本發(fā)明屬于煙草制備技術(shù)領(lǐng)域，具體一種枯草芽孢桿菌xp菌株在降解煙草制品中果膠方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌是芽胞桿菌屬的一種，廣泛分布在土壤及腐敗的有機(jī)物中，易在枯草浸汁中繁殖。其菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，可利用蛋白質(zhì)、多種糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚，在遺傳學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。此外，枯草芽孢桿菌菌體自身可合成α-淀粉酶、中性蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶等酶類，在降解復(fù)雜大分子化合物方面具有良好的應(yīng)用前景，因此近年來枯草芽孢桿菌逐漸成為被關(guān)注和研究的熱點(diǎn)。
煙葉發(fā)酵又稱為煙葉醇化，其實(shí)質(zhì)是在一定溫度和濕度條件下，促使煙葉理化特性發(fā)生深刻變化的過程，即將不利于煙葉品質(zhì)的大分子物質(zhì)組分（包括蛋白質(zhì)、淀粉、果膠等）降解轉(zhuǎn)化成有利于提升煙葉品質(zhì)的小分子組分（還原糖、氨基酸等），進(jìn)而達(dá)到克服新煙不良品質(zhì)，改良和提高煙葉內(nèi)在質(zhì)量與外觀質(zhì)量的目的。
煙葉醇化是卷煙工業(yè)提高產(chǎn)品質(zhì)量的一種初加工方法，也是卷煙加工中極為重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。煙草醇化或者發(fā)酵方法一般分為人工醇化和自然醇化兩種。人工醇化速度快，周期短，但醇化效果差；自然醇化是將煙葉按一定要求堆放在儲(chǔ)備倉(cāng)庫(kù)內(nèi)，在自然條件下進(jìn)行的醇化，時(shí)間一般為1~3年。自然醇化雖然效果較好，但也存在一些不足，如：1）醇化過程中，煙葉容易滋生蟲害；2）由于溫度、濕度的變化，煙葉容易產(chǎn)生霉變；3）醇化周期較長(zhǎng)，易造成庫(kù)存煙葉的積壓與大量資金的占用。
果膠是煙葉中的重要化學(xué)成分，以α-1，4糖苷鍵聚合形成的聚半乳糖醛酸為基礎(chǔ)，和纖維素一起構(gòu)成了煙葉細(xì)胞壁的基本結(jié)構(gòu)。在卷煙燃吸過程中，煙葉中的果膠會(huì)造成煙葉燃燒不完全，并產(chǎn)生甲醇，甲醇進(jìn)一步氧化成甲醛、甲酸等，是煙氣刺激性產(chǎn)生的主要因素，同時(shí)也對(duì)煙草安全性產(chǎn)生不利影響。因此，降低煙草中果膠含量對(duì)提高煙草品質(zhì)具有重要的意義。
在煙葉自然醇化過程中，煙葉中的果膠降解緩慢，因而也就為煙支的抽吸安全造成了潛在影響。針對(duì)這一缺陷，開發(fā)利用外源微生物制劑或者酶制劑，從而加速降解煙葉中的果膠等大分子物質(zhì)，進(jìn)而加快煙葉醇化進(jìn)程，縮短煙葉醇化周期，這對(duì)卷煙企業(yè)提高卷煙品質(zhì)、節(jié)約生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟(jì)效益具有廣泛而現(xiàn)實(shí)的意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
通過特定的枯草芽孢桿菌xp菌株的選擇，本發(fā)明目的在于提供枯草芽孢桿菌xp菌株在降解煙草制品中果膠方面的新應(yīng)用，從而獲得較為穩(wěn)定降低煙草中果膠含量的技術(shù)效果，進(jìn)而加快煙葉的醇化進(jìn)程，縮短醇化周期。
本申請(qǐng)所采取的技術(shù)方案詳述如下。
枯草芽孢桿菌在降解煙草制品中果膠方面的應(yīng)用，所述枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌xp菌株，其分類命名為Bacillus subtilis. xp，該菌株現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)珞珈山路16 號(hào)（武漢大學(xué)），保藏日期為：2011 年12 月9 日，保藏編號(hào)為CCTCC No ：M 2011452。
