本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及黑附球菌與曲霉屬真菌共培養(yǎng)的方法及獲得的化合物。

背景技術(shù)：

曲霉屬真菌(Aspergillus spp.)是一類重要的絲狀真菌，該屬中很多類群與人類的生活和健康密切相關(guān)，在傳統(tǒng)釀酒制醬和現(xiàn)代的食品加工業(yè)均有廣泛的運用，如：曲霉屬與酵母菌、細菌或結(jié)合菌一起發(fā)酵大豆用于生產(chǎn)豆醬和醬油；混合發(fā)酵大米用于生產(chǎn)米酒；用于催熟奶酪可使奶酪具有特殊的風味，還可用于熏制火腿、香腸等食物。多年來，在曲霉屬真菌中發(fā)現(xiàn)了大量次級代謝產(chǎn)物，具有重要的研究和應用價值。其中一些是具有很強致癌性的真菌毒素，如：曲霉屬真菌產(chǎn)生的黃曲霉毒素(Aflatoxins)和雜色曲霉素(Sterigmatocystin)在世界范圍內(nèi)的食品和農(nóng)作物中均有發(fā)現(xiàn)；曲霉屬真菌也是重要的天然藥物來源，其產(chǎn)生的多種次級代謝產(chǎn)物廣泛應用于臨床，如土曲霉(Aspergillus terreus)產(chǎn)生的洛伐他汀(Lovastatin)可作為抗膽固醇的降血壓特效藥劑。但隨著研究的不斷深入，從真菌中發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物的傳統(tǒng)的篩選模式得到的化合物卻是大量重復發(fā)現(xiàn)，在實驗室常規(guī)培養(yǎng)條件下曲霉只能產(chǎn)生有限的代謝產(chǎn)物，曲霉中有活性的新化合物越來越難以發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有培養(yǎng)方法極大地限制了新化合物的發(fā)現(xiàn)。

近年來，一些新的研究策略被用來解決傳統(tǒng)方法發(fā)現(xiàn)真菌中新的代謝產(chǎn)物過程中遇到的困境，而大量真菌基因組測序的完成為開發(fā)真菌新的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)方法創(chuàng)造了條件。模式真菌基因組生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，大量的編碼天然產(chǎn)物基因簇處于“沉默”狀態(tài)，這表明大量的潛在的具有新穎結(jié)構(gòu)的化合物隱藏在“沉默”基因簇中未被發(fā)現(xiàn)?；诖耍芯堪l(fā)現(xiàn)，在實驗室條件下與其他生物的共培養(yǎng)可以對真菌帶來外在壓力，從而誘導真菌中“沉默”基因簇的表達，從而可誘導新化合物的產(chǎn)生或產(chǎn)量增加。目 前已發(fā)現(xiàn)的細菌與真菌的共培養(yǎng)導致新化合物產(chǎn)生的有：根霉菌(Rhizopus microsporus)與伯克氏菌(Burkholderia gladioli)的共培養(yǎng)可誘導抗菌聚酮化合物的合成；鐮刀菌(Fusarium tricinctum)與芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的共培養(yǎng)可導致大量次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生；鐮刀菌(F.pallidoroseum)與糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)的共培養(yǎng)可誘導Tetramic Acid同系物的生成。細菌與曲霉屬真菌的共培養(yǎng)可誘導新化合物的產(chǎn)生，如：海生曲霉真菌(Emericella sp.)與放線菌(Salinispora arenicola)的共培養(yǎng)可誘導化合物emericellamides A和B的產(chǎn)生；煙曲霉(A.fumigatus)在與放線菌(Streptomyces spp.)共培養(yǎng)時，可產(chǎn)生化合物N-Formyl Alkaloids和diketopiperazine；土曲霉(A.terreus)與芽孢桿菌(B.subtilis和B.cereus)的共培養(yǎng)可誘導相關(guān)化合物的產(chǎn)量提高34倍。關(guān)于通過真菌之間共培養(yǎng)而產(chǎn)生新的次級代謝產(chǎn)物的方法，僅有很少的報道，如鐮刀菌菌株(F.tricinctum和F.begoniae)間的共培養(yǎng)可誘導縮肽類化合物depsipeptides的產(chǎn)生；而發(fā)癬菌(Trichophyton rubrum)和淡色生赤殼菌(Bionectria ochroleuca)的共培養(yǎng)可誘導5個化合物的產(chǎn)生。目前尚無曲霉屬真菌通過與其他真菌共培養(yǎng)的方式產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)化合物的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種黑附球菌與曲霉屬真菌共培養(yǎng)的方法及獲得的化合物，首次公布了黑附球菌與曲霉屬真菌共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)新天然產(chǎn)物的方法，并發(fā)現(xiàn)曲霉孢子顏色變化可以作為次級代謝產(chǎn)物變化的指示反應，用于誘導或者激活曲霉菌中相關(guān)基因簇表達，從而使曲霉產(chǎn)生單獨培養(yǎng)時產(chǎn)量極低和/或者不產(chǎn)生的新結(jié)構(gòu)化合物。

