專利名稱：人胚胎干細(xì)胞的造血分化的制作方法
與相關(guān)申請(qǐng)的相互參照沒(méi)有適用的。
關(guān)于聯(lián)邦政府贊助研究的聲明-- --發(fā)明背景本發(fā)明涉及用人胚胎干細(xì)胞來(lái)產(chǎn)生與血相關(guān)的細(xì)胞，和將這些與血相關(guān)的細(xì)胞用于各種目的。
最近我們實(shí)驗(yàn)室已描述了分離人胚胎干細(xì)胞穩(wěn)定培養(yǎng)物的方法。參見美國(guó)專利No.5,843,780和J.Thomson等人，282 Science 1145-1147(1998)。這些出版物和以下所引用的所有出版物本文都全部納入作為參考。
我們分別于1999年7月7日和1999年7月15日在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，U.S.A)保藏了我們的兩種人胚胎干細(xì)胞系。這兩種保藏物的分類描述分別為人胚胎干細(xì)胞系H1和H9。在這些出版物中已指出這兩種細(xì)胞系可與其它物質(zhì)一起用來(lái)提供用于各種類型研究、移植和其它目的的特定的細(xì)胞系源。
在這些出版物所述的儲(chǔ)存和培養(yǎng)條件下，這兩種細(xì)胞系可以長(zhǎng)期維持而不致分化成各種特定的細(xì)胞類型。當(dāng)這兩種細(xì)胞系被注射入免疫缺陷小鼠后，它們就可形成畸胎瘤，表明可分化成多樣性組織類型。
當(dāng)將胚胎干(ES)細(xì)胞用于產(chǎn)生所需的細(xì)胞時(shí)，往往側(cè)重于優(yōu)化向特定細(xì)胞類型的分化。對(duì)造血細(xì)胞而言，期望從而能得到可以分離并可用于形成多樣性造血譜系的造血細(xì)胞。這些細(xì)胞包括(但不限制于)造血干細(xì)胞。
已從骨髓直接分離了若干造血干細(xì)胞群。參見C.Baum等人，89 PNAS USA2804-2808(1992)。但這依賴骨髓的供給來(lái)獲得細(xì)胞。
人們已企圖將鼠胚胎細(xì)胞群變成造血細(xì)胞。參見美國(guó)專利No.5,914,268；G.Keller，7 Current Opinion In Cell Biology，862-869(1995)；和T.Nakano等人，265 Science 1098-1101(1994)。還可參見M.Weiss，11 Aplastic Anemia And StemCell Biology，1185-1195(1997)；和S.Morrison等人，11 Annu.Rev.CellDev.Biol.，35-71(1995)。
但將這些方法施用于靈長(zhǎng)類動(dòng)物就很困難。例如，在F.Li等人，92 Blood368a(1998)中討論了用基質(zhì)細(xì)胞系和外源細(xì)胞因子進(jìn)行獼猴胚胎干細(xì)胞系的分化。但最近該試驗(yàn)組報(bào)道它們的方法不足以形成集落。
用組織移植治療各種疾病已日益普遍。但需要排隊(duì)獲得天然捐贈(zèng)的器官、細(xì)胞或組織。即使得到了天然供體的材料，通常還存在排斥的問(wèn)題。抑制接受者免疫應(yīng)答的傳統(tǒng)方法還存在缺陷。例如，免疫抑制藥價(jià)格昂貴且往往有副作用。
在WO 98/07841中，公開了衍生出與所選供體MHC相容的胚胎干細(xì)胞的方法(如將供體的細(xì)胞核移植入去核的卵母細(xì)胞，然后從其衍生出干細(xì)胞)。此申請(qǐng)建議可用如此得到的細(xì)胞獲得MHC相容的造血干細(xì)胞，用于需要骨髓移植的醫(yī)學(xué)處理中。
然而，一些疾病如1型糖尿病或多發(fā)性硬化都涉及自身免疫應(yīng)答。例如，將朗格罕氏體(pancreatic islets)(與患者是MHC相容的)替代受損的朗格罕氏體，并不能為減輕I型糖尿病提供足夠長(zhǎng)時(shí)間，因?yàn)樗拗鞯拿庖呦到y(tǒng)最終將攻擊移植入的胰島。
因此可以看出需要一種方法能讓人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物分化成所需的造血細(xì)胞集落。另外，需要開發(fā)造血細(xì)胞的改進(jìn)用途。
發(fā)明概述本發(fā)明的一方面提供了獲得人造血細(xì)胞的方法。將人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物與哺乳動(dòng)物造血基質(zhì)細(xì)胞相接觸，從而產(chǎn)生人造血細(xì)胞。至少部分如此產(chǎn)生的人造血細(xì)胞是CD34+和/或能在甲基纖維素培養(yǎng)基上形成造血細(xì)胞集落形成單位。
