本發(fā)明涉及一種具有抗三七根腐病作用的細菌及其作用--有效的預(yù)防三七根腐病的發(fā)生。
背景技術(shù)：
三七(學(xué)名：Panax notoginseng)為五加科人參屬植物，在我國已有400多年的栽培歷史，其作為一種名貴中藥，具有化瘀止血、消腫止痛等功效，三七的藥理作用主要體現(xiàn)在對血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、代謝、免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)等的影響。三七又名田七、滇三七、參三七、血參、田三七等。三七已有很多年的藥用歷史，其根、莖、葉、花均可入藥，是復(fù)方丹參滴丸、云南白藥、片仔癀、復(fù)方三七口服液等常見中藥制劑的主要成分之一，目前以三七為配方進入《國家基本藥物目錄》和《國家中藥保護品種目錄》的制劑達20余種。作為我國傳統(tǒng)的名貴藥材，三七生物學(xué)特性方面的研究也已十分詳實。
三七的市場需求正逐步增加，但就目前而言，三七的野生資源非常有限，而且采挖野生三七會破壞自然環(huán)境的生態(tài)平衡，三七資源遠遠不能滿足人們需求；最主要的是在不同的地區(qū)三七藥材的質(zhì)量差別非常大。因此通過大棚內(nèi)大批量種植三七就會解決這一系列的問題。但是，在大棚內(nèi)大批量種植三七會受到根腐病的影響，根腐病在各個季節(jié)都有發(fā)生，其發(fā)病比較集中在8月份，它的危害常常導(dǎo)致三七產(chǎn)量、質(zhì)量降低，嚴重者甚至全園絕收。
由于連年大面積單一種植，加之三七為多年生草本植物，性喜溫暖陰濕，因此病害問題十分突出，特別是根腐病問題，目前已成為限制三七種植業(yè)發(fā)展的嚴重障礙，根腐病常年發(fā)病率一般在5％～20％，嚴重的可損失70％以上。對該病的防治目前主要依靠輪作倒茬和化學(xué)藥劑灌根。但輪作年限一般要求8年以上，生產(chǎn)上難以大面積推行。藥劑灌根雖有效，但農(nóng)藥殘留問題嚴重。對于用細菌來作用于三七根腐病的防治研究并沒有相關(guān)報道。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種細菌--Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1，該菌株可預(yù)防三七根腐病的發(fā)生。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種細菌Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1，為銅綠假單胞菌PA01Pseudomonas aeruginosa PAO1，其保藏號為CCTCC NO：M 2016575。
本發(fā)明還同時提供了上述細菌Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1的用途：預(yù)防三七根腐病的發(fā)生。
該菌株P(guān)seudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1是從半夏植株中采用平板稀釋法分離得到一株細菌，經(jīng)鑒定其對由病原菌G3B引起的三七根腐病有拮抗作用。
具體分離方法為：
1)、將半夏經(jīng)表面消毒處理后，加入無菌水進行研磨稀釋，涂布于營養(yǎng)瓊脂上，于28～32℃培養(yǎng)1～3天；
營養(yǎng)瓊脂配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂18g和蒸餾水1000mL，pH＝7.2～7.4。
2)、挑取單菌落于相同的營養(yǎng)瓊脂平板劃線純化，于28～32℃培養(yǎng)1～3天；
3)、重復(fù)步驟2)，直至獲得純培養(yǎng)物。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此。
實施例1、拮抗菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1)的分離培養(yǎng)方法，依次進行以下步驟：
1、采集浙江省的半夏植株，洗凈后25KHz超聲波處理5分鐘；
2、在無菌條件下，對步驟1所得的供試材料用滅菌去離子水沖洗3次，并依次用75％(v/v)的酒精和3％(m/V)次氯酸鈉溶液表面消毒；
3、在無菌環(huán)境中，繼續(xù)將步驟2所得供試材料用無菌水沖洗3次，取100μl最后1次沖洗的無菌水沖洗液涂布接種于營養(yǎng)瓊脂上，30℃培養(yǎng)24h后，進行無菌驗證。
如無菌落產(chǎn)生，則繼續(xù)后續(xù)的步驟4；如有菌落產(chǎn)生，則返回步驟2繼續(xù)表面消毒處理。
4、在超凈臺中，取處理好的半夏樣品1～2g，在無菌研缽中充分研磨，并加入5mL無菌水，混勻，靜置15min，取100μl上清稀釋涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，置于28～32℃(較佳30℃)培養(yǎng)1～3天；
5、挑取步驟4中所產(chǎn)的單菌種于相同培養(yǎng)基劃線純化分離，置于28～32℃(較佳30℃)培養(yǎng)1～3天，繼續(xù)挑取單菌落；
重復(fù)上述操作直至得到純培養(yǎng)為止。
實施例2、拮抗菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1)的初篩，依次進行以下步驟：
1、拮抗菌的初篩在平板上進行，采用平板對峙培養(yǎng)方法進行篩選：用打孔器沿著病原真菌菌絲生長旺盛的地方打孔獲得菌碟。
2、將植物病原菌G3B的菌碟接種到PDA培養(yǎng)皿的中央，在其四周與植物病原菌G3B等距約3cm的四個點上，粘上直徑為7mm的濾紙四片，每片濾紙上點接上10μl的供試菌(濃度約為108cfu/ml)。所述供試菌為實施例1中分離純化出來的所有細菌。
上述植物病原菌G3B來源于CCTCC，其保藏號為：CCTCC AF 2016007。
