專利名稱：PvARRP1蛋白及其編碼基因在砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及PvARRPI蛋白及其編碼基因在砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
砷是一種有毒的化學(xué)元素，其常見(jiàn)的存在形式為砷酸鹽[Arsenate, As (V)]或亞砷酸鹽[Arsenic, As (III)]。砷污染在國(guó)內(nèi)外都是一個(gè)非常突出的環(huán)境問(wèn)題，我國(guó)是世界上砷污染最嚴(yán)重的國(guó)家之一。人類(lèi)的經(jīng)濟(jì)活動(dòng)可以直接導(dǎo)致較為嚴(yán)重的砷污染，包括礦石的冶煉、煤的燃燒、礦渣的拋棄、制革廢物、染料生產(chǎn)、木材防腐、含砷農(nóng)藥、生化武器和殺蟲(chóng)劑的使用等。環(huán)境中的砷對(duì)人類(lèi)和動(dòng)植物都有很大的危害，可以通過(guò)呼吸道、食物或皮膚接觸進(jìn)入人體，目前砷污染已經(jīng)造成了全球很多地方與砷毒害相關(guān)的流行疾病。鑒于砷污染的嚴(yán)峻形勢(shì)，急需進(jìn) 行砷污染的治理工作。傳統(tǒng)的土壤砷污染治理方法費(fèi)用昂貴，并破壞土壤微生物和土壤結(jié)構(gòu)，其實(shí)用性較低。近年來(lái)，植物修復(fù)技術(shù)為土壤砷污染修復(fù)提供了新的途徑。植物修復(fù)是利用超富集植物吸收、積累環(huán)境中的污染物，并降低其毒害的生物技術(shù)。它具有傳統(tǒng)環(huán)境修復(fù)技術(shù)所不具備的優(yōu)點(diǎn)治理效果較好，成本較低，無(wú)二次污染，某些金屬元素甚至可回收利用等。植物修復(fù)的前提是發(fā)現(xiàn)或培育對(duì)重金屬具有抗性且在地上部分富集重金屬的植物種或基因型。植物修復(fù)的長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展依賴于超富集植物分子機(jī)制的闡明和通過(guò)基因工程手段培育具有砷積累能力的生長(zhǎng)較快，適應(yīng)性強(qiáng)，生物量大的工程植物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供PvARRPI蛋白及其編碼基因在砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將PvARRPI基因?qū)肽康闹参镏?，得到砷富集能力高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物；所述PvARRPI基因?yàn)榫幋aPvARRPI蛋白的基因；所述PvARRPI蛋白是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。所述PvARRPI基因具體可為如下(I)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子(I)序列表中序列2自5’末端第I至1137位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表中序列2所示的DNA分子；(3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累相關(guān)蛋白的DNA分子；(4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且植物砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累相關(guān)蛋白的DNA分子。
所述嚴(yán)格條件為在O. I XSSPE (或O. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。所述PvARRPI基因具體可通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中；所述重組表達(dá)載體為將所述PvARRPI基因?qū)雙SN1301質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。攜帶有所述基因的重組表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化所述生物的細(xì)胞或組織。所述目的植物可為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥，如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。所述砷的存在形式具體可為砷酸鹽(AsV)，所述砷酸鹽具體可為砷酸鈉。 所述“砷富集能力高于所述目的植物”具體可體現(xiàn)為在存在砷的環(huán)境中(特別是土壤環(huán)境)，所述植物的地上部分的總砷含量高于所述目的植物。本發(fā)明還保護(hù)一種治理存在砷污染的土壤的方法，包括如下步驟在所述存在砷污染的土壤上種植以上任一所述方法得到的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還保護(hù)所述PvARRPI蛋白或其編碼基因在植物砷富集和/或植物砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和/或植物砷積累中的應(yīng)用。所述植物可為雙子葉植物或單子葉植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥，如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。將本發(fā)明提供的PvARRPI蛋白的編碼基因?qū)胫参?，可以在土培條件下顯著提高植物地上部分砷的積累，并顯著增強(qiáng)植物對(duì)砷脅迫的抗性，本發(fā)明可用于培育具有砷抗性和砷積累能力的工程植株，并用于植物修復(fù)治理砷污染環(huán)境提供了途徑。


圖I為植株在含10mg/L砷酸鹽的土壤中培養(yǎng)70天后的表型。圖2為植株在含10mg/L砷酸鹽的土壤中培養(yǎng)90天后地上部分各組織中總砷含量的測(cè)定。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。實(shí)施例中所用到的砷酸鹽(AsV)均為砷酸鈉。蜈蟻草(Pteris vittata L.):公眾可以從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得；參考文獻(xiàn)Yang XX，Chen H, Dai XJ, Xu WZ, He ZY, Ma Μ. 2009. Evidence ofvacuoIarcompartmentalization of arsenic in the hyperaccumulator Pterisvittata. Chinese Science Bulletin 54(22):4229-4233.。pSN1301質(zhì)粒公眾可以從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得；參考文獻(xiàn)Guo J，DaiX，Xu Wj Ma Μ. 2008.Overexpressing GSHl and AsPCSl simultaneously increasesthetolerance and accumulation of cadmium and arsenic in Arabidopsis thaliana.Chemosphere 72(7):1020-1026.。農(nóng)桿菌菌株c58 :公眾可以從中國(guó)科學(xué)院植物研究所獲得；參考文獻(xiàn)LvS, WangH, Yu B, Meng W，Ca。S. 2012. Cloning of Arabidopsis HIS1-3 gene andconstructionof its expression vector. Journal of Hefei University of Technology.NaturalScience 35(1):120-123.。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col)購(gòu)自Arabidopsis Biological ResourceCenter (ABRC)。實(shí)施例I、PvARRPI蛋白及其編碼基因的發(fā)明蜈蟻草(Pteris vitata L.),屬于蕨類(lèi)植物鳳尾蕨科鳳尾蕨屬。