如C.Baum等人，89 PNAS USA 2804-2808(1992)和S.Morrison等人，11Annu.Rev.Cell Dev.Biol.，35-71(1995)所述，CD34是造血干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)記物。形成集落形成單位能力的特性是細(xì)胞具有形成更多分化的造血譜系所需的特性。
較佳的是從骨髓細(xì)胞或胚胎卵黃囊細(xì)胞衍生的基質(zhì)細(xì)胞。鼠基質(zhì)細(xì)胞可用于此目的。而靈長(zhǎng)類和其它哺乳動(dòng)物的基質(zhì)細(xì)胞也都適合。
本發(fā)明的另一方面提供了從體外培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞衍生出的人造血細(xì)胞，能在甲基纖維素培養(yǎng)物中形成造血細(xì)胞集落形成單位。在本專利中，術(shù)語(yǔ)“衍生的”指直接或間接(如，通過(guò)一種或多種中間體或一次或多次傳代)獲得的。
在本發(fā)明在另一方面提供了一種將人細(xì)胞物質(zhì)移植入人受體宿主的方法。獲得了在體外從胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物衍生的人造血細(xì)胞。然后獲得了造血細(xì)胞以外的所選的人細(xì)胞物質(zhì)，這種所選的非造血系材料具有與造血細(xì)胞相容的主要組織相容性復(fù)合物。然后將造血細(xì)胞和所選的非造血細(xì)胞物質(zhì)一起轉(zhuǎn)移到人類宿主。
例如，可以獲得在體外從胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物(如用以下方法)衍生的人造血細(xì)胞。也可獲得對(duì)造血細(xì)胞具有MHC相容性的人朗格罕氏體。然后將造血細(xì)胞和朗格罕氏體一起移植入人體(較佳的是，當(dāng)受體本身的骨髓已失活后)。
可以從供體(其細(xì)胞用于產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物)直接獲得朗格罕氏體。另外，單一的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物可以按兩種不同的途徑分化。一種過(guò)程，可以用所述方法來(lái)產(chǎn)生造血干細(xì)胞。隨后，當(dāng)移植入合適的宿主后，這些細(xì)胞可發(fā)育成多樣化的造血譜系。這些譜系包括能耐受從同一親代胚胎干細(xì)胞衍生的其它細(xì)胞的淋巴細(xì)胞。在另一種過(guò)程中，將干細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化成朗格罕氏體。
在另一實(shí)施例中，可以向患多發(fā)性硬化的人提供少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。獲得在體外從胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物衍生的人造血細(xì)胞(如用以下方法)。也可獲得與骨髓細(xì)胞具有MHC相容性的人少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，并可將骨髓細(xì)胞和少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞一起移植入人體。
其遺傳物質(zhì)用于產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞的同一人可用作少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的供體。另外，相同的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物可通過(guò)兩種途徑分化，從而提供兩種可移植的物質(zhì)。
通過(guò)這種方法可以降低疾病(和潛在的其它自身免疫疾病)的免疫和自身免疫排斥問(wèn)題。由此看來(lái)，在移植前可用輻射或化學(xué)方法使接受者本來(lái)的骨髓完全或部分失活。然后至少部分用移植入的造血細(xì)胞替代。自身骨髓的清除/減少降低了身體產(chǎn)生自體免疫反應(yīng)的能力。替換的骨髓和后繼的可移植物質(zhì)的MHC匹配確保了第二次物質(zhì)不會(huì)被已移植的骨髓排斥。
