本發(fā)明涉及一株解淀粉芽孢桿菌及其在降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

氨基甲酸酯(Carbamate；通式RO(CO)NRR)類農(nóng)藥是在有機(jī)磷酸酯之后發(fā)展起來(lái)的合成農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于除蟲(chóng)，殺螨，除草等農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。氨基甲酸酯類農(nóng)藥一般無(wú)特殊氣味，在酸性環(huán)境下穩(wěn)定，遇堿分解，在水中溶解度較高。大多數(shù)品種毒性較有機(jī)磷酸酯類低，并不是劇毒化合物，但具有致癌性，可經(jīng)呼吸道、消化道侵入機(jī)體，也可經(jīng)皮膚黏膜緩慢吸收。氨基甲酸酯類農(nóng)藥具有致突變、致畸和致癌作用。例如將西維因以各種方式處理小鼠和大鼠，均可引起癌變，并對(duì)豚鼠、狗、小鼠、豬、雞和鴨有致畸作用。急性氨基甲酸酯類農(nóng)藥中毒是短時(shí)間內(nèi)密切接觸氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑后，因體內(nèi)膽堿酯酶活性下降而引起的毒蕈堿樣，煙堿樣和以中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀為主的全身性疾病。因此，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)在2007年把氨基甲酸酯類列為2A類致癌物。如何消除這些危害，已經(jīng)受到廣泛關(guān)注，目前以微生物降解是較為行之有效的辦法。

氨基甲酸酯類農(nóng)藥是常用的殺蟲(chóng)劑，在尚未找到新型替代化合物之前，未來(lái)幾十年內(nèi)仍將被廣泛使用，因而迫切需要研究殘留農(nóng)藥的降解。

微生物降解是各種農(nóng)藥降解方法中較為綠色和高效的一種。然而，現(xiàn)有細(xì)菌對(duì)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的降解速度慢如，公開(kāi)號(hào)為CN1723276A公開(kāi)的細(xì)菌作用于氨基甲酸酯化合物后10天時(shí)，降解率僅60％。

急需提供一種可以快速、高效降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥的新的菌株。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種新的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)及其在降解中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌，它是由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏的保藏號(hào)：CGMCC No.13143的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6。

本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，于2016年10月24日保藏在于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC No.13143。

本發(fā)明還提供了解淀粉芽孢桿菌在降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥中的用途。

其中，所述解淀粉芽孢桿菌是保藏號(hào)為CGMCC No.13143的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6。

其中，所述氨基甲酸酯類農(nóng)藥是(1-萘基)-N-甲基氨基甲酸酯，即西維因。

本發(fā)明還提供了一種降解農(nóng)藥的方法，包括如下步驟：

(1)取解淀粉芽孢桿菌，復(fù)蘇制備種子液；

(2)將種子液加入待處理的樣品中，混勻，即可。

步驟(1)中，所述解淀粉芽孢桿菌是保藏號(hào)CGMCC No.13143的解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6。

步驟(1)中，所述種子液的濃度不低于10⁶cfu/mL。

優(yōu)選地，所述種子液的濃度為10⁶～10⁹cfu/mL。

所述種子液的按照如下方法制備：取解淀粉芽孢桿菌，用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，調(diào)整濃度，即可。

本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌JX-6(Bacillus amyloliquefaciens JX-6)，其可以高效、快速降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥，用于這些物質(zhì)污染的土壤、水體的生物修復(fù)或生物凈化，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，具有極好的應(yīng)用前景。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說(shuō)明

圖1為降解菌株JX-6培養(yǎng)48h的菌落培養(yǎng)特征。

圖2為降解菌株JX-6的細(xì)胞形態(tài)圖。

圖3為實(shí)驗(yàn)例1中降解菌株JX-6的降解情況。

圖4為實(shí)驗(yàn)例1中降解菌株JX-6降解西維因及其產(chǎn)物的色譜圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明培養(yǎng)基：

Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)：酵母浸膏(Yeast extract)5.0g；胰蛋白胨(Casein tryptone)10g；氯化鈉(Sodium chloride)10g；蒸餾水(H₂O)1000mL；調(diào)pH至7.0；此固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中再加20g/L瓊脂(Agar)制成的。培養(yǎng)基于121℃，滅菌20min備用。

實(shí)施例1 本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定

1、分離

取醋賠樣品4份，分別拌勻，各取5g，置于裝有30mL LB培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于80℃下加熱10min，冷至室溫再加入西維因使其質(zhì)量濃度為50 mg/L，于30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后按5％接種量再依次進(jìn)行3次富集培養(yǎng)，每次培養(yǎng)48h，并逐步提高培養(yǎng)基中西維因濃度，使之分別達(dá)到100mg/L、200mg/L、400mg/L，篩選得到的一株農(nóng)藥降解菌，編號(hào)為JX-6。

