使人胚胎干細(xì)胞分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的制作方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求于2012年6月14日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列號(hào)61/741，776的 權(quán)益，所述美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)全文以引用方式并入本文用于任何目的。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及處理多能細(xì)胞的方法，其中通過用GSK-3B酶活性抑制劑處理多能細(xì) 胞，可使該多能細(xì)胞在培養(yǎng)物中有效擴(kuò)增和分化。
【背景技術(shù)】
[0004] 用于I型糖尿病的細(xì)胞替代療法的進(jìn)展以及可移植胰島的缺乏已使得注意力集 中在開發(fā)適于移植物移入的胰島素生成細(xì)胞或β細(xì)胞的來(lái)源上。一種方法是從多能細(xì)胞 (例如胚胎干細(xì)胞）產(chǎn)生功能性β細(xì)胞。
[0005] 在脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育中，多能干細(xì)胞可在稱為原腸胚形成的過程中產(chǎn)生包括三 個(gè)胚層（外胚層、中胚層和內(nèi)胚層）的一組細(xì)胞。諸如例如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝臟之 類的組織將從內(nèi)胚層，經(jīng)由中間階段發(fā)育而來(lái)。該過程中的中間階段為形成定形內(nèi)胚層。定 形內(nèi)胚層細(xì)胞可表達(dá)多種標(biāo)志物，例如HNF-3 β、GATA-4、MiX11、CXCR4和SOX-17。
[0006] 定形內(nèi)胚層分化成胰腺內(nèi)胚層導(dǎo)致形成胰腺。胰腺內(nèi)胚層的細(xì)胞可表達(dá)胰-十二 指腸同源盒基因 rox-ι。在不存在rox-i時(shí)，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再發(fā)育。因此， PDX-I的表達(dá)標(biāo)志著胰腺器官形成中的關(guān)鍵步驟。除了其他細(xì)胞類型，成熟的胰腺還包括外 分泌組織和內(nèi)分泌組織。外分泌和內(nèi)分泌組織來(lái)自胰腺內(nèi)胚層的分化。
[0007] 產(chǎn)生足夠量的細(xì)胞物質(zhì)用于移植需要可在培養(yǎng)物中有效擴(kuò)增并有效分化成所關(guān) 注的組織（例如功能性β細(xì)胞）的細(xì)胞物質(zhì)來(lái)源。
[0008] 培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的當(dāng)前方法較復(fù)雜；它們需要使用外源因子或化學(xué)成分確定的 培養(yǎng)基以便使細(xì)胞增殖而不喪失其多能性。此外，胚胎干細(xì)胞的分化通常導(dǎo)致細(xì)胞在培養(yǎng) 物中擴(kuò)增減少。
[0009] 例如，Cheon 等人（BioR印rod DOI : 10. 1095/biolr印rod. 105. 046870,2005 年 10 月19日）公開了一種無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)系統(tǒng)，其中胚胎干細(xì)胞維持在補(bǔ)充有能引發(fā) 胚胎干細(xì)胞自我更新的不同生長(zhǎng)因子的未經(jīng)調(diào)理的血清替代（SR)培養(yǎng)基中。
[0010] 又如，US20050233446公開了一種可用于培養(yǎng)干細(xì)胞的成分確定的培養(yǎng)基，所述干 細(xì)胞包括未分化的靈長(zhǎng)類原始干細(xì)胞。在溶液中，該培養(yǎng)基與被培養(yǎng)的干細(xì)胞基本上等滲。 在給定的培養(yǎng)物中，特定的培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基和各為一定量的bFGF、胰島素和抗壞血 酸，所述bFGF、胰島素和抗壞血酸為支持原始干細(xì)胞進(jìn)行基本上非分化性生長(zhǎng)所必需。
[0011] 又如，W02005086845公開了一種維持未分化的干細(xì)胞的方法，所述方法包括使干 細(xì)胞暴露于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子_β (TGFP)蛋白家族的成員、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)蛋白家 族的成員或煙酰胺（NIC)，所述成員或煙酰胺的量足以維持細(xì)胞處于未分化狀態(tài)達(dá)足以實(shí) 現(xiàn)所需結(jié)果的一段時(shí)間。
[0012] 已知糖原合成酶激酶-3(GSK-3)的抑制劑可促進(jìn)成體干細(xì)胞的增殖和 擴(kuò)增。在一個(gè)實(shí)例中，Tateishi 等人（Biochemical and Biophysical Research Communications (2007) 352 :635)表明，抑制GSK-3可增強(qiáng)從新生兒或成人心臟回收并具有 間質(zhì)特征的人心臟干細(xì)胞（hCSC)的生長(zhǎng)和存活。