另外，可進(jìn)行造血細(xì)胞和其它組織的一起移植來(lái)促進(jìn)對(duì)后繼組織的接受(如用心肌與造血細(xì)胞一起來(lái)治療心臟??；用肝細(xì)胞與造血細(xì)胞一起來(lái)治療肝病)。通過(guò)產(chǎn)生造血系嵌合體，可以獲得類似匹配MHC類型的組織對(duì)移植的改善的接受性。
本發(fā)明適用于獲得廣范圍的有價(jià)值的造血細(xì)胞，如紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞前體、單核細(xì)胞、B細(xì)胞、T細(xì)胞等。由此看來(lái)，在收獲了分成單一類型細(xì)胞和接種于合適的培養(yǎng)基時(shí)，分化的ES細(xì)胞集落就可長(zhǎng)成造血集落。這些集落表明集落形成細(xì)胞的發(fā)展可增殖成集落形成單位(包括集落形成單位-紅細(xì)胞(CFU-E)、母細(xì)胞形成單位-紅細(xì)胞(BFU-E)、集落形成單位-巨噬細(xì)胞(CFU-M)、集落形成單位-粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(CFU-GM)和集落形成單位-高增殖潛能(CFU-HPP))。集落形成細(xì)胞的鑒定表明，胚胎干細(xì)胞分化成造血細(xì)胞，在限定條件下能擴(kuò)大發(fā)展成確定的造血細(xì)胞譜系。
因此本發(fā)明的目的包括提供(a)上述獲得造血細(xì)胞的各種方法；(b)用這些方法衍生的各種細(xì)胞；和(c)將這些衍生的細(xì)胞用于移植、輸血和其它目的的各種方法。
在以下的優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的這些及其它一些目的和優(yōu)點(diǎn)就更加顯然。但為了對(duì)本發(fā)明更全面地進(jìn)行評(píng)價(jià)，就應(yīng)當(dāng)關(guān)注這些權(quán)利要求。
發(fā)明詳述胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)大部分試驗(yàn)都是用上述人ES細(xì)胞系H1，但以下的一些研究則是用上述ES細(xì)胞系H9(或H9.2)進(jìn)行的，得到的結(jié)果類似。從初始分離和傳代的細(xì)胞系衍生的細(xì)胞冷凍(液氮)原液取出這些細(xì)胞。在6孔培育板(Nunclon，F(xiàn)isher)上培養(yǎng)H1 ES細(xì)胞。
首先用0.1％明膠溶液(Sigma)覆蓋該培育板在37℃/5％ CO2培養(yǎng)箱中放置1天或多天。此后，除去明膠溶液，再用輻照過(guò)的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)覆蓋此培育板孔。這些MEF細(xì)胞是從12-13日胚齡小鼠胚胎(在由補(bǔ)充有10％胎牛血清(Hyclone或Harlan)、2mM 1-谷氨酰胺(GibcoBRL)和100單位/ml青霉素、100mg/ml鏈霉素(Sigma)的DMEM(GibcoBRL)構(gòu)成的培養(yǎng)基中)衍生的。
在接種培養(yǎng)孔之前，用銫源發(fā)出的5500cGy輻照MEF細(xì)胞。以5×104細(xì)胞/ml、2.5ml/孔的密度添加MEF。然后將涂敷有MEF的平板在37℃/5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天或多天，然后添加ES細(xì)胞。
以約5-8天的間隔將ES細(xì)胞在新MEF上傳代。時(shí)間間隔取決于細(xì)胞密度和分化的形態(tài)表現(xiàn)。在傳代時(shí)，除去ES細(xì)胞孔中的培養(yǎng)基，加入1-2ml含有1mg/ml膠原酶IV的DMEM(GibcoBRL)培養(yǎng)基。然后將此平板置于37℃/5％CO2中5-20分鐘，直到開始形成ES細(xì)胞的集落。
然后用5ml移液管刮取平板孔上的ES細(xì)胞。將收獲孔的內(nèi)含物置于15ml錐形管(Fisher)中，以1000rpm離心5分鐘。除去培養(yǎng)基，加入10ml新鮮培養(yǎng)基。ES細(xì)胞培養(yǎng)基由補(bǔ)充有20％血清替代物培養(yǎng)基(GibcoBRL)、8ng/mlbFGF(GibcoBRL)、1％非必要氨基酸溶液(GibcoBRL)、1mM 1-谷氨酰胺(GibcoBRL)和0.1M β-巰基乙醇的F12/DMEM(GibcoBRL)構(gòu)成。