2、鑒定

(1)形態(tài)、生理生化特征

形態(tài)：挑取菌株JX-6至LB固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，記錄其菌落形態(tài)特征，挑取單菌落進(jìn)行涂片、革蘭氏染色，于10×100倍油鏡下觀察記錄顏色、大小、形狀、排列等。

生理生化鑒定參見(jiàn)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》第八版。

菌株JX-6的形態(tài)鑒定(如圖1、圖2所示)：革蘭氏染色陽(yáng)性，芽孢桿菌，菌落在LB培養(yǎng)基上呈淡白色不透明菌落，不反光，表面皺褶，有隆起，邊緣不規(guī)則。

表1 菌株JX-6生理生化鑒定結(jié)果

(2)16S rDNA鑒定

對(duì)菌株16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增，PCR條件：94℃預(yù)變性5min；然后94℃、45s，56℃、45s，72℃、90s，循環(huán)30次；最后72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序，菌株JX-6的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示:

CTGGCTCTAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTAAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCG GTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATC。

測(cè)定，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行Blast同源性對(duì)比，該菌株序列與Bacillus amyloliquefaciens菌株基因序列高度同源。

綜上，結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA鑒定結(jié)果，將本發(fā)明分離株JX-6鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并將其命名為解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.13143。

實(shí)施例2 采用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌降解土壤中的西維因

取本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，保藏號(hào)為CGMCC No.13143，簡(jiǎn)稱菌株JX-6。菌種活化：挑取菌株JX-6至LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h；然后連續(xù)劃線、挑取單菌落培養(yǎng)兩次(30℃)，挑取單菌落接種至LB斜面30℃培養(yǎng)2d備用。用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面上菌體并調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁶cfu/mL，制成種子液。

將種子液加入待處理土壤中，混勻，即可。

實(shí)施例3 采用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌降解水中的西維因

取本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，保藏號(hào)為CGMCC No.13143，簡(jiǎn)稱菌株JX-6。菌種活化：挑取菌株JX-6至LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h；然后連續(xù)劃線、挑取單菌落培養(yǎng)兩次(30℃)，挑取單菌落接種至LB斜面30℃培養(yǎng)2d備用。用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面上菌體并調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁸cfu/mL，制成種子液。

將種子液加入待處理樣品水中，混勻，即可。

實(shí)施例4 采用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌降解土壤中的西維因

取本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，保藏號(hào)為CGMCC No.13143，簡(jiǎn)稱菌株JX-6。菌種活化：挑取菌株JX-6至LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h；然后連續(xù)劃線、挑取單菌落培養(yǎng)兩次(30℃)，挑取單菌落接種至LB斜面30℃培養(yǎng)2d備用。用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面上菌體并調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁹cfu/mL，制成種子液。

將種子液加入待處理土壤中，混勻，即可。

以下用實(shí)驗(yàn)例的方式來(lái)證明本發(fā)明的有益效果：

實(shí)驗(yàn)例1采用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌降解西維因的方法

1 材料與儀器

1.1 材料

菌種：本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，保藏號(hào)為CGMCC No.13143，簡(jiǎn)稱菌株JX-6。

西維因：購(gòu)自中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 主要儀器

WondaSil C18柱，購(gòu)自島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

菌種活化：挑取菌株JX-6至LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h；然后連續(xù)劃線、挑取單菌落培養(yǎng)兩次(30℃)，挑取單菌落接種至LB斜面30℃培養(yǎng)2d備用

用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面上菌體并調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁶cfu/mL，制成種子液。

將降解菌株JX-6的種子液按5％接種量接種于含有100mg/L、200mg/L、400mg/L西維因的LB液體培養(yǎng)基中,分裝30mL/250mL錐形瓶,設(shè)接種5％無(wú)菌水為空白對(duì)照，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)，取樣時(shí)間為0h-96h期間每12h取樣1瓶，再?gòu)腻F形瓶中取均勻培養(yǎng)液1mL，用甲醇定容至10mL，混勻后于10000r/min離心10min，取上清液供液相色譜(HPLC)分析用。

測(cè)定條件：色譜柱為WondaSil C18柱(150mm×4.60mm，5.0μm)；流動(dòng)相為乙腈:水(85:15，V/V)，流速0.5mL/min；紫外檢測(cè)器，其波長(zhǎng)為220nm；進(jìn)樣量10μL。