本發(fā)明的一個方面，提供一種黑附球菌與曲霉屬真菌共培養(yǎng)的方法，所述共培養(yǎng)方法可使曲霉菌產(chǎn)生在單獨培養(yǎng)時產(chǎn)量極低和/或者單獨培養(yǎng)時不產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物；所述方法包括如下步驟：

a)將所述黑附球菌與所述曲霉屬真菌分別接種于活化培養(yǎng)基進行菌種活化；

b)將活化后的所述黑附球菌與所述曲霉屬真菌接種到同一培養(yǎng)容器的固體培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)；或?qū)⒒罨蟮乃龊诟角蚓c所述曲霉屬真菌接 種到同一培養(yǎng)容器的液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)；

c)當所述固體培養(yǎng)基中的曲霉屬真菌孢子變成黃色時，收集所述曲霉屬真菌及所述培養(yǎng)基獲取產(chǎn)物。

以上所述的共培養(yǎng)方法，所述黑附球菌為Epicoccum nigrum YL001，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編10010，保藏編號為：CGMCC No.11397，保藏日期為2015年10月16日。

以上所述的共培養(yǎng)方法，所述曲霉屬真菌包括構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉或米曲霉(Aspergillus oryzae)中的一種(均可由商業(yè)途徑或從中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心等菌種保藏機構(gòu)購買獲得)。

以上所述的共培養(yǎng)方法，步驟b)中所述固體培養(yǎng)基為固體真菌培養(yǎng)基，優(yōu)選為PDA培養(yǎng)基，所述液體培養(yǎng)基為液體真菌培養(yǎng)基，優(yōu)選為PDB培養(yǎng)基。

以上所述的共培養(yǎng)方法，步驟b)中所述靜置培養(yǎng)的溫度為25℃～28℃；所述振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)溫度25℃～28℃，100～250rpm/min。

以上所述的共培養(yǎng)方法，所述黑附球菌的活化培養(yǎng)基為PDA固體培養(yǎng)基，所述曲霉屬真菌的活化培養(yǎng)基為GMM培養(yǎng)基。

以上所述的共培養(yǎng)方法，所述PDA固體培養(yǎng)基每升包括：PDA培養(yǎng)基粉成品37g，余量為蒸餾水，pH值自然；所述GMM固體培養(yǎng)基每升包括：葡萄糖10g，硝酸鹽母液50mL，微量元素母液1mL，酵母抽提物1g，瓊脂15-20g，余量為蒸餾水，pH值6.5。

以上所述的共培養(yǎng)方法，所述硝酸鹽母液每升包括：NaNO₃ 120g，KCl 10.4g，MgSO₄·7H₂O 10.4g，K₂HPO₄·3H₂O 30.4g，余量為蒸餾水。

以上所述的共培養(yǎng)方法，所述微量元素母液每100mL包括ZnSO₄·7H₂O 2.2g，H₃BO₃1.1g，MnCl₂·4H₂O 0.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 0.16g，CoCl₂·5H₂O 0.16g，CuSO₄·5H₂O 0.16g，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.11g，Na₂EDTA 5.0g，余量為蒸餾水。

本發(fā)明的另一個方面，提供利用以上所述的黑附球菌與構(gòu)巢曲霉在PDA培養(yǎng)基共培養(yǎng)方法獲得的化合物，所述化合物的通式如式1所示：

