專利名稱：來自人胚胎干細(xì)胞的功能性心肌細(xì)胞的制作方法
相關(guān)申請的交叉引用本申請要求提交于2002年7月26日的美國臨時專利申請S.N.60/399,330的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
人胚胎干細(xì)胞是人細(xì)胞，可在體外穩(wěn)定地繁殖和培養(yǎng)，它們至少是多能的，并且可以是全能的。也就是說，所述細(xì)胞可以分化為多種不同的成熟分化的人體細(xì)胞類型，事實上，它可以分化為成年人體的所有細(xì)胞類型。人胚胎干細(xì)胞是由胚胎組織生成的，其后可在體外培養(yǎng)中連續(xù)培養(yǎng)。
在培養(yǎng)中，通過與某些因子共同培養(yǎng)，人胚胎干細(xì)胞常?？杀３忠环N不分化的狀態(tài)。特別地，將人胚胎干細(xì)胞在成纖維細(xì)胞滋養(yǎng)層上培養(yǎng)，或在來自成纖維細(xì)胞的因子存在下培養(yǎng)，可保持干細(xì)胞處于不分化的狀態(tài)。當(dāng)成纖維細(xì)胞或來自成纖維細(xì)胞的因子被移走后，人胚胎干細(xì)胞可以并將開始自發(fā)地分化為不同的組織類型。在干細(xì)胞自發(fā)分化為許多組織類型的過程中形成的中間體結(jié)構(gòu)中，有一種已知稱為胚狀體的結(jié)構(gòu)。胚狀體起始于胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)中所形成的聚集體。培養(yǎng)條件和細(xì)胞系性質(zhì)影響胚狀體的形成速率，在許多條件下，胚狀體將同時自發(fā)地出現(xiàn)并自發(fā)地開始分化為許多不同的組織類型。
已知胚狀體中存在將成為心肌細(xì)胞的組織類型。這些早期心肌細(xì)胞是人成熟心肌細(xì)胞的前體。成熟心肌細(xì)胞永久地從細(xì)胞周期退出并且不能再生。部分胚狀體有時顯示有規(guī)律的心跳樣收縮，這就證明了心肌細(xì)胞存在于由干細(xì)胞形成的胚狀體的細(xì)胞中。因此，先前已經(jīng)證明，人胚胎干細(xì)胞將分化為具有心肌細(xì)胞的一些功能性細(xì)胞。但所述心肌細(xì)胞確切采取什么形式，它們在分化中如何成熟是先前未知的。同時也未知存在于胚狀體中的心肌細(xì)胞的電學(xué)機制，以及所述來自干細(xì)胞的心肌細(xì)胞屬于何種行為分析類型。
附圖簡述

圖1是在形成自人胚胎干細(xì)胞的胚狀體中發(fā)生的機械收縮的振幅的圖形表示法，根據(jù)時間來測量，以確定收縮率以及收縮振幅，匯總在下面的實施例中。
圖2是在來源于人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞中觀察到的胚胎心室-型動作電位的圖形表示法。
圖3是在來源于人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞中觀察到的胚胎心房-型動作電位的圖形表示法。
圖4是在來源于人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞中觀察到的結(jié)節(jié)-型動作電位的圖形表示法。
圖5提供了下面實施例中提及的從ADP研究獲得的數(shù)據(jù)。