3 結(jié)果與分析

結(jié)果如圖3所示，降解菌株JX-6在72h內(nèi)對(duì)50mg/L、100mg/L、200mg/L、400mg/L西維因的降解率依次是82％、75％、75％、62％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌JX-6可以有效降解西維因，降解速度快，降解率高；如圖4，降解菌株JX-6可以降解西維因的降解中間產(chǎn)物，色譜圖中8.57min峰為目標(biāo)峰(西維因)，隨著時(shí)間的推移，西維因目標(biāo)峰在變小的同時(shí)(0-72h)，在9.12min出現(xiàn)一個(gè)新的峰且逐漸升高(0-72h)，并且在72-120h內(nèi)降低，判斷9.12min峰為西維因的降解中間產(chǎn)物。

實(shí)驗(yàn)例2 采用本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌降解污水中的西維因

1 材料與儀器

1.1 材料

菌種：本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens JX-6，保藏號(hào)為CGMCC No.13143，簡(jiǎn)稱菌株JX-6。

西維因：購(gòu)自中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 主要儀器

WondaSil C18柱，購(gòu)自島津技邇(上海)商貿(mào)有限公司。

2 試驗(yàn)方法

菌種活化：挑取菌株JX-6至LB液體培養(yǎng)基中，30℃，180r/min振蕩培養(yǎng)24h；然后連續(xù)劃線、挑取單菌落培養(yǎng)兩次(30℃)，挑取單菌落接種至LB斜面30℃培養(yǎng)2d備用。

用無(wú)菌生理鹽水洗下斜面上菌體并調(diào)整細(xì)胞濃度為10⁶cfu/mL，制成種子液。

從四川省成都市蔬菜地土壤中取一定量的土壤樣品，添加西維因使其質(zhì)量濃度約為100mg/L,將降解菌株的種子液按5％接種量接種(實(shí)驗(yàn)組)，設(shè)接種5％無(wú)菌水為空白對(duì)照,30℃培養(yǎng)，每24h取樣，用實(shí)驗(yàn)例1述方法測(cè)定土壤樣品中DBP的殘留量。

通過(guò)HPLC檢測(cè)樣品中西維因的殘留量，空白污水樣品中西維因含量變化較小，實(shí)驗(yàn)組的污水樣品在4d時(shí)幾乎檢測(cè)不到西維因(表2)。

表2 菌株JX-6在污水中的應(yīng)用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌JX-6可以有效降解西維因，降解速度快，降解率高。

綜上，本發(fā)明分離得到了一株新的解淀粉芽孢桿菌JX-6(Bacillus amyloliquefaciens JX-6)，其可以高效、快速降解西維因等氨基甲酸酯類農(nóng)藥，對(duì)環(huán)境修復(fù)的作用佳，具有極好的應(yīng)用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都醫(yī)學(xué)院

<120> 一種解淀粉芽孢桿菌及其在降解氨基甲酸酯類農(nóng)藥中的應(yīng)用

<130> GY044-16P1500

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1394

<212> DNA

<213> 16S rDNA

<400> 1

ctggctctaa aggttacctc accgacttcg ggtgttaaaa ctctcgtggt gtgacgggcg 60

gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat 120

tccagcttca cgcagtcgag ttgcagactg cgatccgaac tgagaacaga tttgtgggat 180

tggcttaacc tcgcggtttc gctgcccttt gttctgtcca ttgtagcacg tgtgtagccc 240

aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc 300

agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaaga tcaagggttg cgctcgttgc 360

gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtcactc 420

tgcccccgaa ggggacgtcc tatctctagg attgtcagag gatgtcaaga cctggtaagg 480

ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat 540

tcctttgagt ttcagtcttg cgaccgtact ccccaggcgg agtgcttaat gcgttagctg 600

cagcactaag gggcggaaac cccctaacac ttagcactca tcgtttacgg cgtggactac 660

cagggtatct aatcctgttc gctccccacg ctttcgctcc tcagcgtcag ttacagacca 720

gagagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc acatctctac gcatttcacc gctacacgtg 780

gaattccact ctcctcttct gcactcaagt tccccagttt ccaatgaccc tccccggttg 840

agccgggggc tttcacatca gacttaagaa accgcctgcg agccctttac gcccaataat 900

tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc 960

tttctggtta ggtaccgtca aggtgccgcc ctatttgaac ggcacttgtt cttccctaac 1020

aacagagctt tacgatccga aaaccttcat cactcacgcg gcgttgctcc gtcagacttt 1080

cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc gtgtctcagt 1140

cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gtcgccttgg tgagccgtta 1200

cctcaccaac tagctaatgc gccgcgggtc catctgtaag tggtagccga agccaccttt 1260

tatgtctgaa ccatgcggtt caaacaacca tccggtatta gccccggttt cccggagtta 1320

tcccagtctt acaggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct aacatcaggg 1380

agcaagctcc catc 1394