專利名稱：人nk/t細胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種細胞系，尤其涉及一株人NK/T細胞系ZQNK-29。
背景技術(shù)：
30年以前，科學家就發(fā)現(xiàn)白細胞里有自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)的存在，是機體重要的免疫細胞，由于NK細胞的殺傷活性無MHC限制，不依賴抗體，因此稱為自然殺傷活性。NK細胞不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。從那時開始，科學家們就研究自然殺傷細胞的具體功能，建立了自然殺傷細胞激活其他白細胞(如T淋巴細胞和巨噬細胞)以及針對各種感染激活免疫應(yīng)答的理論。

NK細胞一直被認為是機體殺死癌細胞和感染性病原的最佳武器，研究人員嘗試通過不同的途徑來提高NK的抗腫瘤作用，但是NK細胞的純化及體外大量擴增在技術(shù)上存在一定的難度，因此有許多人試圖建立NK細胞系用同種異體NK細胞進行腫瘤生物治療，國外科學家們相繼建立了永生化的NK細胞系HANK1、KHYG-I、NK-92、NKL、NK-Y、PLT-2、、M0TN、IMC-U SNK-6和SNT-8-1和YT、ΝΚ3. 3等，又采用IL-2基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立了 IL-2/NK-92、IL-2/NKL和IL-2/NK3. 3等轉(zhuǎn)基因NK細胞系。尤其是ΝΚ-92的建立，促進了其在腫瘤過繼免疫治療中的應(yīng)用研究，并為深入研究NK細胞的特征、功能，進一步揭示它在免疫系統(tǒng)中的確切作用，提供了有利的研究材料。中國專利200910077749. 5公開了一種自然殺傷細胞，該自然殺傷細胞為保藏編號為CGMCC NO. 2901的人自然殺傷細胞NKG細胞。本發(fā)明的NKG細胞對腫瘤細胞的殺傷力強，在體內(nèi)存活能力強，質(zhì)量穩(wěn)定，抗腫瘤反應(yīng)強。中國專利03152968. 2公開了一種白細胞介素-15基因修飾的自然殺傷細胞株，該細胞株表型為CD56強陽性，CD16和CD3均為陰性，其形態(tài)為分散的、半貼壁生長狀態(tài)。其制備方法是將IL-15的cDNA編碼區(qū)插入pcDNA3真核表達載體，構(gòu)建分泌型重組真核表達載體pcDNA3/IL-15 ;利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NK-92細胞；在篩選培養(yǎng)基中加入Geneticin (G418)進行篩選；有限稀釋克隆化細胞，以IL-15的依賴細胞株測定克隆細胞培養(yǎng)上清中IL-15的活性，從中挑選出表達IL-15的陽性細胞克?。粚⒃摽寺≡?0 100活性單位的IL-15的完全a -MEM培養(yǎng)基中進行擴增，得到具有臨床應(yīng)用價值的工程細胞株。中國專利申請201010507100. 5公開了人一種干擾素-alpha基因修飾的自然殺傷細胞株，是將人干擾素-alpha基因轉(zhuǎn)染入自然殺傷細胞株NKL細胞，構(gòu)建成的穩(wěn)定分泌、表達人干擾素-alpha的細胞株。該細胞株經(jīng)RT-PCR及ELISA檢測鑒定能夠在胞內(nèi)表達，并將合成的IFN-α分泌到胞外培養(yǎng)上清中。該細胞株能夠有效殺傷肝癌細胞，這種抗腫瘤效應(yīng)與NKL-IFNa細胞IFN-Y、Granzyme、TNF-a和Perforin基因和蛋白的表達水平提高相關(guān)，并且修飾后的NKL細胞株對外界刺激更加敏感。上述專利公開的NK細胞在抗腫瘤方面雖然取得了一定進展，但是由于NK細胞的純化及體外大量擴增在技術(shù)上存在一定的難度，而國內(nèi)僅見一株保藏編號為CGMCCNO. 2901的人自然殺傷細胞NKG細胞，未見有人NK/T細胞系建立的報道。