發(fā)明詳述這里第一次描述了來源于人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞是由胚狀體分化為所有的主要心肌細(xì)胞類型所形成，包括心室、心房和結(jié)節(jié)細(xì)胞。不是所有的胚狀體都包含心肌細(xì)胞，那些包含心肌細(xì)胞的胚狀體將自發(fā)地跳動。這里同時也公開了所述心肌細(xì)胞的跳動可以被調(diào)節(jié)和監(jiān)控，其便于對所述跳動的振幅進行分析，以檢測培養(yǎng)中的心臟細(xì)胞對特定的環(huán)境和條件變化的響應(yīng)能力。監(jiān)控胚狀體中特定細(xì)胞的電位，可揭示胚狀體中特定心肌細(xì)胞的性質(zhì)，并可用于測試所述細(xì)胞對外部刺激物的反應(yīng)，如對潛在的有毒劑或治療劑的反應(yīng)。特別地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以評估化學(xué)劑對于心臟細(xì)胞的HERG鉀通道的影響，從而可在體外測試藥物對于人心臟細(xì)胞的實際影響，該方式是迄今為止未發(fā)現(xiàn)的。
參照心臟細(xì)胞的動作電位，可最佳地定性其電活動。所述動作電位是一種跨膜電位，從心肌細(xì)胞的內(nèi)部跨越到環(huán)境，伴隨著時間進行測定。不同類型的成熟和原始心臟細(xì)胞的動作電位與其它類型是不同的。這里證實，可在由人胚胎干細(xì)胞形成的心肌細(xì)胞中觀察到所有三種主要類型的動作電位，包括結(jié)節(jié)樣、胚胎心房樣和胚胎心室樣動作電位。穿刺特定的跳動的產(chǎn)生物顯示記錄自細(xì)胞的、可再現(xiàn)的動作電位形態(tài)，表明每種產(chǎn)生物或胚狀體包含一種主導(dǎo)的細(xì)胞類型。
先前已經(jīng)證實，可以在形成自人胚胎干細(xì)胞的胚狀體中找到心肌細(xì)胞。人胚胎干細(xì)胞向體內(nèi)許多組織類型分化的最一般形式是通過已知被稱為胚狀體的形成來實現(xiàn)的，所述胚狀體這里稱為EBs。EBs是細(xì)胞的聚集體，其起始于在胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)的不規(guī)則的簇，在它們的結(jié)構(gòu)中開始顯示分化的組織類型。一些胚狀體將自發(fā)地跳動，表明心肌細(xì)胞-型行為的存在。先前對固定的細(xì)胞應(yīng)用免疫印跡技術(shù)研究顯示，在來自人胚胎干細(xì)胞的EBs中存在心臟-特異的蛋白。細(xì)胞聚集體電活動的細(xì)胞外記錄也支持在EBs中存在自發(fā)性電活動心臟細(xì)胞的觀點，但這些記錄不能提供EBs中存在的心肌細(xì)胞的類型信息，因為測量的電位是存在于細(xì)胞外電極區(qū)域中的許多細(xì)胞的平均數(shù)。有許多技術(shù)可引起胚狀體的形成，并且所述方法的應(yīng)用可引起更高或更低百分?jǐn)?shù)的胚狀體中包含心肌細(xì)胞，形成的心肌細(xì)胞的類型先前沒有定性過。因此，雖然先前已經(jīng)揭示心肌細(xì)胞在EBs中形成，但心肌細(xì)胞的類型、這些細(xì)胞的性能以及這些細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)電生理學(xué)記錄的易接近性是以前沒有證實的。這里描述了成熟的心肌的主要細(xì)胞類型，包括心室、心房和結(jié)節(jié)細(xì)胞，它們都可在形成自胚胎干細(xì)胞的胚狀體中找到。
來自人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞的培養(yǎng)使得對于人心臟細(xì)胞特性的研究可在體外進行。從最簡單的層面而言，可以在器皿或培養(yǎng)罐中培養(yǎng)一種包含心肌細(xì)胞的EB，觀察胚狀體的搏動或跳動。不是所有的胚狀體都將形成心肌細(xì)胞并顯示搏動或跳動行為，其中，在能夠有節(jié)奏搏動的胚狀體中可發(fā)現(xiàn)包含心肌細(xì)胞。從更專業(yè)的層面而言，下文將詳細(xì)描述，不同的胚胎心臟細(xì)胞類型可分別具有各自的動作電位，并且，對細(xì)胞進行不同的化學(xué)、電學(xué)或物理學(xué)擾動后，可觀察到動作電位的變化。