發(fā)明人從蜈蚣草中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)與砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和超積累相關(guān)的基因，命名為PvARRPI基因，其開(kāi)放閱讀框如序列表的序列2所示。PvARRPI基因編碼的蛋白命名為PvARRPI蛋白，PvARRPI蛋白的氨基酸序列如序列表的序列I所示。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因植物的獲得和鑒定一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建I、提取蜈蚣草葉片的總RNA。2、以步驟I提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。3、以步驟2得到的cDNA為模板，用PvARRP IS和PvARRP IA組成的弓丨物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PvARRPIS :5，-ATGGAGAACTCAAGCGCGGAGCGGA-3，；PvARRPIA :5’ -CTAAACAGAAGGCCCCTTCCTCTGA-3，。PCR 擴(kuò)增程序98°C 10s、55°C 30s、72°C 70s, 35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;10°C保存。4、以步驟3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，采用PvARRPlSl/PvARRPlAl組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。PvARRP ISI : 5，- |ACGGGGGACTCTAGAl ggatccATGGAGAACTCAAGCGCGGAGCGGA-3，；PvARRPIAl :5，_ ^GGAAATTCGAGCTC[ ggtaccCTAAACAGAAGGCCCCTTCCTCTGA-3’。方框標(biāo)記的序列為與pSN1301質(zhì)粒發(fā)生同源重組的序列，分別為針對(duì)pSN1301質(zhì)粒的BamHI酶切位點(diǎn)上游的部分序列的同源臂和針對(duì)pSN1301質(zhì)粒的KpnI酶切位點(diǎn)下游的部分序列的同源臂，所以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可以與pSN1301質(zhì)粒發(fā)生同源重組從而用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)之間的片段取代pSN1301質(zhì)粒的BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)之間的小片段。PCR擴(kuò)增程序同步驟3。5、用限制性內(nèi)切酶BamHI和KpnI雙酶切pSN1301質(zhì)粒，回收骨架載體(約13kb)。6、將步驟4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟5的載體骨架進(jìn)行重組連接(采用CloneEZ重組克隆試劑盒并按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，得到重組質(zhì)粒pSN1301-PvARRPl。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pSN1301-PvARRPl進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下將pSN1301質(zhì)粒BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)之間的小片段取代為了序列表的序列2所示的PvARRPI基因。二、轉(zhuǎn)基因植物的獲得I、將重組質(zhì)粒pSN1301-PvARRPl導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株c58，得到重組農(nóng)桿菌。
2、通過(guò)花浸泡法(Clough, S. J. , and Bent, A. F. (1998). Floral dip: asimplif iedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana. PlantJ 16, 735-743.)將重組農(nóng)桿菌導(dǎo)入哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，得到Tl代種子。3,Tl代種子收獲后在1/2GM固體無(wú)糖培養(yǎng)基(含20mg/L潮霉素)中篩選抗性植株，將抗性植株移栽到土中，收獲T2代種子并將其培育為植株(T2代植株)。分別取Tl代植株和T2代植株，先進(jìn)行⑶S染色鑒定。⑶S染色鑒定的方法待植株長(zhǎng)至6-8片真葉時(shí)，剪取葉片進(jìn)行GUS染色，呈現(xiàn)藍(lán)色的的葉片對(duì)應(yīng)的植株進(jìn)行分子鑒定。分子鑒定的方法提植株葉片的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用PvARRPIS和PvARRPlA組成的引物對(duì)對(duì)來(lái)自各個(gè)樣本的cDNA進(jìn)行PCR鑒定(靶序列為約I. Ikb的條帶)，PCR鑒定為陽(yáng)性的植株即轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)于某一 Tl代植株，如果其T2代植株均PCR鑒定為陽(yáng)性，則該植株為純合的轉(zhuǎn)基因植株，該植株及其后代即為I個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因株系。T2代轉(zhuǎn)基因植株自交產(chǎn)生T3代種子?！?br> 隨機(jī)選取兩個(gè)純合的轉(zhuǎn)基因植株株系(L9株系和Lll株系)的T3代種子進(jìn)行步驟四的鑒定。三、轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的獲得用pSN1301質(zhì)粒代替重組質(zhì)粒pSN1301_PvARRPl進(jìn)行步驟二的操作，得到轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株。