再次離心細(xì)胞(5分鐘/1000rpm)，除去培養(yǎng)基，以每孔2.5ml培養(yǎng)基的濃度懸浮(通常將15ml培養(yǎng)基接種于6個(gè)新孔中，1∶6傳代)。然后用移液管將細(xì)胞移入上述用MEF覆蓋的平板孔中。將細(xì)胞均勻地分布在各孔中，將平板置于37℃/5％CO2的培養(yǎng)箱中。
如果在細(xì)胞傳代前就有表現(xiàn)分化形態(tài)的ES細(xì)胞集落，就用玻璃吸液管輕柔地將這些集落取出。操作是在解剖顯微鏡下觀察進(jìn)行的。除去已分化的細(xì)胞后，將剩下的集落進(jìn)行上述傳代。
傳代后，對(duì)各孔的ES細(xì)胞以24-48小時(shí)間隔補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。除去各孔的培養(yǎng)基，分別加入2.5ml新鮮的ES培養(yǎng)基。ES細(xì)胞的所有加料和傳代都是在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行的。
ES細(xì)胞的分化為了促進(jìn)人ES細(xì)胞向造血系分化，按以上所述的方法收獲ES細(xì)胞。然后將細(xì)胞接種于涂有哺乳動(dòng)物基質(zhì)細(xì)胞的6孔平板上。在一項(xiàng)試驗(yàn)中，我們采用上述經(jīng)2500cGy輻射過(guò)的C166細(xì)胞。C166細(xì)胞最初是從12日胚齡的小鼠胚胎卵黃囊獲得的，由Dr.Robert Auerbach(UW-Madison)惠贈(zèng)。
在另一試驗(yàn)中，是用S17細(xì)胞。它們最初是從小鼠骨髓得到的，由Dr.Kenneth Dorshkind (當(dāng)時(shí)在UC-Riverside，現(xiàn)在在UCLA)惠贈(zèng)。
以1×105個(gè)細(xì)胞/ml，2.5ml/孔的密度接種C166或S17細(xì)胞。然后讓接種S17或C166細(xì)胞的ES細(xì)胞，在補(bǔ)充有20％胎牛血清(Hyclone)、1％非必要氨基酸溶液、0.1M β-巰基乙醇和1mM 1-谷氨酰胺的DMEM(GibcoBRL)構(gòu)成的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。以24-72小時(shí)的間隔，將新鮮的這種培養(yǎng)基置于各孔中。對(duì)合適培養(yǎng)基的選擇而言，雖然補(bǔ)充有特定的基質(zhì)細(xì)胞，也只需要提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的常規(guī)條件。
在接種S17或C166細(xì)胞上的3-7天后，ES細(xì)胞開始表現(xiàn)出分化，它們沒(méi)有與在MEF喂養(yǎng)細(xì)胞上維持的未分化ES細(xì)胞相同均勻的外表。ES細(xì)胞的集落開始形成多種不同的細(xì)胞類型。這些集落中的一些區(qū)域表現(xiàn)為由卵石形態(tài)的細(xì)胞構(gòu)成，表明是早期祖代造血細(xì)胞。
與血液相關(guān)的細(xì)胞的確定一種確定有合適造血細(xì)胞存在與否的方法是在含有半固體甲基纖維素的培養(yǎng)基中分析造血集落形成細(xì)胞(CFC)。此時(shí)，讓ES細(xì)胞在C166或S17細(xì)胞上分化2-3星期(如上所述)。然后除去培養(yǎng)基，加入2.5ml無(wú)鈣和鎂的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，2-5分鐘后除去，加入1.5ml胰蛋白酶(0.125％)-EDTA(1mM)培養(yǎng)基。
將細(xì)胞置于37℃/5％CO2中10分鐘。此后，集落開始分離。用移液管吸取和刮擦孔進(jìn)一步將這些細(xì)胞分離。將這些細(xì)胞置于15ml錐形管中，在1000rpm離心5分鐘，除去培養(yǎng)基，加入10ml新鮮培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS+1-谷氨酰胺+青霉素/鏈霉素)，再次離心。然后將細(xì)胞懸浮于5ml培養(yǎng)基中，用100mMnytex過(guò)濾器過(guò)濾除去聚團(tuán)細(xì)胞。