下面描述的實施例應(yīng)用來自人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞，所述胚胎干細(xì)胞生成胚狀體，保持培養(yǎng)40-95天。這個階段我們發(fā)現(xiàn)動作電位形態(tài)的多相性。當(dāng)觀察具有心房和心室肌細(xì)胞特點的動作電位時，相對正性的MDP(-50至-60mV)以及延遲的動作電位上升支(5-30伏/秒)與新生的和成熟的人心房和心室的心肌細(xì)胞有差異，后者具有-80mV的靜止膜電位以及150-350V/s.18的dV/dtmax。來自干細(xì)胞的心肌細(xì)胞很可能與描述在鼠干細(xì)胞系統(tǒng)中的“中間體”階段相關(guān)。描述人胚胎和嬰兒心臟中的動作電位的有限的可用數(shù)據(jù)證明，到發(fā)育7至8周時，心房和心室肌細(xì)胞的靜止膜電位以及dV/dtmax達(dá)到成熟細(xì)胞的程度。因此，我們將在本研究中觀察到的心房和心室動作電位稱為胚胎的，因為它們具有人胚胎發(fā)育前7周的動作電位的特性。觀察到的結(jié)節(jié)型動作電位被簡單描述為結(jié)節(jié)的，因為在發(fā)育過程中所述動作電位的形態(tài)幾乎沒有變化。這明顯地顯示，在體外，動作電位特點的發(fā)展與鼠系統(tǒng)相比，就如鼠和人相比具有明顯不同的妊娠階段。
假設(shè)由于胚狀體產(chǎn)生物的集合的酶分離已經(jīng)產(chǎn)生出不同的心肌細(xì)胞類型，每種產(chǎn)生物包含異源的心肌細(xì)胞混合物，其可能部分模仿發(fā)育的心臟中肌細(xì)胞的異源集合。然而，目前采用尖銳的微電極進行動作電位的細(xì)胞內(nèi)記錄，其是獨特的，對特定產(chǎn)生物進行重復(fù)的獨特的細(xì)胞內(nèi)測定，并且，我們發(fā)現(xiàn)，每種產(chǎn)生物由一種主導(dǎo)的細(xì)胞類型構(gòu)成。因此，我們假定，每種產(chǎn)生物相應(yīng)于其獨特的微環(huán)境，引起一種主導(dǎo)型心臟細(xì)胞的分化和增殖。
完整的心臟或某些心肌細(xì)胞類型特有的特性是具有天然的或自發(fā)的跳動率。造成跳動率的細(xì)胞有時稱為起搏細(xì)胞。存在于EBs中的心肌細(xì)胞顯示一種自發(fā)的跳動或收縮，以特定方式的活動(陣發(fā)或連續(xù)的)以及跳動頻率來描述。通過如前所述直接測定動作電位或通過測定細(xì)胞收縮的時間或振幅，可以描述藥物或其它干擾物對自發(fā)的跳動率和培養(yǎng)中的心肌細(xì)胞方式的影響?？梢灶A(yù)計，提高或降低EBs中跳動率的試劑對完整的人心臟具有相似的影響。同樣可預(yù)計，通過提高陣發(fā)性跳動中的暫停的持續(xù)時間來改變跳動方式的試劑具有在患者中產(chǎn)生心臟傳導(dǎo)阻斷的傾向。
在EBs中測試心肌細(xì)胞存在一個問題，自發(fā)的跳動率是可變的，依賴于不同的因子而不同。由于目標(biāo)是獲得可控的數(shù)據(jù)來證明外來底物對于EBs中心肌細(xì)胞的影響，獲得可控的動作基線的一種途徑是人工調(diào)節(jié)培養(yǎng)中的心肌細(xì)胞的跳動。這可以通過向EB施加一種電場刺激來進行?？梢宰詈唵蔚赝ㄟ^將電極施加于包含EB的培養(yǎng)容器的相對側(cè)來進行。如果在這些電極間施加周期性刺激電壓(如40伏特DC脈沖，在1赫茲下持續(xù)10微秒)，EBs將在電極刺激的頻率下顯示規(guī)則的搏動或跳動。作為該過程的一部分，有必要使EB培養(yǎng)保持恒定的溫度，因為溫度改變也能影響EB跳動的振幅。在所述跳動過程中可以光學(xué)掃描EBs，通過視頻顯微鏡，應(yīng)用影像處理來觀察EB，來確定在該EB中發(fā)生的跳動的振幅。然后可以用一種化學(xué)劑或其它刺激物來刺激EB，觀察所述刺激對于由EB產(chǎn)生的跳動的振幅造成的影響。在心臟細(xì)胞中，具有對抗所述電學(xué)裝置功能的試劑將降低所述跳動的振幅，具有促進所述電學(xué)裝置功能的試劑將提高所述跳動的振幅。并且，可以監(jiān)控所述跳動的其它特性，如收縮率和胚狀體的松弛性，獲得了另外的機制信息。