因此，建立并提供更合適于國人的NK/T細胞系，對自然殺傷細胞的抗腫瘤的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究有其更重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株能長期在體外傳代培養(yǎng)，可以大量擴增的人NK/T細胞系。一株人NK/T細胞系，命名為人NK/T細胞系ZQNK-29，于2012年06月12日保藏在位于武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC N0:C201278。本發(fā)明人NK/T細胞系可長期傳代，大量擴增，并具有較強的抗腫瘤活性，為研究者深入開展自然殺傷細胞抗腫瘤作用機制及臨床過繼免疫治療提供新的實驗?zāi)Ｐ汀?br>

圖I為本發(fā)明ZQNK-29細胞系光鏡下活細胞形態(tài)(10 X )，細胞呈透亮圓形的淋巴細胞，生長旺盛。圖2本發(fā)明20^(-29細胞系!^染色后的細胞形態(tài)(40 X )，細胞呈圓形，核漿比例小，核仁較明顯，核膜清晰，核分裂像多見。圖3為本發(fā)明ZQNK-29細胞系透射電鏡下的細胞形態(tài)，細胞核大呈腎形核，細胞表面有微絨毛。圖4為本發(fā)明ZQNK-29細胞系掃描電鏡下的細胞形態(tài)，細胞表面有許多凸起。圖5為本發(fā)明ZQNK-29細胞系細胞周期分析結(jié)果。圖6為本發(fā)明ZQNK-29細胞系細胞生長曲線圖。圖7為本發(fā)明ZQNK-29細胞系染色體核型分布圖，染色體眾數(shù)46條，表現(xiàn)為2倍體細胞，但有部分異常核型。圖8為本發(fā)明ZQNK-29細胞，在體外抗5種腫瘤細胞的抑制曲線，(a)效靶比為25 1，(b)效靶比為 50 I。圖9為ZQNK-29細胞和人肺癌A549細胞接種裸鼠實驗圖，(a)ZQNK_29細胞接種裸鼠皮下第13天未見明顯腫塊；(b)ZQNK-29細胞接種裸鼠皮下第25天未見明顯腫塊；(c)人肺癌A549細胞接種裸鼠皮下第25天的腫塊；(d)人肺癌A549細胞接種裸鼠皮下第45天的腫塊；(e)人肺癌A549加ZQNK-29細胞7天可見腫塊；(f)人肺癌A549加ZQNK-29細胞15天后腫塊消失。
具體實施例方式( 一 ) ZQNK-29細胞系的建立I. I標本的來源取自一名患有鼻部血管中心性NK/T細胞淋巴瘤男性患者的外周血10ml，肝素抗凝。并經(jīng)患者同意、家屬知情。I. 2外周血單個核細胞的分離無菌抽取患者外周血10ml，其中2ml采取常規(guī)方法，用流式細胞儀進行了 T細胞免疫亞群測定，其結(jié)果為CD25 = 60%、CD19 = 1%、CD4 = 13%、CD8 = 3%、CD56 = 81%,⑶3 = 16%,⑶44 = 71%。剩下8ml外周血用等量的無菌Hank’ s溶液稀釋后混勻，用淋巴細胞分離液進行密度梯度離心，2000轉(zhuǎn)/分，20分鐘離心，室溫20度。吸取中界層面的單個核細胞，經(jīng)Hank’s液洗2遍，1500轉(zhuǎn)/分，10分鐘，室溫20度。加新鮮完全的1640培養(yǎng)液，將細胞懸液5ml分裝置30ml塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)，在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。I. 3細胞的分離純化細胞培養(yǎng)96小時后，鏡下觀察可見透亮而生長旺盛的淋巴細胞，用⑶56陰性免疫磁珠(Dynal Biotech ASA, Oslo, Norway)進行NK細胞分離純化,將純化后的細胞,加新鮮完全1640培養(yǎng)液混勻,傳代置30ml塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)，再用同樣的培養(yǎng)條件培養(yǎng)。