另用5ml培養(yǎng)基洗滌此過(guò)濾器。然后將分離的/過(guò)濾的細(xì)胞在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)，并將1×106(通常，但不必總是如此多)細(xì)胞置于新的15ml錐形管中。然后將這些細(xì)胞離心，除去培養(yǎng)基，加入由IMDM(GibcoBRL)(補(bǔ)充有2％胎牛血清(Hyclone))構(gòu)成的培養(yǎng)基。將細(xì)胞離心，除去培養(yǎng)基再加入250μl培養(yǎng)基(IMDM+2％FBS)。
根據(jù)特定的測(cè)試條件，將這些細(xì)胞加入2.5mlMethocult GF+H4435培養(yǎng)基(StemCell Technologies)中。該培養(yǎng)基由1.0％甲基纖維素構(gòu)成，補(bǔ)充有30％FBS、20ng/ml IL-3、20ng/ml IL-6、50ng/ml干細(xì)胞因子、3單位/ml紅細(xì)胞生成素、20ng/ml GM-CSF、20ng/ml G-CSF、2mM 1-谷氨酰胺、0.1mM b-巰基乙醇、1％胎牛血清白蛋白。然后劇烈旋轉(zhuǎn)攪拌甲基纖維素中的細(xì)胞，然后將1.1ml此混合物接種于P35塑料皿(Stem Cell Technologies)上，在此皿上均勻涂布，并置于37℃/5％CO2中。
各樣品一式兩份按標(biāo)準(zhǔn)涂板，通常為4×105個(gè)細(xì)胞/平板。14-21天后，在顯微鏡下分析平板上造血集落的存在與否。通過(guò)與集落圖譜(StemCellTechnologies)或書(造血細(xì)胞的培養(yǎng)，RI Freshney，IB Pragnell，MG Freshney編輯，Wiley-Liss，Inc，1994)比較來(lái)鑒定集落。將集落鑒定為以下情況之一集落形成單位-紅細(xì)胞(CFU-E)、母細(xì)胞形成單位-紅細(xì)胞(BFU-E)、集落形成單位-巨噬細(xì)胞(CFU-M)、集落形成單位-粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(CFU-GM)或集落形成單位-高增殖潛能(CFU-HPP)。
也可用流式細(xì)胞術(shù)鑒定是否存在所選的造血細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)術(shù)可以尋找特定的細(xì)胞表面抗原。如上所述，用胰蛋白酶/EDTA收獲在S17細(xì)胞或C166細(xì)胞上分化14-21天的ES細(xì)胞(如上所述)，并通過(guò)100mM nytex濾器。在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)過(guò)濾的細(xì)胞，然后等份地加入15×75塑料管(Fisher)中，約1×105個(gè)細(xì)胞/管。然后離心細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，加入2-3mlFACS培養(yǎng)基。(FACS培養(yǎng)基為含有0.5％BSA(Sigma)、0.1％疊氮化鈉(Sigma)的PBS)。
再次離心細(xì)胞，并除去培養(yǎng)基。然后，以供應(yīng)商推薦的濃度在這些孔中加入與熒光標(biāo)記物(FITC或PE)直接連接的抗體。用以下抗體分析細(xì)胞CD34-FITC(Immunotech)、CD45-PE(Pharmingen)。將IgG1-FITC和IgG1-PE用作細(xì)胞非特異性染色的同型對(duì)照。在冰浴上用合適的抗體培養(yǎng)這些細(xì)胞約30分鐘，用2-3ml FACS培養(yǎng)基洗滌1-2次，然后懸浮于約0.5ml FACS培養(yǎng)基中。
然后按制造商說(shuō)明用FACScan(Becton Dickinson)分析標(biāo)記有抗體的細(xì)胞。加入二碘化丙錠(1mg/ml溶液，每管添加5μl)或7-AAD(Calbiochem)(0.2mg/ml，5μl/管)，來(lái)測(cè)定死細(xì)胞的存在。用PC Lysis或Cellquest軟件進(jìn)行分析。
用以下試驗(yàn)方法來(lái)分析由免疫組織化學(xué)(IHC)的抗原表達(dá)。此時(shí)，如上述用胰蛋白酶/EDTA收獲分化的與C166或S17(如上述)共培養(yǎng)的ES細(xì)胞。以約1×104-1×105濃度，將細(xì)胞懸浮于補(bǔ)充有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中。然后用Cytospin II離心機(jī)(Shanndon)將1×103-1×104個(gè)細(xì)胞離心到載玻片(Superfrost/plus，F(xiàn)isher)上，得到這些細(xì)胞的“Cytospin”制備物。