式1中，R＝CHO或

本發(fā)明的再一個方面，提供利用以上所述的黑附球菌與土曲霉在PDA培養(yǎng)基共培養(yǎng)方法獲得的化合物，所述化合物Fallacino的化學式如式2所示。

本發(fā)明的又一個方面，提供利用以上所述的黑附球菌與米曲霉在PDA培養(yǎng)基共培養(yǎng)方法獲得的化合物，所述化合物Parasperone A的化學式如式3所示。

本發(fā)明的又一個方面，提供利用以上所述的黑附球菌與構(gòu)巢曲霉在PDB培養(yǎng)基共培養(yǎng)方法獲得的化合物，所述化合物的通式如式4所示：

式4中，或或

或或

本發(fā)明利用黑附球菌與曲霉屬的構(gòu)巢曲霉、土曲霉和米曲霉共培養(yǎng)，以曲霉菌的孢子變色為指示，調(diào)控或者激活曲霉中相關(guān)次級代謝產(chǎn)物相關(guān)基因簇的表達，導致相關(guān)化合物產(chǎn)量增加或者新化合物的生成。這為研究通過絲狀真菌間共培養(yǎng)的策略來提高其天然產(chǎn)物的產(chǎn)量或激活真菌中“沉默”基因簇的表達和發(fā)現(xiàn)新天然產(chǎn)物提供了新方法。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例3中在PDA培養(yǎng)基上黑附球菌和構(gòu)巢曲霉共培養(yǎng)的生長情況圖；

圖2為本發(fā)明實施例3中在PDA培養(yǎng)基上黑附球菌和土曲霉共培養(yǎng)的生長情況圖；

圖3為本發(fā)明實施例3中在PDA培養(yǎng)基上黑附球菌和米曲霉共培養(yǎng)的生長情況圖；

圖4為本發(fā)明實施例5中黑附球菌和構(gòu)巢曲霉在PDA培養(yǎng)基上共培養(yǎng)時化合物HPLC分析檢測；

圖5為本發(fā)明實施例6中黑附球菌和土曲霉在PDA培養(yǎng)基上共培養(yǎng)時化合物HPLC分析檢測；

圖6為本發(fā)明實施例7黑附球菌和米曲霉在PDA培養(yǎng)基上共培養(yǎng)時化合物HPLC分析檢測；

圖7為本發(fā)明黑附球菌和構(gòu)巢曲霉液體在PDB培養(yǎng)基中共培養(yǎng)化合物HPLC分析檢測。

圖中標記為A的部分，曲霉菌孢子已經(jīng)變?yōu)辄S色。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式進行更加詳細的說明，以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個方面的優(yōu)點。然而，以下描述的具體實施方式和實施例僅是說明的目的，而不是對本發(fā)明的限制。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1

本發(fā)明所用的黑附球菌菌株菌種活化培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，121℃高壓濕熱滅菌20-30分鐘。倒90mm培養(yǎng)皿，取黑附球菌菌絲接種，25℃靜置培養(yǎng)3天至7天，4℃保存，用于培養(yǎng)接種。

實施例2

本發(fā)明所用的曲霉菌種活化培養(yǎng)基為GMM培養(yǎng)基，每1L所述固體培養(yǎng)基按如下方法配制：葡萄糖10g，硝酸鹽母液50mL，微量元素母液1mL，酵母抽提物1g，瓊脂15-20g，上述成分依次添加，最后補加蒸餾水終體積至1L，pH值調(diào)至6.5，121℃高壓濕熱滅菌20-30分鐘。倒90mm培養(yǎng)皿，劃線接種，37℃靜置培養(yǎng)3天至4天。滅菌水收集孢子，每個平板收集孢子，制成終體積為2mL的孢子懸液，4℃保存用于培養(yǎng)接種。

其中，硝酸鹽母液配制(1L)方法如下：硝酸鈉NaNO₃ 120g，氯化鉀KCl 10.4g，硫酸鎂MgSO₄·7H₂O 10.4g，磷酸氫二鉀K₂HPO₄·3H₂O 30.4g，上述成分依次添加，最后補加蒸餾水終體積至1L，pH值自然，121℃高壓濕熱滅菌20-30分鐘，室溫保存；