1.4EBV細胞轉(zhuǎn)染 細胞培養(yǎng)72小時后，取出生長旺盛的淋巴細胞，將細胞傳代置24孔板中，每孔細胞中加EBV 2滴進行細胞轉(zhuǎn)染。在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，2天后取出24孔培養(yǎng)板在倒置顯微鏡下進行觀察，大部分孔內(nèi)細胞生長良好，可見細胞生長旺盛，細胞形態(tài)以透亮圓形、大小不等的淋巴細胞散在生長為主。一周以后，在鏡下觀察，可見其中有幾個孔內(nèi)細胞生長特別旺盛，有細胞重疊生長現(xiàn)象，周邊有許多透亮圓形、大小不等的淋巴細胞密集生長，有的凝聚成葡萄串樣生長。仔細挑選出幾個細胞生長特別旺盛的孔，將孔內(nèi)細胞輕輕吹打，將細胞傳代置30ml塑料瓶中培養(yǎng)，隨后細胞生長狀況好，且生長速率快，2-3天可以傳代一次，該細胞已連續(xù)穩(wěn)定生長2年以上，經(jīng)液氮凍存后復蘇，細胞狀態(tài)好，存活率達95%以上，將該細胞命名為ZQNK-29細胞系。該細胞系于2012年06月12日保藏在位于武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC N0:C201278。ZQNK-29細胞培養(yǎng)所用完全的1640培養(yǎng)液1640培養(yǎng)液(南美洲Hyclon產(chǎn)品)，內(nèi)含10%胎牛血清(南美洲Hyclon產(chǎn)品)、植物血凝素PHA(廣州市醫(yī)藥工業(yè)研究所)20ug/ml、rIL-II (北京四環(huán)生物制藥有限公司)800U/ml并加適量雙抗(南美洲Hyclon產(chǎn)品)。⑶56陰性免疫磁珠分選方法0)56細胞陰性免疫磁珠(Dynal Biotech ASA, Oslo,Norway)分選方法,得到純化的NK細胞，具體操作步驟如下I)取IOOul磁珠懸液，加lOOulHank’ s液，混勻置磁架上放置I分鐘，去上清，再加IOOul Hank，s液，混勻待用；2)收集離心后的細胞，制成約IX 108/100ul MNC，加40 ul熱滅活的胎牛血清；3)加40ul CD56抗體，混勻，2_8°C孵育20分鐘；4)加2ml Hank’s液清洗細胞，傾斜試管數(shù)次混勻混合物，4°C，300g,離心8分鐘，去上清液；5)加900ulHank’ s液，重新混勻細胞，加IOOul預(yù)洗過的磁珠，4°C孵育10分鐘，伴輕輕的傾斜和旋轉(zhuǎn)；6)用TIP頭輕輕的吹打5次重新混勻有磁珠結(jié)合的細胞，再加500ul Hank’ s液增加總體積，重新混勻有磁珠結(jié)合的細胞，置于磁架上2分鐘，移出上清置另一管磁珠中，新管里加有50ul預(yù)洗的磁珠；7)4°C孵育10分鐘，輕輕的傾斜和旋轉(zhuǎn)，置磁架上2分鐘，移出上清液，分裝到24孔培養(yǎng)板中，每孔加2ml培養(yǎng)液。
EBV制備的方法EBV液來自B958細胞株(上海細胞生物研究所提供)。提取時先復蘇并培養(yǎng)B958細胞，當細胞處于指數(shù)生長期時，收集全部細胞懸液，反復凍融3次，再轉(zhuǎn)移至離心管中，3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，將上清液用O. 22 μ m濾膜過濾后分裝，_80°C保存?zhèn)溆谩?二)細胞形態(tài)學的觀察2. I光鏡下的細胞形態(tài)學觀察2. I. I培養(yǎng)的活細胞形態(tài)取傳代培養(yǎng)的細胞，在光學顯微鏡下(日本Olympus MT_2倒置顯微鏡)觀察活細胞生長情況。圖I為第50代細胞光學形態(tài)圖片，可見細胞生長旺盛，背景清晰，雜質(zhì)少見，以透亮的中等大小的淋巴細胞為主，有的成單細胞生長，有的細胞相互凝集成大小不等 的細胞團樣生長，2-3天可以傳代。