然后用冷丙酮固定這些載玻片，在-20℃冷凍保藏。載玻片經(jīng)室溫解凍后進(jìn)行IHC染色，用蠟筆(DAKO)勾畫出細(xì)胞團(tuán)。然后如下用Vectastain ABC試劑盒(Vector Laboratories，Burlingame，CA)將細(xì)胞染色，所有培養(yǎng)都是在室溫中進(jìn)行的。在細(xì)胞上加入100-200μl PBS，5分鐘后除去。然后在細(xì)胞上加入Vectastain封阻抗體溶液(馬血清)15分鐘。然后將這些細(xì)胞印吸干燥，加入100-200μl初級(jí)抗體溶液。初級(jí)抗體是IgGl(1μg/樣品，Sigma)，抗-CD34(0.5μg/樣品，Immunotech)、抗-CD45(1μg/樣品，DAKO)、抗-I類(1μg/樣品，Dr.Paul Leibson，Mayo Clinic饋贈(zèng))、抗-CD14(1μg/樣品，Pharmingen)、抗-CD31(1μg/樣品，Pharmingen)。
加入初級(jí)抗體30分鐘，然后加入PBS 10分鐘。隨后，加入經(jīng)生物素酰化的抗-IgG抗體(Vectastain試劑盒，溶液B)30分鐘，隨后加入PBS 10分鐘。室溫加入Vectastain ABC溶液30分鐘后，加入PBS10分鐘。然后加入DAB溶液(Vectastain)5分鐘，然后用自來(lái)水流沖洗10分鐘。在一些試驗(yàn)中，隨后用Gill蘇木精溶液(Vector labs)復(fù)染色這些載玻片3分鐘，再用自來(lái)水沖洗10分鐘。然后將這些載玻片風(fēng)干。陽(yáng)性細(xì)胞染色為褐色。
2-3周后，在混合的細(xì)胞群體中證明有CD34+(約1％)。更重要的是，當(dāng)收獲、分離細(xì)胞并接種于甲基纖維素(半-固體)培養(yǎng)物時(shí)，分化的ES細(xì)胞顯示生長(zhǎng)成造血集落。
移植目前造血細(xì)胞移植在臨床上主要用于已接受高劑量化療(治療惡性腫瘤)的患者。這些患者通常接受自身或異體來(lái)源的造血細(xì)胞的多相混合物。人ES衍生的造血干細(xì)胞則至少可提供更同質(zhì)性的細(xì)胞群體，用于造血細(xì)胞的移植。
另外，如上所述，如今可以控制移植的MHC特性，從而就有可能治療各種自體免疫疾病。例如，造血干細(xì)胞(HSCs)和次級(jí)譜系(如用于糖尿病的朗格罕氏體(pancreatic islet)或用于多發(fā)性硬化的少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)都可以從同一親代ES細(xì)胞系衍生。有了這兩種細(xì)胞譜系，就可通過(guò)完全同種異體的造血細(xì)胞移植(HCT)首先產(chǎn)生造血嵌合體。已建立的嵌合狀態(tài)可以讓接受者的免疫系統(tǒng)將以后移植的次級(jí)細(xì)胞類型(如朗格罕氏體或少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)“視為”“自身”的，而不會(huì)被排斥。
例如，從小鼠ES細(xì)胞已獲得少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(O.Brustle等人，285 Science754-6(1999))作為心肌細(xì)胞(M.Klug等人，98 J.Clin.Invest.216-224(1996))。
這種產(chǎn)生造血嵌合體的方法也能促進(jìn)對(duì)移植組織的接受(除自身免疫以外的原因)。此時(shí)，接受同種異體移植造血干細(xì)胞的小鼠不會(huì)排斥具有相同遺傳背景的其它組織(作為造血細(xì)胞)，但依舊排斥第三方的移植物。參見K.Gandy等人，65 Transplantation 295-304(1998)。
除動(dòng)物研究以外，現(xiàn)有一個(gè)臨床案例報(bào)道了先前接受造血細(xì)胞移植的患者后來(lái)需要實(shí)體器官(腎臟)移植。在這些情況中，由先前提供骨髓移植的同一人的腎臟移植，在免疫學(xué)上是可接受的，不會(huì)再發(fā)生免疫抑制作用，參見T.Spitzer等人，68 Transplantation 480-484(1999)。