所述枯草芽孢桿菌在降解煙草制品中果膠方面的應(yīng)用，其用于降解煙草制品中果膠時(shí)，首先制備成菌劑，然后以煙草制品0.8~2.0%的質(zhì)量比例（優(yōu)選1.0%）均勻噴灑于煙草制品表面，最后在30~37℃、55~65%濕度條件下，貯藏醇化30~40d；
所述菌劑，具體為采用LB液體培養(yǎng)基制備的OD600=1.0~5.0的懸浮培養(yǎng)液；
所述煙草制品，具體可為新鮮采摘的或經(jīng)烘烤、晾曬、發(fā)酵后的不同品種、不同產(chǎn)地的全株煙草或部分組織器官，更進(jìn)一步而言，具體例如為烤煙葉片。
總體而言，本發(fā)明通過特定枯草芽孢桿菌菌株的選擇，在將其擴(kuò)增制備成菌劑后，應(yīng)用于煙草制品時(shí)，可有效降低煙草制品中果膠含量，改善煙葉質(zhì)量，提高其評(píng)吸效果，提升煙草等級(jí)，在確保醇化效果同時(shí)進(jìn)而加快煙葉醇化進(jìn)程。由于本發(fā)明可在短時(shí)間內(nèi)，以較低成本和較高效率較好改善煙草的吸食品質(zhì)，加上其操作流程較為簡(jiǎn)便，因而使得本申請(qǐng)?jiān)诰頍熤苽漕I(lǐng)域表現(xiàn)出較好的應(yīng)用價(jià)值和應(yīng)用前景。
附圖說明
圖1為本發(fā)明菌液制劑噴灑后作用時(shí)間對(duì)煙葉醇化中果膠降解率的影響。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本申請(qǐng)做進(jìn)一步解釋說明，在介紹具體實(shí)施例前，就下述實(shí)施例中涉及部分實(shí)驗(yàn)背景情況簡(jiǎn)要介紹如下。
實(shí)驗(yàn)材料：
供試煙葉：2015年河南許昌C3F，由河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供；
下述實(shí)施例中所采用的枯草芽孢桿菌xp菌株，其分類命名為Bacillus subtilis. xp，該菌株現(xiàn)保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No ：M 2011452；由于該菌株為申請(qǐng)人自行篩選獲得，且已在其他專利中有所公開，因而屬于可公開獲得的微生物資源，本申請(qǐng)屬于該菌株的新用途專利申請(qǐng)；
實(shí)驗(yàn)試劑：
LB液體培養(yǎng)基，常規(guī)配制并滅菌（121℃保溫15 min）即可，具體配方為：每1000 mL 去離子水中含有：酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCL 10 g，用NaOH 溶液調(diào)pH=7.0；
主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備：
UV-2550紫外分光光度計(jì)，為Shimadzu公司產(chǎn)品。
實(shí)施例
為將枯草芽孢桿菌xp菌株用于降解煙草制品中果膠，首先需將該菌株進(jìn)行適當(dāng)擴(kuò)增培養(yǎng)，制備成含有一定數(shù)量的活性菌劑才能加以應(yīng)用，菌劑的具體制備方法如下所述。
（1）菌種活化，利用接種環(huán)挑取斜面培養(yǎng)基（配方同LB液體培養(yǎng)基，僅另外添加15g/L瓊脂粉）上菌種，置于LB液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)12h進(jìn)行菌種活化；
（2）菌種擴(kuò)增，將步驟（1）中菌種活化后菌液轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)液中，35℃搖床培養(yǎng)至OD600=3.5左右，懸浮均勻后即可作為降解煙草制品用菌劑。
將上述菌劑具體用于降解煙草制品中果膠時(shí)，按煙草制品1.0%的質(zhì)量比例均勻噴灑于煙草制品表面，然后在35℃、55~65%濕度條件下貯藏醇化30~40d左右即可。