圖1中顯示了獲自所述研究的數(shù)據(jù)。在圖1中，將一種EB置于控制溫度的小培養(yǎng)容器中，在1赫茲電刺激，從而顯示搏動或跳動的基礎(chǔ)振幅，通過EB的邊緣的物理置換來進行光學(xué)判斷，所述振幅被任意地定義為具有控制的或基礎(chǔ)的水平100。然后，將一種刺激物，如一種測試化合物，加入到其中靜止有EB的培養(yǎng)基中，其可影響心臟細(xì)胞的電學(xué)和機械特性。在本研究中，化學(xué)刺激物或測試化合物加入1微摩爾異丙腎上腺素，其是一種已知的心臟細(xì)胞β-腎上腺素受體激動劑，其可使心臟收縮的速率和振幅提高。在成熟心臟細(xì)胞中，已知異丙腎上腺素是一種“對抗或逃逸”反應(yīng)的模擬物。因為EB的跳動率是由人工施加的場刺激的速率控制的，EB搏動的速率不會改變，但是如圖1所示，通過化學(xué)刺激物的應(yīng)用，EB的跳動或收縮的振幅戲劇性地提高了。這證明，通過應(yīng)用來自胚胎干細(xì)胞的EBs中的心肌細(xì)胞，可模仿化學(xué)劑對心臟收縮的影響。
也可以在一種EB中探測特定心肌細(xì)胞的電動作電位。這通過創(chuàng)建一種非常理想的微電極并將所述微電極直接置入EB來實現(xiàn)。盡管不可能通過微電極來選擇探測哪個細(xì)胞，但可能測量由電極感受到的電信號，并基于由細(xì)胞創(chuàng)建的電信號，確定所探測到的是哪種類型的心肌細(xì)胞。這是可能的，因為不同類型的心臟細(xì)胞具有獨特的電生理特性，這歸因于獨特類型的離子通道以及其它蛋白的表達(dá)。
因此，我們進行了一種嘗試，以定性在跳動的EBs中發(fā)生的細(xì)胞動作電位。這些研究在完整的EB產(chǎn)生物中進行，以避免在電學(xué)行為中可能的變更，所述變更可能起始于細(xì)胞分離或分離的心臟細(xì)胞的再涂板。由于所述嘗試的部分關(guān)注點是確定是否可從人胚胎干細(xì)胞獲得多樣類型的心肌細(xì)胞，該研究在EBs分化的40-95天的時間窗內(nèi)進行，該時間階段的選擇為分析獨特的細(xì)胞類型提供了足夠的時間。
圖2、3和4中顯示的是當(dāng)電極置入來自人胚胎干細(xì)胞的胚狀體中的不同細(xì)胞中時，從所述探測中獲得的電信號。在圖2中，檢測到胚胎心室細(xì)胞型的動作電位。波形顯示心室細(xì)胞的特性，其是通過由細(xì)胞產(chǎn)生的電位的振幅和形狀來確定的。在圖3中，顯示一種胚胎心房細(xì)胞型的動作電位。在圖4中，圖示顯示一種結(jié)節(jié)型的電學(xué)特性。這些信號(都來自EBs中的實際心肌細(xì)胞)對于心臟電生理領(lǐng)域中博知的人而言，是有細(xì)胞類型判斷價值的。這些動作電位證實，在體外培養(yǎng)的EB內(nèi)的心肌細(xì)胞中，存在三種主要的成熟心臟的細(xì)胞類型。同時，觀察到不同跳動的EBs對應(yīng)不同的主導(dǎo)細(xì)胞類型，并且可觀察到所有三種主要的細(xì)胞類型。