2. I. 2H. E染色后的細胞形態(tài)收集對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分，15分鐘的離心，去上清液，用沉淀細胞進行石蠟包膜，切片后H. E染色及光鏡觀察，如圖2所示，培養(yǎng)細胞大小一致，細胞核大，核仁較明顯，染色質(zhì)散在部分有凝聚，核膜清晰，較規(guī)則，部分見多核，并見較多核分裂像分別為多極核分裂像(Y型)。2. 2電鏡下的細胞形態(tài)學觀察2. 2. I透射電鏡下細胞形態(tài)的觀察收集對數(shù)生長期的細胞，Hank’s液洗二遍,最后一遍1500轉(zhuǎn)/分，離心7分鐘,棄去上清液，加入2. 5%的戊二醛，樣品在2. 5%的戊二醛溶液中4°C固定過夜，然后按下列步驟處理樣品(I)倒掉固定液，用O. 1M，pH7. O的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15min ；(2)用I %的鋨酸溶液固定樣品l_2h ；(3)倒掉固定液，用O. 1M，pH7. O的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15min ；(4)用梯度濃度(包括50%，70%，80%，90%和95%五種濃度)的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每種濃度處理15min，再用100%的乙醇處理一次，每次20min ;最后過度到純丙酮處理20min ；(5)用包埋劑與丙酮的混合液(V/V = 1/1)處理樣品Ih ；(6)用包埋劑與丙酮的混合液(V/V = 3/1)處理樣品3h ；(7)純包埋劑處理樣品過夜；將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋起來，70°C加熱過夜，即得到包埋好的樣品。樣品在Reichert超薄切片機中切片，獲得70_90nm的切片，該切片經(jīng)檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15min，即可在日本JEOL公司的JEM-1230型透射電鏡下觀察。透射電鏡下細胞形態(tài)觀察結(jié)果如圖3所示，超微結(jié)構(gòu)形態(tài)特征細胞呈圓形，中等大小，核較大，核漿比例小，核大多呈圓形或卵圓形，核膜完整，有的核膜有凹陷呈腎形核，或多個凹陷，有的核膜可見長短不一的凸起或多個凸起，一個或多個核仁清楚可見；核染色質(zhì)有的均勻分布，有的聚集濃密，分布不均，有的靠近核膜；核分裂較多見，細胞表面有較多突起、微絨毛豐富。如圖4所示，細胞內(nèi)各細胞器清楚，有較多的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、分泌顆粒，核漿和中間微絲也比較豐富，胞漿有大量游離核糖體，Go I gi體、胞內(nèi)微絲、分泌泡和致密顆粒，有核染色質(zhì)邊聚現(xiàn)象，有的可見線粒體腫大、密度降低、間隙加寬。2. 2. 2掃描電鏡下細胞形態(tài)觀察收集對數(shù)生長期的細胞，Hank’s液洗二遍，最后一遍1500轉(zhuǎn)/分，離心7分鐘，棄去上清液，加入2. 5%的戊二醛，樣品在2. 5%的戊二醛溶液中4°C固定過夜，然后按下列步驟處理樣品
(I)倒掉固定液，用O. 1M，pH7. O的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15分鐘；用I %的鋨酸溶液固定樣品l_2h ；(2)倒掉固定液，用O. 1M，pH7. O的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15分鐘；用梯度濃度(包括50%，70%，80%，90%和95%五種濃度)的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每種濃度處理15min，再用100%的乙醇處理兩次，每次20分鐘；(3)用乙醇與醋酸異戊酯的混合液(V/V = 1/1)處理樣品30min，再用純醋酸異戊酯處理樣品1-2小時；(4)臨界點干燥；(5)鍍膜，觀察。