[0013] 例如，Rulifson 等人（PNAS 144,6247-6252，（2007))聲稱 "Wnt 信號(hào)傳導(dǎo)刺激胰 島β細(xì)胞增殖"。
[0014] 又如，W02007016485報(bào)道，添加 GSK-3抑制劑至非胚胎干細(xì)胞（包括多潛能成體 祖細(xì)胞）的培養(yǎng)物可導(dǎo)致在擴(kuò)增期間維持多能表型，并導(dǎo)致更強(qiáng)的分化響應(yīng)。
[0015] 又如，US2006030042利用通過添加 Wnt或GSK-3酶活性的小分子抑制劑來(lái)抑制 GSK-3的方法，來(lái)在不使用飼養(yǎng)細(xì)胞層的情況下維持胚胎干細(xì)胞。
[0016] 又如，W02006026473報(bào)道添加 GSK-3B抑制劑，通過轉(zhuǎn)錄激活c-myc和穩(wěn)定c-myc 蛋白來(lái)使多能細(xì)胞保持穩(wěn)定。
[0017] 又如，W02006100490報(bào)道使用含有GSK-3抑制劑和gpl30激動(dòng)劑的干細(xì)胞培養(yǎng)基 來(lái)維持多能干細(xì)胞（包括小鼠或人胚胎干細(xì)胞）的自我更新群體。
[0018] 又如，Sato等人（Nature Medicine(2004) 10 :55-63)表明，用特異性藥理性化 合物抑制GSK-3可維持胚胎干細(xì)胞的未分化表型以及維持多能狀態(tài)特異性轉(zhuǎn)錄因子例如 Oct-3/4、Rex-I 和 Nanog 的表達(dá)。
[0019] 又如，Maurer等人（Journal of Proteome Research(2007)6 :1198-1208)表明，用 GSK-3抑制劑處理成體神經(jīng)元干細(xì)胞可顯示出神經(jīng)元分化的增強(qiáng)，特別是通過促進(jìn)β -連 環(huán)蛋白靶基因的轉(zhuǎn)錄和使細(xì)胞凋亡降低。
[0020] 又如，Gregory 等人（Annals of the New York Academy of Sciences (2005) 1049 : 97-106)報(bào)道，GSK-3B的抑制劑可增強(qiáng)體外成骨作用。
[0021] 又如，F(xiàn)eng 等人（Biochemical and Biophysical Re search Communcations (2004) 324 :1333-1339)表明，胚胎干細(xì)胞向造血分化與Wnt/ β -連環(huán)蛋白 途徑的下調(diào)相關(guān)，其中Wnt為GSK3的天然抑制劑。
[0022] 因此，仍然非常需要開發(fā)用于處理多能干細(xì)胞而使得多能干細(xì)胞可被擴(kuò)增以滿足 當(dāng)前臨床需要，同時(shí)保持分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞、胰腺激素表達(dá)細(xì)胞或胰腺激素分泌細(xì)胞 的潛能的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023] 本發(fā)明提供了通過用GSK-3B酶活性抑制劑處理多能細(xì)胞而使多能細(xì)胞擴(kuò)增和分 化的方法。
[0024] 在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了使多能細(xì)胞擴(kuò)增和分化的方法，該方法包括以下 步驟：
[0025] a.培養(yǎng)多能細(xì)胞，以及
[0026] b.用GSK-3B酶活性抑制劑處理所述多能細(xì)胞。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施例中，所述多能細(xì)胞分化成可表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì) 胞。
[0028] 多能細(xì)胞可以為人胚胎干細(xì)胞，或者它們可以為根據(jù)60/913475中公開的方法衍 生自人胚胎干細(xì)胞的表達(dá)多能標(biāo)志物的細(xì)胞。
[0029] 在一個(gè)實(shí)施例中，GSK-3B酶活性抑制劑為式（I)的化合物：
[0030]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種使多能細(xì)胞擴(kuò)增和分化的方法，所述方法包括w下步驟： a. 培養(yǎng)多能細(xì)胞，W及 b. 用GSK-3B酶活性抑制劑處理所述多能細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多能細(xì)胞為衍生自胚胎干細(xì)胞的表達(dá)多能標(biāo) 志物的細(xì)胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述表達(dá)多能標(biāo)志物的細(xì)胞表達(dá)選自下列多能標(biāo) 志物中的至少一種；ABCG2、cripto、化義03、Connexin43、Connexin45、0ct4、S0X-2、Nanog、 hTERT、UTF-1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1 -60 和 Tra 1 -81。