為確定具體降解果膠效果，具體以片狀（3cm×3cm）煙葉（去除煙梗的煙葉）作為煙草制品進(jìn)行了醇化處理，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（CK）（按煙草1.0%的質(zhì)量比例噴施蒸餾水），噴施后貯藏35d后，對(duì)煙葉中果膠降解率進(jìn)行測(cè)定并進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)價(jià)。
果膠降解率測(cè)定
果膠含量采用咔唑硫酸分光光度法進(jìn)行測(cè)定，具體測(cè)定步驟如下：
（1）準(zhǔn)確稱取分析純半乳糖醛酸（G.A.）0.0500 g，用蒸餾水溶解后定容于50 mL容量瓶中(濃度1000 mg/L)；
（2）于6個(gè)50mL容最瓶中分別吸取此液0、1、2、3、4、5 mL，稀釋至刻度(濃度0一100 mg/L)；
（3）分別吸取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液1mL于6支試管(20 mm ×150 mm)中，然后各加入濃硫酸6 mL，用自來水邊加邊冷卻至室溫；
（4）然后各加入0.30 mL 0.15%(1.500 g/L)咔唑無水乙醇溶液，搖勻；
（5）在室溫下暗處放置1.5 h，在540 nm波長(zhǎng)下用1 cm比色皿，以試劑空白作參比，測(cè)定吸光度(A)，繪制A一C標(biāo)準(zhǔn)曲線；
（6）準(zhǔn)確稱取0.035 g果膠粉于50mL燒杯中，加入10 mL 0.5mol/L硫酸、15 mL水，攪勻，在75℃水溶中水解15 min，冷卻至室溫后定容于50 mL容量瓶中；
（7）準(zhǔn)確移取5.0 mL該液于另一50 mL容量瓶，稀釋至刻度，同步驟（5）中吸光度測(cè)定；
（8）計(jì)算G.A.%=[C×50/(5×50)]÷[W×106] ×100%，
式中: C為從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的所測(cè)果膠液中G.A.的濃度(mg/L)，W為果膠粉質(zhì)量(g)；
根據(jù)不同果實(shí)果膠中G.A.的含量不同，可換算出相應(yīng)煙葉中果膠的含量；
（9）檢測(cè)得到各樣品果膠含量后，與初始對(duì)照組煙葉果膠含量比對(duì)，換算相應(yīng)的果膠降解率。
測(cè)定結(jié)果如圖1所示。
從圖1可以看出，隨著處理時(shí)間增加，空白對(duì)照組中煙葉樣品的果膠含量并無明顯變化；而經(jīng)菌劑處理后，處理組中煙葉樣品的果膠含量發(fā)生明顯變化，并且隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，果膠降解率持續(xù)增高，當(dāng)貯藏醇化處理30天時(shí)，煙葉中果膠降解率可達(dá)最高值（17%），之后趨于穩(wěn)定。
煙草制品感官質(zhì)量評(píng)價(jià)
在不同貯藏醇化時(shí)間段內(nèi)，取適量煙葉切絲，常規(guī)制備卷煙樣品，恒溫恒濕平衡后，由專業(yè)評(píng)委對(duì)煙支的香氣質(zhì)（A）、香氣量（B）、濃度（C）、柔細(xì)度（D）、余味（E）、雜氣（F）、刺激性（G）等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)定，每項(xiàng)指標(biāo)均按9分制打分，感官評(píng)吸總分（T）=（A+B）× 2.3 + C × 1.5 + D + E + F + G。
具體評(píng)價(jià)結(jié)果如下表所示：
CK為噴灑等量蒸餾水的對(duì)照煙葉（需要說明的是，貯藏35天后的評(píng)吸結(jié)果與此數(shù)據(jù)大致相同，故此省略）。
對(duì)上表數(shù)據(jù)分析可以看出，與樣品初始狀態(tài)相比，經(jīng)菌劑處理后，隨著貯藏醇化時(shí)間延長(zhǎng)，煙草制品的感官質(zhì)量可以得到持續(xù)性的改善。在處理30天時(shí)評(píng)吸總分達(dá)到最高值，總分相比對(duì)照增加了1.66分，結(jié)合上述煙葉果膠降解率結(jié)果，可確定菌液制劑的最佳處理時(shí)間為30天，此時(shí)可使煙葉果膠降解17%，評(píng)吸總分相比對(duì)照提高1.66分，使煙葉整體提高了一個(gè)等級(jí)，顯著加快了煙葉的醇化進(jìn)程，因而本發(fā)明在改善煙葉醇化質(zhì)量，縮短醇化周期方面具有良好的應(yīng)用前景。