處理好的樣品在荷蘭Philips公司的XL30型環(huán)境掃描電鏡中觀察。如圖5所示，細胞呈圓形，細胞表面有大小不等的圓球狀凸起，有的細胞表面有叢狀或密集的短小微絨毛突起，有的細胞凝聚在一起生長，核分裂多見。(三)細胞倍體及細胞周期實驗取對數(shù)生長期的細胞，將細胞收集于IOml離心管中，1000轉(zhuǎn)/分，離心5min離心，棄去上清，制成lX105/ml細胞懸液,再用Hank’ s液清洗一遍,棄去上清,將離心沉淀的細胞在旋轉(zhuǎn)器上，邊旋轉(zhuǎn)，邊緩慢滴加75%的冷酒精2ml固定，放4°C冰箱過夜待測。取固定后的細胞IOOul于另一流式上樣管中，并加適量PBS液混勻，1000rpm/5min離心，去除酒精。再用PBS液清洗一遍，棄去上清，用CycleTESTPLUS DNA Reagent Kit (美國B. D公司產(chǎn)品)制備樣本加250ul A液(胰酶緩沖液)輕輕混勻室溫放置lOmin，再加200ul B液(胰酶和RNA酶抑制劑)輕輕混勻，室溫放置10分鐘，最后加200ul預(yù)冷C液(碘化丙酊)染色，避光冷藏10分鐘。FCM上樣測試。實驗經(jīng)3次重復，進行結(jié)果分析。結(jié)果ZQNK-29屬于二倍體細胞。66. 6%細胞處于Gl期(有絲分裂前期)，6. 46%細胞處于G2期(有絲分裂后期)，26. 94%細胞處于S期(DNA合成期)。(四)細胞生長曲線及細胞群體倍增時間的測定取對數(shù)生長期的傳代細胞，收集于IOml離心管中，1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄上清液，用Hank’ s液洗一次，1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘，棄上清液，加1640培養(yǎng)液，內(nèi)含10%胎牛血清，rIL-II (北京四環(huán)生物制藥有限公司)800 υ /ml,以及適量雙抗(南美洲Hyclon產(chǎn)品)。定量用臺盼蘭活細胞計數(shù)法計數(shù)，細胞總數(shù)為I. 1X107，用培養(yǎng)液加至22ml，制成5. O XlOVml的細胞懸液，取Iml細胞懸液于30ml培養(yǎng)瓶中，再加4ml新鮮培養(yǎng)液，共分裝22個培養(yǎng)瓶，置于37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時以后，每天取2瓶細胞，用臺盼蘭活細胞計數(shù)法計數(shù)，直至細胞數(shù)下降為止。細胞群體倍增時間(DT)計算公式DT(h) = tXlg2/ (LgNt-IgNo) t代表細胞處于對數(shù)生長期的培養(yǎng)時間，No及Nt分別代表對數(shù)生長期的起始和終止的細胞數(shù)。細胞群體倍增時間的結(jié)果表2-3-1 ZQNK-29細胞生長情況
權(quán)利要求
1.一株人NK/T細胞系，其特征在于，命名為人NK/T細胞系ZQNK-29，保藏編號為CCTCCNO C201278o
全文摘要
本發(fā)明公開了一株人NK/T細胞系，命名為人NK/T細胞系ZQNK-29，于2012年06月12日保藏在位于武漢大學的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC C201278。本發(fā)明人NK/T細胞系可長期傳代，大量擴增，并具有較強的抗腫瘤活性，為研究者深入開展自然殺傷細胞抗腫瘤作用機制及臨床過繼免疫治療提供新的實驗?zāi)Ｐ汀?br> 文檔編號C12R1/91GK102876632SQ20121039480
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者錢麗娟, 顧琳慧, 牟瀚舟, 凌志強, 馮建國, 杜靈彬, 凌雨田, 姜志明, 孫文勇, 孔祥鳴, 朱赤紅, 許沈華, 蘇丹, 毛偉敏 申請人:浙江省腫瘤醫(yī)院