本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，篩選到一株能夠抑制羅非魚鏈球菌的短小芽孢桿菌，并進(jìn)行了發(fā)酵優(yōu)化，制備成水劑產(chǎn)品和粉劑產(chǎn)品，并且能在水產(chǎn)飼料中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：羅非魚(Tilapia)作為世界水產(chǎn)行業(yè)最主要的養(yǎng)殖品種之一，具有生長速度快、食性雜、肉質(zhì)好、營養(yǎng)價(jià)值高、繁殖能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)廣泛分布于熱帶亞熱帶的淡咸水域中。我國沿海地區(qū)特別是海南、廣東、福建、廣西等省份養(yǎng)殖的羅非魚產(chǎn)量占世界一半以上。但是近些年來伴隨著羅非魚養(yǎng)殖面積和養(yǎng)殖密度越來越高由無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)感染引起的羅非魚鏈球菌病已經(jīng)成為阻礙我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的主要因素。特別是自2009年以來羅非魚“鏈球菌病”呈現(xiàn)出全國爆發(fā)的趨勢，在每年的高溫季節(jié)尤其是7-9月份，發(fā)病率在50％以上，死亡率最高可達(dá)80％以上目前多采用抗生素來控制羅非魚鏈球菌的發(fā)生和傳染，這一養(yǎng)殖模式導(dǎo)致了養(yǎng)殖過程中抗生素濫用和殘留超標(biāo)的問題，嚴(yán)重制約了羅非魚成品的出口和銷售，成為限制羅非魚產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明從羅非魚的養(yǎng)殖環(huán)境中篩選到一株短小芽孢桿菌，該短小芽孢桿菌能夠抑制導(dǎo)致羅非魚鏈球菌病的無乳鏈球菌生長，能夠顯著的控制羅非魚鏈球菌病的發(fā)生和傳染，減少抗生素使用，降低羅非魚養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)，提高羅非魚的養(yǎng)殖效益。首先，本發(fā)明提供一株能夠抑制羅非魚鏈球菌病的短小芽孢桿菌新菌株。本發(fā)明從羅非魚養(yǎng)殖水域中分離、經(jīng)定向初篩和復(fù)篩得到一株短小芽孢桿菌。其營養(yǎng)細(xì)胞細(xì)桿狀，其芽孢為橢圓或長筒形，為中生或次端生，孢囊稍膨大。孤立或呈短鏈，桿端半圓形。在12～16h內(nèi)能形成菌落，菌落為圓形，或不規(guī)則，邊緣毛發(fā)狀，菌落白色，不透明，無褶皺。革蘭氏陽性。利用細(xì)菌的通用引物對(duì)篩選到的菌株進(jìn)行PCR鑒定：按細(xì)菌DNA提取試劑盒操作說明書提取模板DNA。使用16SrRNA保守序列的上游引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQIDNo.2)和下游引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQIDNo.3)擴(kuò)增細(xì)菌16srRNA基因片段。經(jīng)過測序得到該菌屬于短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，擴(kuò)增片段的測序結(jié)果見SEQIDNo.1。利用LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，對(duì)得到的短小芽孢桿菌CD6進(jìn)行了抑菌性、耐溫性能、發(fā)酵特性實(shí)驗(yàn)。在平板測試過程中，發(fā)現(xiàn)CD6能夠顯著抑制無乳鏈球菌的生長，形成顯著透明抑制圈。CD6芽孢耐溫性能良好，芽孢在85℃水浴10min，芽孢存活率80％以上。將篩選到的短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)命名為CD6，于2016年3月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為：CGMCCNo.12197。本發(fā)明還提供該短小芽孢桿菌的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，其含有：KH2PO40.8～1.5g/L，蔗糖3～6g/L，豆餅粉8～12g/L，F(xiàn)eSO40.25～0.5g/L，CaCO31～3g/L，MgSO42.5～3.5g/L，玉米面4～6g/L，魚粉6～10g/L，消泡劑0.05～0.1％，初始pH7.0～7.5。優(yōu)選的，所述的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基含有KH2PO41.0g/L，蔗糖3 g/L，豆餅粉8g/L，F(xiàn)eSO40.30g/L，CaCO31.5g/L，MgSO43.0g/L，玉米面5g/L魚粉8g/L，消泡劑0.05％，初始pH7.5。