微量元素母液配制(100mL)方法如下：硫酸鋅ZnSO₄·7H₂O 2.2g，硼酸H₃BO₃ 1.1g，氯化錳MnCl₂·4H₂O 0.5g，硫酸亞鐵FeSO₄·7H₂O 0.16g，氯化鈷CoCl₂·5H₂O 0.16g，硫酸銅CuSO₄·5H₂O 0.16g，鉬酸銨(NH₄) ₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.11g，EDTA鈉鹽Na₂EDTA 5.0g，上述成分依次添加，最后補加蒸餾水終體積至100mL，121℃高壓濕熱滅菌20-30分鐘，室溫保存。

實施例3

本發(fā)明所用的黑附球菌與曲霉共培養(yǎng)方法為：黑附球菌分別與構(gòu)巢曲霉、土曲霉及米曲霉同時接種到倒有PDA培養(yǎng)基的同一培養(yǎng)皿上，共同培 養(yǎng)。所述培養(yǎng)溫度為25℃～28℃，靜置培養(yǎng)；培養(yǎng)一段時間后，接近黑附球菌一側(cè)的曲霉生長受到明顯抑制，且曲霉孢子明顯變色；培養(yǎng)時間為4天至7天。

實施例4

本發(fā)明所用的黑附球菌與曲霉共培養(yǎng)方法為所述的黑附球菌菌絲與構(gòu)巢曲霉孢子同時接種到裝有PDB液體培養(yǎng)基的同一三角瓶中，共同培養(yǎng)。所述培養(yǎng)溫度為25℃～28℃，搖床振蕩100～250rpm/min，培養(yǎng)時間為4天至7天。

實施例5

黑附球菌與構(gòu)巢曲霉共培養(yǎng)化合物的HPLC分析：通過HPLC分析所述共培養(yǎng)中化合物的變化。在下述條件下進行HPLC分析：裝置：Waters e2695系統(tǒng)；檢測器：Waters 2998(200-600nm)；色譜柱：38020-41COSMOSIL 5C18-MS-II Packed Column，4.6mm I.D.x 250mm；洗脫速度：1mL/min，洗脫劑：酸水(0.1％formic acid)和乙腈(0.1％formic acid)在20min內(nèi)將乙腈含量由20％乙腈/酸水增加至100％乙腈。

在將黑附球菌和構(gòu)巢曲霉共培養(yǎng)4天至7天獲得菌絲和培養(yǎng)基進行化合物萃取。將1個平板的培養(yǎng)物分成小塊置于三角瓶中，加入20-40mL MEA(乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸＝89:10:1)進行超聲萃取(超聲頻率80Hz，時間為1小時)；收集提取液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度30℃，轉(zhuǎn)速100rpm，真空度<3mmHg)；蒸干后用0.30-0.60mL甲醇溶解，稀釋適當濃度進樣20-40ul，20-100％甲醇沖柱，進行HPLC分析。在保留時間22.697min和23.389min的峰處檢測到式1；在保留時間在20min至25min的峰處檢測到式4。黑附球菌單獨培養(yǎng)4天至7天的萃取液中未檢出此化合物，而構(gòu)巢曲霉單獨培養(yǎng)4天至7天的萃取液中檢測到微量或檢測不到此化合物。

實施例6

黑附球菌與土曲霉共培養(yǎng)化合物的HPLC分析：通過HPLC研究所述共培養(yǎng)中化合物的變化。在下述條件下進行HPLC分析：裝置：Waters e2695系統(tǒng)檢測器：Waters 2998(200-600nm)；色譜柱：38020-41COSMOSIL5C18-MS-II Packed Column，4.6mm I.D.x 250mm；洗脫速度：1mL/min，洗脫劑：酸水(0.1％formic acid)和甲醇(0.1％formic acid)在20min內(nèi)將 甲醇含量由20％甲醇/酸水增加至100％甲醇。