3、設(shè)置只接種病原菌的培養(yǎng)皿為空白對照組，每個處理三個重復(fù)，然后置于22℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10d，觀察和測量植物病原真菌的菌落直徑。
實施例3、拮抗菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1)的復(fù)篩，根據(jù)初篩結(jié)果，將篩選出來的對病原菌G3B具有較強拮抗效果的細菌作為供試菌株，進一步進行復(fù)篩，依次進行以下步驟：
1、拮抗菌的初篩在平板上進行，采用平板對峙培養(yǎng)方法進行篩選：用打孔器沿著病原真菌菌絲生長旺盛的地方打孔獲得菌碟。
2、將植物病原菌的菌碟接種到PDA培養(yǎng)皿的中央，在其四周與植物病原菌等距約3cm的四個點上，粘上直徑為7mm的濾紙四片，每片濾紙上點接上10μl的供試菌(濃度約為108cfu/ml)。
3、設(shè)置只接種生防菌或者只接種病原菌的培養(yǎng)皿為空白對照組，每個處理三個重復(fù)，然后置于22℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7-10d，觀察和測量植物病原真菌的菌落直徑。
4、測量抑菌條帶并按下列公式計算抑制率：菌絲生長抑制率(％)＝(單獨培養(yǎng)菌落半徑－對峙培養(yǎng)菌落半徑)/單獨培養(yǎng)菌落半徑×100。所得的結(jié)果如下表1所示。
表1、Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1菌絲生長抑制率
將上述復(fù)篩所得的菌株P(guān)seudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1進行保藏，保藏信息具體如下：
保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：中國武漢武漢大學(xué)；保藏名稱：銅綠假單胞菌PA01Pseudomonas aeruginosa PAO1，保藏號為CCTCC NO：M 2016575，保藏日期2016.10.18。
實施例4、拮抗菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1，即保藏號為CCTCC NO：M 2016575的銅綠假單胞菌PA01Pseudomonas aeruginosa PAO1)的三七切片復(fù)篩，依次進行以下步驟：
1、菌液制備：①病原真菌G3B菌液制備：將從三七病根分離的病原真菌G3B，在PDA固體斜面培養(yǎng)基上活化，22℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～14d，用無菌ddH2O洗下孢子并制成107cfu/mL病原菌懸浮液。
②接抗菌液制備：用無菌水將培養(yǎng)24h的斜面生長(培養(yǎng)條件為30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2d)的拮抗細菌洗下，制成拮抗菌懸液；拮抗菌懸液中拮抗菌濃度為108cfu/mL。
2、切片制備：將健康的三七根用流水沖洗30min；70％酒精浸泡20s；3％次氯酸鈉溶液浸泡3min；用無菌ddH2O沖洗5次；用無菌手術(shù)刀片將表面消毒的根切成每片5mm厚的薄片，置于含有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中添加1mL無菌水保濕。
3、接種：拮抗菌采用菌液浸泡的方式接種(即，放入5ml拮抗菌懸液中浸泡)，浸泡時間分別為20min，病原菌采用點接的方式接種，每個薄片的接種量為20ul。先接拮抗菌再接病原菌，間隔時間為24h。
4、處理方式：
設(shè)置①CK0(接無菌水)、②CK1(接病原菌G3B)、③接拮抗菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1)、④接拮抗菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1)+病原菌G3B四個處理。每個處理三個重復(fù)。
5、培養(yǎng)：22℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，接種7d后調(diào)查發(fā)病情況，統(tǒng)計病情指數(shù)，計算防治效果。所得的結(jié)果如下表2所示。
表2、拮抗菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1)對不同離體材料根腐病的抑制效果
實施例5、拮抗菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1，即保藏號為CCTCC NO：M 2016575的銅綠假單胞菌PA01Pseudomonas aeruginosa PAO1)的盆栽試驗，依次進行以下步驟：
1、在云南文山制備三七盆栽植株，每盆3株；將拮抗菌液(108cfu/ml)接種于三七植株根基部，5mL/株；
2、移栽24h后，采用灌根法，將病原菌的孢子液分別加入已移栽好的三七盆栽植株的根部，根部事先適當(dāng)給予針刺。接種病原菌液(107cfu/ml)，5mL/株。
3、設(shè)置①CK0(接無菌水)、②CK1(接病原菌G3B)、③接拮抗菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1)、④接拮抗菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1)+病原菌G3B四個處理，各處理重復(fù)3次，置于室外大棚基地培養(yǎng)，7d后觀察、記錄發(fā)病情況。所得的結(jié)果如下表3所示。
表3、內(nèi)生拮抗細菌的溫室盆栽防治效果
對比實驗、將以下的菌株A～菌株D替代拮抗菌(Pseudomonas aeruginosa PAO1strain PAO1)按照實施例5所述方法進行+病原菌G3B的實驗(菌液濃度和用量均等同于實施例5)，所得結(jié)果如下表4：
表4、不同菌株的溫室盆栽防治效果
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。