本發(fā)明還提供所述短小芽孢桿菌的高密度發(fā)酵方法，其包括如下步驟：種子液按3-6％的接種量接種到所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，溫度30～37℃，轉(zhuǎn)速200～400r/min，罐壓0.05Mpa，通氣比1：0.4～0.6，發(fā)酵時(shí)間12～16h，得芽孢生成率90％以上，活菌數(shù)為109～1010CFU/ml的短小芽孢桿菌發(fā)酵液。本發(fā)明還提供一種抑制羅非魚鏈球病的微生態(tài)制劑，其含有短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)CGMCCNo.12197的發(fā)酵液。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述的抑制羅非魚鏈球病的微生態(tài)制劑還含有終濃度為12-15％的NaCl。本發(fā)明還提供另一種抑制羅非魚鏈球病的微生態(tài)制劑，其含有短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)CGMCCNo.12197的菌粉，其活菌數(shù)為1010～1011CFU/g。其中，所述的菌粉制備方式如下：將高密度發(fā)酵液利用陶瓷復(fù)合膜濃縮3倍后，添加10％淀粉作為載體，進(jìn)行噴霧干燥，干燥條件為：進(jìn)風(fēng)溫度200～400℃，出口溫度70～85℃，進(jìn)料速度10～12L/min，霧化轉(zhuǎn)頭速度20000～30000r/min。本發(fā)明的開發(fā)的微生態(tài)制劑，水劑直接潑灑到養(yǎng)殖水域，抑制無乳鏈球菌的生長；粉劑產(chǎn)品添加到羅非魚顆粒料中，提高羅非魚對(duì)鏈球菌病的抵抗能力。本產(chǎn)品制備的菌粉可做為飼料添加劑制備羅非魚顆粒料，能夠提高羅非魚對(duì)鏈球菌病的抵抗力。附圖說明圖1：短小芽孢桿菌桿菌CD6抑菌圈。具體實(shí)施方式通過以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的篩選方法、制備工藝和應(yīng)用進(jìn)行詳述，所述說明是描述性的，并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1短小芽孢桿菌CD6的抑菌實(shí)驗(yàn)方法1)無乳鏈球菌的培養(yǎng)方法液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L，脫水小牛腦浸粉12.5g/L，脫水牛心浸粉5.0g/L，氯化鈉5.0g/L，葡萄糖2.0g/L，磷酸氫二鈉2.5g/L，pH7.5。固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0g/L，脫水小牛腦浸粉12.5g/L，脫水牛心浸粉5.0g/L，氯化鈉5.0g/L，葡萄糖2.0g/L，磷酸氫二鈉2.5g/L，pH7.5，瓊脂粉1.5％。2)篩選平板制作將平板上的無乳鏈球菌單菌落接種于液體培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液在無菌條件下按照10％的比例倒入滅菌后冷卻到40～45℃固體培養(yǎng)基中，混勻，倒于無菌平板中，30ml/平板，冷卻凝固待用。3)牛津杯法篩選短小芽孢桿菌將無菌的牛津杯置于方法2)制備的平板上，將CD6LB培養(yǎng)基發(fā)酵液200μL添加到牛津杯中，30℃培養(yǎng)16h，觀察抑菌圈情況。通過以上方法，可以看到CD6對(duì)無乳鏈球菌的抑制效果，如圖1所示，在含有CD6的牛津杯周圍具有顯著的透明抑制圈。實(shí)施例2短小芽孢桿菌CD6發(fā)酵上清液最低抑菌濃度的測定1)短小芽孢桿菌CD6發(fā)酵液上清液的制備方法將CD6接種于含有25mlLB培養(yǎng)基的100ml三角樣品中，37℃培養(yǎng)24h，取10ml發(fā)酵液，5000r/min離心機(jī)，離心15min，收集不含有菌體的上清液。2)不同濃度CD6發(fā)酵液上清液的制備取5支玻璃試管，分別標(biāo)記為0，1，2，3，4，每支試管中，加入1ml離心后不含菌體的上清液，1號(hào)試管加入純凈水1ml，2號(hào)試管加水2ml，3號(hào)試管加入純凈水3ml，4號(hào)試管加水4ml。1，2，3，4號(hào)試管上清液濃度分別被稀釋2倍，3倍，4倍，5倍。3)短小芽孢桿菌CD6發(fā)酵上清液最低抑制濃度的測定按照實(shí)施例1的方法，測定不同稀釋濃度下對(duì)無乳鏈球菌的抑制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下。表1CD6發(fā)酵上清液最低濃度的測定編號(hào)01234稀釋濃度1倍2倍3倍4倍5倍抑菌效果++++++++++++從表1可以看出，CD6的發(fā)酵上清液具有優(yōu)異的抑制無乳鏈球菌的效果，稀釋4倍仍然具有抑菌效果。