以前已經(jīng)提出，來自胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞對于有些方式的藥物篩選是有用的，特別是具有影響動作電位復(fù)極化(回復(fù)至基線)作用的潛在藥物。可延長復(fù)極化并因此提高動作電位時程的試劑，有引起藥物-誘導(dǎo)的長QT綜合征的可能性，這與潛在致死的心室心率失常相關(guān)。QT綜合征的名稱并非為一種縮寫，它是指動作電位圖表的兩點之間的時間間隔，任意地稱為Q和T。所述綜合征是多種類型的藥學(xué)試劑的主要毒性形式中的一種。調(diào)節(jié)許多離子通道可延長動作電位，在人類中，稱為HERG通道的鉀離子通道對于由藥物引起的阻塞是特別敏感的，引起動作電位以及體表心電圖上QT間隔的延長。目前沒有一種體外技術(shù)可用于在人心肌細(xì)胞中篩選動作電位延長和HERG通道阻塞。目前應(yīng)用于評估候選藥物的篩選方法是使用動物心臟細(xì)胞以及將HERG通道表達(dá)在非心臟細(xì)胞中，這些方法在許多情況下是失敗的。事實上，近期記載顯示，一些重要的藥物，特別是特非那定(Terfenadine，商品名SeldaneTM)和阿司咪唑(Astemizole，商品名HismanalTM)，它們由FDA批準(zhǔn)上市，但當(dāng)發(fā)現(xiàn)其對于人心臟細(xì)胞的HERG通道活性具有副作用后，又被從市場上取消，因為它們導(dǎo)致不常見但致死的心臟心率失常。在本發(fā)明之前，人ES來源的心肌細(xì)胞何時以及是否表達(dá)HERG通道基因是未知的。
本申請人已經(jīng)確定，可以測試出來自人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞對應(yīng)的HERG通道，它們與成人的成熟心臟細(xì)胞具有相同的反應(yīng)特性。圖5顯示的是在心房型細(xì)胞上進行的實驗，所述心房型細(xì)胞是EB中的心肌細(xì)胞?？申P(guān)注由所述細(xì)胞生成的電位的輪廓，在圖5中標(biāo)記為“基礎(chǔ)的”，其是胚胎心房型動作電位的特征。在觀察到基礎(chǔ)信號的培養(yǎng)中，加入500納摩爾E4031。E4031是一種已知高度特異的HERG通道阻滯劑，其能在人心臟細(xì)胞中阻滯快速延遲整合鉀電流(Ikr)。在培養(yǎng)EB的培養(yǎng)基中加入所述化學(xué)劑引起由心房型細(xì)胞產(chǎn)生的動作電位的改變，如圖5中標(biāo)記為“500nM E4031”的曲線所顯示。由于延遲回復(fù)到靜止?fàn)顟B(tài)，動作電位被延遲。這確證了已知的所述E4031分子對于人心臟細(xì)胞的影響，同時確證了對HERG通道阻滯所預(yù)言的影響。因此，所述試驗證明，通過測試來自培養(yǎng)中的人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞，可以測試分子對于成人心臟細(xì)胞中HERG通道的影響。
申請人已經(jīng)確定，EBs中的心肌細(xì)胞的電活動也可顯示稱為延遲后去極化(DADs)的電活動。所述電學(xué)特性被發(fā)現(xiàn)在患病的人心肌或用可引起鈣過量的試劑處理過的心肌中。這些DADs作為引起心率失常的基礎(chǔ)機制，包括一些形式的潛在致死性心室心動過速。EB具有證實DADs所需的復(fù)合的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的能力，這使它們可作為合適的模型，用于測試干擾(包括藥物)對于調(diào)節(jié)DAD形成的作用，并潛在地獲得新的用于心臟心率失常的藥理學(xué)治療法。
這里還提供了方法和材料以及一些實施例，描述對來自人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞所進行的工作。特別地，描述了可使大量來自由人胚胎干細(xì)胞生成的EB的心室、心房或結(jié)節(jié)型的細(xì)胞分離的技術(shù)。這使收集和培養(yǎng)大量的所述細(xì)胞，并用于藥物篩選或其他毒性測試成為可能。