在將黑附球菌和土曲霉共培養(yǎng)4天至7天獲得菌絲和培養(yǎng)基進行化合物萃取。將1個平板的培養(yǎng)物分成小塊置于三角瓶中，加入20-40mL MEA(乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸＝89:10:1)進行超聲萃取(超聲頻率80Hz，時間為1小時)；收集提取液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度30℃，轉(zhuǎn)速100rpm，真空度<3mmHg)；蒸干后用0.30-0.60mL甲醇溶解，稀釋適當濃度進樣20-40ul，20-100％甲醇沖柱，進行HPLC分析。在保留時間18.072的峰處檢測到式2。與此同時，在將黑附球菌或土曲霉單獨培養(yǎng)4天至7天的萃取液中均未檢出此種化合物。

實施例7

黑附球菌與米曲霉共培養(yǎng)化合物的HPLC分析：通過HPLC研究所述共培養(yǎng)中化合物的變化。在下述條件下進行HPLC：裝置：Waters e2695系統(tǒng)檢測器：Waters 2998(200-600nm)；色譜柱：38020-41COSMOSIL5C18-MS-II Packed Column，4.6mm I.D.x 250mm；洗脫速度：1mL/min，洗脫劑：酸水(0.1％formic acid)和甲醇(0.1％formic acid)在20min內(nèi)將甲醇含量由20％甲醇/酸水增加至100％甲醇；。

在將黑附球菌和米曲霉共培養(yǎng)4天至7天的獲得的菌絲和培養(yǎng)基進行化合物萃取。將1個平板的培養(yǎng)物分成小塊置于三角瓶中，加入20-40mL MEA(乙酸乙酯：甲醇：冰乙酸＝89:10:1)進行超聲萃取(超聲頻率80Hz，時間為1小時)；收集提取液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(溫度30℃，轉(zhuǎn)速100rpm，真空度<3mmHg)；蒸干后用0.30-0.60mL甲醇溶解，稀釋適當濃度進樣20-40ul，20-100％甲醇沖柱，進行HPLC分析。在保留時間15.226的峰處檢測到式3。與此同時，在將黑附球菌或米曲霉單獨培養(yǎng)4天至7天的培養(yǎng)液中未檢出此種化合物。

實施例8

黑附球菌與構(gòu)巢曲霉共培養(yǎng)化合物的分離純化：從實施例3和實施例4中得到的培養(yǎng)基中提取有機化合物，使用乙酸乙酯分離共培養(yǎng)菌株培養(yǎng)基3次，并使用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器在30℃將所述提取物在減壓下干燥，然后將所得的提取物硅膠柱梯度洗脫，結(jié)果得到7個組分。HPLC對所得到的組分進行分析，結(jié)果證實在100％二氯甲烷洗脫的組分中含有式1和式4化合物。 將所述組分通過半制備液相色譜進行制備。在保留時間22.697min和23.389min處分別得到式1化合物，而在保留時間20min至25min間得到式4化合物。

式1中，R＝CHO或

式4中，或或

或或

實施例9

黑附球菌與土曲霉共培養(yǎng)化合物的分離和純化：從實施例3得到的培養(yǎng)基中提取有機化合物，使用乙酸乙酯分離共培養(yǎng)菌株培養(yǎng)基3次，并使用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器在30℃將所述提取物在減壓下干燥，然后將所得的提取物硅膠柱梯度洗脫，結(jié)果得到7個組分。HPLC對所得到的組分進行分析，結(jié)果證實在二氯甲烷：甲醇＝100：3洗脫的組分中含有式2。將所述組分分別通過葡萄糖凝膠柱層析和半制備液相色譜進行制備。在保留時間15.397min處得到如式2化合物。

實施例10

黑附球菌與米曲霉共培養(yǎng)化合物的分離和純化：從實施例3得到的培養(yǎng)基中提取有機化合物，使用乙酸乙酯分離共培養(yǎng)菌株培養(yǎng)基3次。使用旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器在30℃將所述提取物在減壓下干燥，然后將所得的提取物通過葡萄糖凝膠柱層析，使用甲醇進行洗脫，得到含有式3化合物的組分。在半制備液相色譜進行所得到的組分進行分析，在70％甲醇/酸水的等度條件下進行制備，獲得式3所示化合物。

最后應說明的是：顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。