1-e, BLP-1-f。終濃度分別為4%的棉籽粉，4 %的淀粉，0.8 %的牛肉膏，1.5 %的蛋白胨，2 %的酵母膏和2%的葡萄糖，標(biāo)記為BLP-1-g，BLP-1-h，BLP-1-i，BLP-1-j，BLP-1-k, BLP-1-l。其中添加終濃度為1%的棉籽粉，和終濃度為2%的酵母膏時發(fā)酵生產(chǎn)的堿性蛋白酶酶活最高。結(jié)果附圖5所示。

堿性蛋白酶活力的測定

采用《中華人民共和國專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》SB/T 10317-1999蛋白酶活力測定方法即福林（Folin）法。

其中各培養(yǎng)基的配方如下：

(1) LB固體培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，脫脂牛奶10 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然，121℃滅菌 20min。

(2)LB種子培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L， pH自然，121℃滅菌 20min。

(3)2×SR發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉50 g/L，蛋白胨30 g/L，K₂HPO₄ 6 g/L，pH 7.2. 121℃滅菌 20min。