四、轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株對(duì)砷的富集能力比較將L9株系的T3代種子、Lll株系的T3代種子、轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的T3代種子和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥分別進(jìn)行如下鑒定(每個(gè)株系取50粒種子進(jìn)行鑒定，進(jìn)行三次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果取平均值)將種子置于潮濕的濾紙上，4°C下保濕避光培2天；然后將種子播種在含10mg/L砷酸鹽的土壤中培養(yǎng)(每天光照16小時(shí)，黑暗8小時(shí))。I、表型觀察在土壤中培養(yǎng)70天的植株的照片見(jiàn)圖I。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株在含有AsV的環(huán)境中的生長(zhǎng)情況顯著優(yōu)于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。2、轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株對(duì)砷的富集能力比較取在土壤中培養(yǎng)90天的植株，分別取該植株的蓮座葉、莖桿和種子。將不同材料分別放入烘箱，80°C烘干6h，稱量干重。將稱量過(guò)的材料放入消煮管并加入I. 5ml混合酸[硝酸濃硫酸高氯酸=4:1:0. 5 (體積比)，均為優(yōu)級(jí)純]，冷消煮過(guò)夜(加入混合酸后室溫靜置稱為冷消煮)，然后250°C消煮4h，用蒸餾水定容至30ml，濾紙過(guò)濾后用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀 iCAP6300 (Thermo Electron corporation, USA)測(cè)定總砷含量。蓮座葉的總砷含量、莖桿的總砷含量和種子的總砷含量見(jiàn)圖2。轉(zhuǎn)空載體對(duì)照植株的蓮座葉的總砷含量、莖桿的總砷含量和種子的總砷含量均與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥一致。與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，在含10mg/L砷酸鹽(AsV)土培條件下培養(yǎng)90天，L9和Lll蓮座葉中總砷含量是哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的4倍左右，L9和Lll莖桿中總砷含量是哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的7倍左右，L9和Lll種子中總砷含量是哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的3倍左右。結(jié)果表明，PvARRPI蛋白及其編碼基因參與砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒，可以促進(jìn)植物中砷的積累，轉(zhuǎn)基因植株在含有砷酸鹽(AsV)的土壤環(huán)境中地上部分積累的總砷含量顯著高于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，從而可以作為砷富集植物用于土壤砷污染的治理 。
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將PvARRPI基因?qū)肽康闹参镏校玫缴楦患芰Ω哂谒瞿康闹参锏霓D(zhuǎn)基因植物；所述PvARRPI基因?yàn)榫幋aPvARRPI蛋白的基因； 所述PvARRPI蛋白是如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述PvARRPI基因?yàn)槿缦?I)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子 (1)序列表中序列2自5’末端第I至1137位核苷酸所示的DNA分子； (2)序列表中序列2所示的DNA分子； (3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累相關(guān)蛋白的DNA分子； (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且植物砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累相關(guān)蛋白的DNA分子。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PvARRPI基因通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物中；所述重組表達(dá)載體為將所述PvARRPI基因?qū)雙SN1301質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求I至3中任一所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
5.一種治理存在砷污染的土壤的方法，包括如下步驟在所述存在砷污染的土壤上種植權(quán)利要求I至4中任一所述方法得到的轉(zhuǎn)基因植物。
6.PvARRPI蛋白或其編碼基因在植物砷富集和/或植物砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和/或植物砷積累中的應(yīng)用； 所述PvARRPI蛋白是如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列I所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述編碼基因?yàn)槿缦?I)或(2)或(3)或(4)所述的DNA分子 (1)序列表中序列2自5’末端第I至1137位核苷酸所示的DNA分子； (2)序列表中序列2所示的DNA分子； (3)在嚴(yán)格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累相關(guān)蛋白的DNA分子； (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有90%以上同源性且植物砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累相關(guān)蛋白的DNA分子。
8.如權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為雙子葉植物或單子葉植物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了PvARRP1蛋白及其編碼基因在砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將編碼PvARRP1蛋白的基因?qū)肽康闹参镏校玫缴楦患芰Ω哂谒瞿康闹参锏霓D(zhuǎn)基因植物；所述PvARRP1蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物砷轉(zhuǎn)運(yùn)解毒和積累相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明對(duì)培育對(duì)砷具有高抗性和超積累能力的植株，以及用所述植物治理環(huán)境砷污染具有重大應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102899348SQ20121039404
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月17日
發(fā)明者徐文忠, 麻密, 陳焱山 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所