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誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌樣細(xì)胞分化的方法與流程

文檔序號(hào):11899054閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種用于誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌樣細(xì)胞分化的方法,所述方法包括采用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,其中所述無(wú)血清培養(yǎng)基包含:高糖DMEM、血清替代物、B27無(wú)血清添加劑、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復(fù)合物、非必需氨基酸、N-2無(wú)血清添加劑,以及肝素、長(zhǎng)春花堿Ⅲ、尼古酰胺和重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和五肽胃泌素。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于,以100體積份計(jì),所述無(wú)血清培養(yǎng)基包含:85-95體積份的葡萄糖含量為4.5g/L的高糖DMEM、5-8體積份的血清替代物、1-4體積份的B27無(wú)血清添加劑(50×)、1-1.5體積份的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復(fù)合物、0.5-2體積份的非必需氨基酸水溶液、0.5-2體積份的N-2無(wú)血清添加劑(100×),以及在所述無(wú)血清培養(yǎng)基中終濃度為0.5-2ug/ml的肝素、終濃度為50-200ng/ml的長(zhǎng)春花堿Ⅲ、終濃度為5-20mmol/L的尼古酰胺和終濃度各自為5-20ng/ml的重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和五肽胃泌素。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法,其特征在于,以100體積份計(jì),所述無(wú)血清培養(yǎng)基包含:89體積份的葡萄糖含量為4.5g/L的高糖DMEM、5體積份的血清替代物、2體積份的B27無(wú)血清添加劑(50×)、1體積份的胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒復(fù)合物、1體積份的非必需氨基酸水溶液、1體積份的N-2無(wú)血清添加劑(100×),以及在所述無(wú)血清培養(yǎng)基中終濃度為1ug/ml的肝素、終濃度為100ng/ml的長(zhǎng)春花堿Ⅲ、終濃度為10mmol/L的尼古酰胺和終濃度各自為10ng/ml的重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和五肽胃泌素。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述非必需氨基酸水溶液包含濃度各自為8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天門酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和絲氨酸。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述無(wú)血清培養(yǎng)基通過包括以下步驟的方法制得:將各個(gè)成分混合均勻。

6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為人來(lái)源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞,優(yōu)選從自然分娩或剖宮產(chǎn)的健康新生兒新鮮臍帶組織分離出的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述方法包括以下步驟:

(1)將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以2-6×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于所述無(wú)血清培養(yǎng)基中,然后在CO2 5%、37℃下培養(yǎng);

(2)每2-3天將步驟(1)的細(xì)胞培養(yǎng)物于300-800rpm下離心4min,吸棄舊培養(yǎng)基,更換為新鮮的所述無(wú)血清培養(yǎng)基;

(3)培養(yǎng)6-7天,收獲細(xì)胞;

(4)檢測(cè)步驟(3)的所收獲細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效果。

8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述步驟(4)包括檢測(cè)以下項(xiàng)目中的一項(xiàng)或多項(xiàng):?jiǎn)挝患?xì)胞胰島素釋放量;胰島素釋放相關(guān)基因PDX-1、INSULIN和NGN-3的表達(dá);細(xì)胞核蛋白PDX-1和胞漿蛋白Insulin的存在;雙硫腙染色;胰島素分泌樣細(xì)胞特異性標(biāo)志PDX-1、NKX6.1、Insulin的陽(yáng)性表達(dá)率。

9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于,所述方法包括以下步驟:

(1)將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞以5×104個(gè)細(xì)胞/cm2的密度接種于超低吸附六孔培養(yǎng)板中的所述無(wú)血清培養(yǎng)基中,然后在CO2 5%、37℃下培養(yǎng);

(2)每2天將步驟(1)的細(xì)胞培養(yǎng)物于500rpm下離心4min,吸棄舊培養(yǎng)基,更換為新鮮的所述無(wú)血清培養(yǎng)基;

(3)培養(yǎng)6-7天,收獲細(xì)胞;

(4)檢測(cè)步驟(3)的所收獲細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效果。

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