對(duì)犬類模型進(jìn)行的研究和最近對(duì)人體作的一些臨床試驗(yàn)表明可用更溫和的不施行骨髓部分切除術(shù)(myeloablative)的條件療法(conditioning regimen)更好地讓宿主作好準(zhǔn)備以接受同種異體的HCT。此時(shí)，只有中等劑量的全身輻照和短程的免疫抑制可用于制備接受同種異體HCT的宿主。
雖然以上已描述了一些優(yōu)選的實(shí)施例，但本領(lǐng)域技術(shù)人員可以正確評(píng)價(jià)在本發(fā)明的范圍內(nèi)還可進(jìn)行其它一些改變。例如，雖選擇采用兩種特定基質(zhì)類型的細(xì)胞，但還有許多其它細(xì)胞也是適用的。例如，一種已公開可獲得的基質(zhì)細(xì)胞系是M2-10B4細(xì)胞系，其ATCC登錄號(hào)為CRL-1972。
另外，以上描述側(cè)重于產(chǎn)生紅細(xì)胞和骨髓的前體，但采用上述各種方法還可以批量獲得其它多種多樣的感興趣的與血液相關(guān)的細(xì)胞。參見美國(guó)專利No.5,914,268。因此，只有權(quán)利要求可以用來(lái)判斷本發(fā)明的范圍。
工業(yè)應(yīng)用本發(fā)明提供可用于移植、研究和其它目的的與血液相關(guān)的細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.一種獲得人造血細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的方法包括將人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物與哺乳動(dòng)物的造血基質(zhì)細(xì)胞接觸，從而制備人造血細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，至少部分用所述方法產(chǎn)生的人造血細(xì)胞是CD34+。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，至少有部分用所述方法產(chǎn)生的人造血細(xì)胞可在甲基纖維素培養(yǎng)物上形成造血細(xì)胞集落形成單位。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基質(zhì)細(xì)胞選自骨髓細(xì)胞和胚胎卵黃囊細(xì)胞。
5.一種獲得人造血細(xì)胞的方法，其特征在于，所述的方法包括體外將人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物與哺乳動(dòng)物基質(zhì)細(xì)胞接觸，從而產(chǎn)生人造血細(xì)胞，其中至少部分用所述方法產(chǎn)生的人造血細(xì)胞可在甲基纖維素培養(yǎng)物上形成紅細(xì)胞系母細(xì)胞形成單位。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，至少部分用所述方法產(chǎn)生的人造血細(xì)胞是CD34+。
7.一種將人細(xì)胞移植入人類受體宿主的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步驟獲得在體外從胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)物衍生的人造血細(xì)胞；獲得除造血細(xì)胞以外的所選人細(xì)胞，所選的非造血系細(xì)胞具有與造血細(xì)胞相容的主要組織相容性復(fù)合物；以及將造血細(xì)胞和所選的人非造血系細(xì)胞一起移植入人類宿主。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的所選人細(xì)胞是人朗格罕氏體。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的所選人細(xì)胞是人少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。
全文摘要
本文公開了用哺乳動(dòng)物基質(zhì)細(xì)胞從人胚胎干細(xì)胞獲得人造血細(xì)胞的方法。用本方法衍生的造血細(xì)胞可用于制備適于移植、輸血和其它目的的細(xì)胞培養(yǎng)物。
文檔編號(hào)A61K35/12GK1387565SQ00815326
公開日2002年12月25日 申請(qǐng)日期2000年8月25日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月8日
發(fā)明者D·S·考夫曼, J·A·湯姆森 申請(qǐng)人:威斯康星校友研究基金會(huì)