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多能細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性 標(biāo)志物的細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述多能細(xì)胞用GSK-3B酶活性抑制劑處理約1 至約72小時(shí)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述多能細(xì)胞用GSK-3B酶活性抑制劑處理約 12至約48小時(shí)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將所述多能細(xì)胞用GSK-3B酶活性抑制劑處理約 48小時(shí)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制劑W約lOOnM至約100 y M 的濃度使用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制劑W約1 y M至約10 y M 的濃度使用。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制劑W約10 y M的濃度使 用。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述GSK-3B酶活性抑制劑為式（I)的化合物：
式（I)。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中R1為苯基；取代的苯基，其中所述苯基取代基選 自Ci_5焼基、團(tuán)素、硝基、S氣甲基和膳；或嚼巧基。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中R,為苯基；取代的苯基，其中所述苯基取代基選 自Ci_5焼基、團(tuán)素、硝基、立氣甲基和膳；或任選地被C 1_4焼基取代的嚼巧基，并且R郝R 2中 的至少一者為嚼巧基。
15. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中Rs為氨；2-(H甲基甲娃焼基）己氧基甲基；Cw 焼氧基撰基；芳氧基撰基；芳基Ci_g焼氧基撰基；芳基C 焼基；取代的芳基C 焼基，其中 所述一個(gè)或多個(gè)芳基取代基獨(dú)立地選自Ci_5焼基、C 1_5焼氧基、團(tuán)素、氨基、C 1_5焼基氨基和 二Ci_5焼基氨基；鄰苯二甲醜亞胺基C 1_5焼基；氨基C 1_5焼基；二氨基C 1_5焼基；玻巧醜亞胺 基基；C 1-5；^基M基；芳基M基；C 1-5；^基M基C 1-5；^基；矛口芳氧基M基C 1-5；^基。
16. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中R 4為-(A)-畑2) q-X。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中A為亞己帰基、亞己快基或
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中Rg選自氨、Cw焼基、苯基和苯基Cw焼基。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中q為0-9。
20. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中X選自氨；輕基；己帰基；取代的己帰基，其中一 個(gè)或多個(gè)己帰基取代基各自選自氣、漠、氯和楓；己快基；取代的己快基，其中所述己快基 取代基選自氣、漠、氯和楓；Cw焼基；取代的Cw焼基，其中所述一個(gè)或多個(gè)焼基取代基各 自選自Cw焼氧基、H團(tuán)代焼基、鄰苯二甲醜亞胺基和氨基；Cs_，環(huán)焼基；Cw焼氧基；取代的 Cw焼氧基，其中所述焼基取代基選自鄰苯二甲醜亞胺基和氨基；鄰苯二甲醜亞胺基氧基； 苯氧基；取代的苯氧基，其中所述一個(gè)或多個(gè)苯基取代基各自選自Cw焼基、團(tuán)素和Cw焼 氧基；苯基；取代的苯基，其中所述一個(gè)或多個(gè)苯基取代基各自選自Cw焼基、團(tuán)素和C W焼 氧基；芳基Cw焼基；取代的芳基Cw焼基，其中所述一個(gè)或多個(gè)芳基取代基各自選自Cw焼 基、團(tuán)素和Ci_g焼氧基；芳氧基Ci_g焼基氨基；Ci_g焼基氨基；二Ci_g焼基氨基；膳；巧；予氧基 亞氨基；Cw焼氧基亞氨基；鄰苯二甲醜亞胺基；玻巧醜亞胺基；C W焼基撰氧基；苯基撰氧 基；取代的苯基撰氧基，其中所述一個(gè)或多個(gè)苯基取代基各自選自Cw焼基、團(tuán)素和Cw焼 氧基；苯基Cw焼基撰氧基，其中所述一個(gè)或多個(gè)苯基取代基各自選自C W焼基、團(tuán)素和C W 焼氧基；氨基撰氧基；Ci_g焼基氨基撰氧基；二C 焼基氨基撰氧基；C 焼氧基撰氧基；取 代的Cw焼氧基撰氧基，其中所述一個(gè)或多個(gè)焼基取代基各自選自甲基、己基、異丙基和己 基；苯氧基撰氧基；取代的苯氧基撰氧基，其中所述一個(gè)或多個(gè)苯基取代基各自選自Cw焼 基、Cw焼氧基和團(tuán)素；C W焼硫基；取代的C W焼硫基，其中所述焼基取代基選自輕基和鄰 苯二甲醜亞胺基；Cw焼基賴醜基；苯基賴醜基；取代的苯基賴醜基，其中所述一個(gè)或多個(gè) 苯基取代基各自選自漠、氣、氯、Ci_5焼氧基和二氣甲基；條件是如果A為
q為0， 并且X為H，則Rs可不為2-( H甲基甲娃焼基）己氧基甲基；W及它們藥學(xué)上可接受的鹽