專(zhuān)利名稱(chēng)：體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬干細(xì)胞組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
心肌缺血是臨床治療中常見(jiàn)的心臟損傷類(lèi)型，為實(shí)現(xiàn)缺血心肌在結(jié)構(gòu)與功能的再修復(fù)，最近有學(xué)者提出細(xì)胞水平心肌重塑(cellular cardiomyocyteplasty，CCM)即移植外源細(xì)胞至受損心肌，通過(guò)促進(jìn)和提高心肌細(xì)胞再生能力及血運(yùn)供給以減少心室重構(gòu)、改善心肌功能。迄今已有多種細(xì)胞被應(yīng)用于CCM研究，但均存在來(lái)源受限，數(shù)量不足等問(wèn)題。因此尋找更佳來(lái)源的供體細(xì)胞已成為CCM研究應(yīng)用的關(guān)鍵。干細(xì)胞作為一類(lèi)兼具自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群體，近年來(lái)愈來(lái)愈受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。目前，通過(guò)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)和人工操作，科學(xué)家們正致力于實(shí)現(xiàn)對(duì)某些損傷性疾病的細(xì)胞替代治療。
1981年，小鼠胚胎干細(xì)胞系(ES)的建立開(kāi)辟了研究的新紀(jì)元。基于ES細(xì)胞本身所具有的無(wú)限增殖能力及分化的全能性，研究者嘗試著將ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，并應(yīng)用于缺血性心肌損傷的細(xì)胞治療。許多實(shí)驗(yàn)室的研究工作已經(jīng)表明ES細(xì)胞可以自發(fā)性分化形成跳動(dòng)的心肌合胞體，其表型特征及超微結(jié)構(gòu)皆與成熟的心肌細(xì)胞相類(lèi)似。將ES源性心肌細(xì)胞移植至mdx小鼠，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其能夠形成穩(wěn)定的心肌細(xì)胞移植體。可見(jiàn)，以ES細(xì)胞作為CCM的供體細(xì)胞是相當(dāng)有應(yīng)用前景的。
但是，在ES形成的擬胚體(EB)只有約5％的細(xì)胞可自發(fā)分化為心肌細(xì)胞，因此，提高ES來(lái)源心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化率以及實(shí)現(xiàn)分化細(xì)胞的體外富集成為CCM研究領(lǐng)域的主要制約因素。目前，已有學(xué)者報(bào)道一定劑量5-氮胞苷、維甲酸或二甲基亞砜等均可作為誘導(dǎo)分化劑而成功地誘導(dǎo)出小鼠心肌細(xì)胞，從而使誘導(dǎo)分化率得到不同程度的提高。此外，還有一些細(xì)胞因子也應(yīng)用于上述相關(guān)研究。盡管如此，由于ES細(xì)胞其定向分化的機(jī)制尚未明確，各種誘導(dǎo)分化劑的作用機(jī)理也并不清晰，所以在應(yīng)用ES源心肌細(xì)胞進(jìn)行心肌組織工程等下游工作時(shí)，通過(guò)上述誘導(dǎo)分化劑所獲得的心肌細(xì)胞的數(shù)量并不理想。基于此，誘導(dǎo)ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的方法有待進(jìn)一步更新與完善。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種獲得胚胎干細(xì)胞來(lái)源的心肌細(xì)胞的體外誘導(dǎo)方法，其特征是將帶有熒光標(biāo)記的小鼠胚胎干細(xì)胞(ES-GFP)與新生鼠原代心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng)，于體外創(chuàng)造胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化誘導(dǎo)分化的微環(huán)境，從而促進(jìn)ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。其方法為大鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系的建立所述原代心肌細(xì)胞取自1-2日齡新生大鼠，經(jīng)胰蛋白酶消化制備為1-2×105/ml的細(xì)胞懸液，接種至明膠包被的培養(yǎng)皿。體外培養(yǎng)48-72小時(shí)，其間經(jīng)過(guò)0.1mmol/ml BrdU處理以抑制成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖。PBS充分沖洗后將擬胚體加入到該培養(yǎng)體系中進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。129小鼠源性小鼠胚胎干細(xì)胞建首先經(jīng)過(guò)去飼養(yǎng)層細(xì)胞后懸浮培養(yǎng)成為擬胚體，6天后再與原代心肌細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。因其帶有GFP報(bào)告基因，因此ES源心肌細(xì)胞易于與心肌細(xì)胞相鑒別。
誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化復(fù)蘇ES-GFP細(xì)胞，常規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)1-2天，胰酶消化，1∶3傳代。2天后收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液置于100mm細(xì)菌級(jí)培養(yǎng)皿內(nèi)(0.1％明膠預(yù)處理)懸浮培養(yǎng)30分鐘，待大部分飼養(yǎng)層細(xì)胞貼壁后，重新吸取細(xì)胞懸液至另一細(xì)菌級(jí)培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)，該步驟可去除飼養(yǎng)層細(xì)胞，以后定期換液，懸浮培養(yǎng)5天后，形成擬胚體(EB)。將上述EB加入到備用的原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)體系中(約20個(gè)/皿)，同時(shí)設(shè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組對(duì)照組1∶10uM 5-氮胞苷+15％H-DMEM；對(duì)照組215％H-DMEM。各實(shí)驗(yàn)及對(duì)照組均設(shè)3個(gè)平行皿。
所述方法的優(yōu)點(diǎn)為1)建立小鼠胚胎干細(xì)胞與原代心肌細(xì)胞的共培養(yǎng)體系，細(xì)胞來(lái)源不受限制，取材方便，操作簡(jiǎn)單易行。其中，原代心肌細(xì)胞取材自新生大鼠心臟，分離技術(shù)已經(jīng)成熟，過(guò)程中無(wú)須克服成纖維細(xì)胞的污染，因?yàn)槌衫w維細(xì)胞的存在有助于在體外進(jìn)一步模擬構(gòu)建ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的微環(huán)境。2)該體外誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)體系成分構(gòu)成比較簡(jiǎn)單，除含15％胎牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基外，不需要添加任何的細(xì)胞因子或其他的誘導(dǎo)分化劑，而這些促分化成分的經(jīng)濟(jì)價(jià)格比較昂貴，因此該培養(yǎng)方法在實(shí)際科研工作中經(jīng)濟(jì)適用。3)誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的比率比較高(可達(dá)50-60％)，有助于獲得理想數(shù)量的供體細(xì)胞。本發(fā)明利用與原代心肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系，于體外創(chuàng)造ES誘導(dǎo)分化的微環(huán)境，從而促進(jìn)ES細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，以獲得理想數(shù)量的ES源心肌細(xì)胞，最終提供基礎(chǔ)科研、臨床應(yīng)用之所需。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠ES細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞1)新生大鼠心肌細(xì)胞的分離和培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備無(wú)菌解剖剪2把；5號(hào)鉗子2把；調(diào)溫?cái)嚢杵鳎?5ml帶塞錐形瓶(攪拌子)；冰臺(tái)；一次性無(wú)菌塑料培養(yǎng)皿試劑H-DMEM培養(yǎng)基(Gibico)，胎牛血清胰酶的配制鹽水A 90毫升1％胰酶1∶30010毫升使用當(dāng)天配制，無(wú)菌過(guò)濾。
鹽水A配制Nacl 8gKcl 0.3gNaHCO3 0.35g葡萄糖 1g溶解于1L蒸餾水中，無(wú)菌過(guò)濾備用。
具體操作流程(該操作流程適用于20-30只新生鼠)冰臺(tái)經(jīng)乙醇擦拭后放入超凈臺(tái)，3個(gè)60mm組織培養(yǎng)皿內(nèi)各裝5ml鹽水A，置于冰臺(tái)，分別標(biāo)記1，2，3號(hào)↓新生鼠經(jīng)75％乙醇處理后操作間內(nèi)無(wú)菌取出心臟，置于1號(hào)培養(yǎng)皿內(nèi)去除結(jié)締組織及血塊，轉(zhuǎn)入2號(hào)漂洗，再到3號(hào)皿中。吸棄3號(hào)皿鹽水，加入2ml預(yù)熱胰酶，剪碎心臟組織↓將組織碎塊移入有攪拌子的錐形瓶，補(bǔ)加胰酶到10ml，置于37℃水浴，轉(zhuǎn)速60r/min，消化15min。所得主要為紅細(xì)胞，棄上清后重新加入胰酶10ml消化。吸管吹打，機(jī)械分散細(xì)胞，孵育10min↓取裝有10毫升預(yù)冷全培養(yǎng)基的離心管，轉(zhuǎn)移上清到離心管中停止消化。此為第一次收集到的分離細(xì)胞。余下的組織塊繼續(xù)胰酶消化，重復(fù)消化細(xì)胞至散開(kāi)所有細(xì)胞團(tuán)↓離心收集細(xì)胞，吸棄上清后重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)，接種密度調(diào)整為5-6×105/ml，將懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng)過(guò)0.1％明膠預(yù)處理100mm組織培養(yǎng)皿。孵育4-6小時(shí)后，可更換培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)↓用含0.1mmol/ml BrdU的培養(yǎng)基處理48小時(shí)，以抑制成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖。后以0.1mol/LPBS緩沖液洗滌3-5次，備用2)ES細(xì)胞形成擬胚體準(zhǔn)備工作常規(guī)ES細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(H-DMEM)；60mm無(wú)菌組織培養(yǎng)皿；小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)層。具體操作流程復(fù)蘇ES-GFP細(xì)胞，常規(guī)生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)1-2天，胰酶消化，1∶3傳代↓2天后收集細(xì)胞，將細(xì)胞懸液置于100mm細(xì)菌級(jí)培養(yǎng)皿內(nèi)(0.1％明膠預(yù)處理)懸浮培養(yǎng)30分鐘，待大部分飼養(yǎng)層細(xì)胞貼壁后，重新吸取細(xì)胞懸液至另一細(xì)菌級(jí)培養(yǎng)皿懸浮培養(yǎng)，該步驟可去除飼養(yǎng)層細(xì)胞↓定期換液，懸浮培養(yǎng)5天后，形成擬胚體(EB)
3)共培養(yǎng)誘導(dǎo)ES-GFP向心肌細(xì)胞分化將上述EB加入到備用的原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)體系中(約20個(gè)/皿)，同時(shí)設(shè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組對(duì)照組1——10uM 5-氮胞苷+15％H-DMEM；對(duì)照組2——15％H-DMEM。各實(shí)驗(yàn)及對(duì)照組均設(shè)3個(gè)平行皿。
結(jié)果觀察到實(shí)驗(yàn)組EB于2小時(shí)內(nèi)完全貼壁，而對(duì)照組1和組2中EB在48小時(shí)后仍未完全貼壁。培養(yǎng)6-7天后，相差顯微鏡下可觀察到多個(gè)跳動(dòng)的心肌細(xì)胞合胞體。其收縮節(jié)律為47--60次/分。具體見(jiàn)表不同組別ES細(xì)胞分化為心肌合胞體的數(shù)目比較組別 接種EB數(shù)目 心肌合胞體數(shù)目(個(gè)/皿) (個(gè)，X±SD)試驗(yàn)組20 10.9±2.0對(duì)照組1*20 5.0±1.2對(duì)照組2**20 1±0.3(n＝3，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，t檢驗(yàn)分析P*＜0.05；P**＜0.01)結(jié)果表明大鼠心肌細(xì)胞共培養(yǎng)體系可顯著提高胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化水平。
權(quán)利要求
1.體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的方法，其特征是包括胚胎干細(xì)胞與原代心肌細(xì)胞的共培養(yǎng)體系的建立。
2.權(quán)利要求1中所述的胚胎干細(xì)胞，其特征是可以是人源的，也可以是小鼠的或是其它動(dòng)物的。
3.權(quán)利要求1所述的原代心肌細(xì)胞，取材自1-2日齡新生大鼠活小鼠的心臟，其中可以包括有成纖維細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1中所述的原代心肌細(xì)胞，其分離方法是新生鼠經(jīng)75％乙醇處理后操作間內(nèi)無(wú)菌取出心臟，置于1號(hào)培養(yǎng)皿內(nèi)去除結(jié)締組織及血塊。剪碎心臟組織，加入預(yù)熱的0.05～0.25％胰蛋白胰酶，將組織碎塊移入有攪拌子的錐形瓶，補(bǔ)加胰酶，置于37℃水浴，消化5～15min。吸管吹打，機(jī)械分散細(xì)胞，孵育5～10min。離心收集細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1中所述的原代心肌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞培養(yǎng)體系，其特征是通過(guò)0.1mmol/mlBrdU處理48小時(shí)，以抑制成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖。
6.權(quán)利要求1中所述的共培養(yǎng)體系，其特征是可以是將胚胎干細(xì)胞直接與心肌細(xì)胞接觸，或者在雙室培養(yǎng)裝置中共用培養(yǎng)液但不接觸。
全文摘要
本發(fā)明涉及建立一種體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的方法，屬于干細(xì)胞組織工程領(lǐng)域。即通過(guò)胚胎干細(xì)胞與原代心肌細(xì)胞的共培養(yǎng)，構(gòu)建體外誘導(dǎo)分化的微環(huán)境，以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化。該方法可用于基礎(chǔ)科研，并為心肌組織工程提供種子細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1566332SQ0314789
公開(kāi)日2005年1月19日 申請(qǐng)日期2003年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月30日
發(fā)明者王常勇, 王秀麗, 郭希民, 段翠密, 趙云山 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所