實(shí)施例3短小芽孢芽孢桿菌高密度發(fā)酵液的制備1)平板培養(yǎng)復(fù)壯：將短小芽孢桿菌菌種接種于LB平板培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)24h，使短小芽孢桿菌復(fù)壯，并形成單菌落，挑取單菌落于接種培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h；2)一級(jí)種子的制備：將步驟1)培養(yǎng)的短小芽孢桿菌菌種轉(zhuǎn)接茄子瓶LB斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，使處于對(duì)數(shù)后期，得一級(jí)種子；3)二級(jí)種子的制備：將步驟2)制備的一級(jí)種子用無菌水制成菌懸液，接種到裝有60LLB種子培養(yǎng)基的100L種子罐中，溫度30℃，轉(zhuǎn)速200r/min，罐壓0.05MPA，通風(fēng)比：1：0.6培養(yǎng)14h,得二級(jí)種子液。4)短小芽孢桿菌發(fā)酵液的制備：將步驟3)制備的二級(jí)種子液按5％的接種量接種到600L發(fā)酵培養(yǎng)基的1m3發(fā)酵罐中，溫度30℃，轉(zhuǎn)速200r/min，罐壓0.05Mpa，通風(fēng)比1：0.5，培養(yǎng)16h，得芽孢生成率90％以上，活菌數(shù)為5×109cfu/ml的短小芽孢桿菌發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為(質(zhì)量百分比)：KH2PO41.0g/L,蔗糖3g/L，豆餅粉8g/L，F(xiàn)eSO40.30g/L，CaCO31.5g/L,MgSO43.0g/L，玉米面5g/L魚粉8g/L，消泡劑0.05％，初始pH7.5。實(shí)施例4水劑微生態(tài)的制備在實(shí)施例2制得的發(fā)酵液中，加入發(fā)酵液重量的15％的氯化鈉，可制成保質(zhì)期穩(wěn)定的水劑產(chǎn)品，水劑產(chǎn)品采用1L或5LPET材質(zhì)的塑料包裝瓶。實(shí)施例5粉劑微生態(tài)的制備1)發(fā)酵液濃縮：生產(chǎn)的發(fā)酵液采用孔徑為1～10微米的陶瓷膜過濾發(fā)酵液，實(shí)現(xiàn)菌體和液體的分離，制成三倍濃縮液。2)載體添加：安裝濃縮液體積，添加10％的玉米淀粉，攪拌均勻備用。3)噴霧干燥條件：進(jìn)風(fēng)溫度160～180℃，出風(fēng)溫度70～80℃，霧化器轉(zhuǎn)速20000～30000r/min，通過控制進(jìn)料速度來實(shí)現(xiàn)出風(fēng)溫度的穩(wěn)定。4)菌粉制備：將方法2)制備的混合液按照方法3)噴干條件，制備成含水量5％的菌粉，活菌數(shù)含量1010CFU/g。實(shí)施例6水劑微生態(tài)的應(yīng)用將按照實(shí)施例3制備的水劑微生態(tài)在羅非魚養(yǎng)殖池塘施用，按照水深1.5米，1畝/升劑量使用。經(jīng)過取樣檢測發(fā)現(xiàn)水體中短小芽孢桿菌的數(shù)量可以達(dá)到103CFU/L，這一濃度遠(yuǎn)超過水體中自然菌落的濃度，形成菌落生長優(yōu)勢，能夠起到抑制無乳鏈球菌生長的目的。表2使用產(chǎn)品后水體中短小芽孢桿菌一周內(nèi)存活數(shù)從表2中可以看出，施用本發(fā)明水劑微生態(tài)后，一周之內(nèi)，在池塘中都能檢測到較高水平的短小芽孢桿菌活菌，第3天菌體濃度達(dá)到最高。實(shí)施例7含有CD6粉劑的羅非魚飼料在養(yǎng)殖中的應(yīng)用對(duì)照塘和試驗(yàn)塘各兩口，面積20畝，水深1.5米。羅非魚品種吉富，3000尾/畝，實(shí)驗(yàn)周期60天。對(duì)照塘飼喂基礎(chǔ)日糧。試驗(yàn)塘為含有CD6菌粉的飼料，按照實(shí)例4值得的粉劑產(chǎn)品按照0.1％的比例添加到羅非魚基礎(chǔ)日糧當(dāng)中。按照上述方法制得的羅非魚顆粒飼料中CD6活菌數(shù)>106CFU/g。羅非魚飼喂方法：每日早晚飼喂一次，對(duì)照塘和試驗(yàn)塘投喂飼料量相同。打樣測定方法：每口池塘打樣10條，測定重量，每15天測定一次，并統(tǒng)計(jì)魚類死亡情況。表3羅非魚增重統(tǒng)計(jì)由表2可知，用含有CD6的飼料飼喂羅非魚，可以提高養(yǎng)殖過程中魚體增重量，降低料肉比，提高飼料轉(zhuǎn)化率。在死亡率統(tǒng)計(jì)中，發(fā)現(xiàn)飼喂對(duì)照飼料后，羅非魚的死亡率較對(duì) 照組明顯降低。在60天的試驗(yàn)過程中，試驗(yàn)塘羅非魚的死亡率較對(duì)照塘降低10％。由此可見，本發(fā)明的微生態(tài)制劑產(chǎn)品不但安全而且能夠顯著促進(jìn)水產(chǎn)動(dòng)物的個(gè)體增重，提高單位面積產(chǎn)量和總量，從而增加水產(chǎn)養(yǎng)殖的收入，提高效益。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3