實施例EB形成和心臟分化如前所述獲得和保持hES細(xì)胞系H1、H7、H9和H14。為了形成EB，用1mg/ml離散酶將ES細(xì)胞集落分散為包含約500-800個細(xì)胞的細(xì)胞聚集體。然后將細(xì)胞聚集體懸浮培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶(BD Bioscience)中，其中含有ES細(xì)胞培養(yǎng)基但不含基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長因子，每天更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)6天。為了促進心臟分化，將培養(yǎng)6天的EB轉(zhuǎn)移到包被有0.1％凝膠的6孔板上，其中的培養(yǎng)基由添加了15％FBS(為心臟分化選擇)、2mmol/L L-谷氨酸和1％非必需氨基酸的DMEM構(gòu)成。在分化過程中，培養(yǎng)基每天更換。在來自EB的產(chǎn)生物中，自發(fā)收縮細(xì)胞以簇的方式出現(xiàn)。在長期培養(yǎng)中保持這些跳動的EB，最多達(dá)95天。
免疫印跡用Pasteur吸液管分離跳動集中處，用0.05％的胰蛋白酶消化20分鐘，間歇進行震蕩。將細(xì)胞離心并重懸在包含20％FCS和0.5％雞胚胎抽提物(GIBCO/BRL)的DMEM培養(yǎng)基中，將細(xì)胞涂布到凝膠(0.3％)包被的蓋玻片上，在10％FCS培養(yǎng)基中培育2天。免疫印跡完成，如其它報導(dǎo)所描述的。
細(xì)胞內(nèi)電生理學(xué)在玻璃蓋玻片上培養(yǎng)一種單一跳動的、顯微解剖的EB產(chǎn)生物，培養(yǎng)1-10天。然后將蓋玻片粘附到安裝有倒置顯微鏡(Nikon Diaphot 200)的實驗箱的底部。所述EB用Tyrodes溶液灌注，該Tyrodes溶液由以下物質(zhì)組成(mmol/L)140NaCl，1MgCl2，10HEPES，10葡萄糖，1.8CaCl2，用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.4，溫度為37℃。應(yīng)用視頻邊緣檢測來測定收縮。為了進行細(xì)胞內(nèi)電生理實驗，制作尖銳的玻璃微電極，當(dāng)充滿3mol/L的KCl時電阻為30-100MΩ。用微電極穿刺自發(fā)性跳動的EB，并且吸液管的電容被置零。應(yīng)用橋模式(Bridge Mode)的Axoclamp-2A放大器(AxonInstruments，F(xiàn)oster City，CA)獲得細(xì)胞內(nèi)的膜電位記錄，并且在至少5分鐘內(nèi)顯示穩(wěn)定的最大心臟舒張電位(MDP)的記錄被用作數(shù)據(jù)分析。在一些實驗中，在1至3Hz的電場刺激下進行。數(shù)據(jù)在20kHz數(shù)字化處理，在2kHz過濾。應(yīng)用pClamp8.02(Axon Instruments，F(xiàn)oster City，CA)和Origin 6.0(Microcal Inc，Northampton，MA)軟件分析APs，來確定50％和90％復(fù)極化的AP時程(APDS0和APD90)、AP振幅(APA)、最大心臟舒張電位(MDP)、和最大AP上升速率(dV/dtmax)。
收縮測量應(yīng)用視頻邊緣檢測來測量收縮。將單一跳動的胚狀體(EB)產(chǎn)生物培養(yǎng)在玻璃蓋玻片上，粘附到安裝有倒置顯微鏡(Nikon Diaphot 200)的實驗箱的底部。所述制備物用Tyrodes溶液連續(xù)灌注，該Tyrodes溶液包含(mmol/L)140NaCl，1MgCl2，10HEPES，10葡萄糖，1.8CaCl2，用NaOH調(diào)節(jié)至pH7.4，如所指示加入附加藥物。將兩個白金電極分別置于200μl實驗箱(Warner Instrument Corp)的對側(cè)壁上，用Grass SD-9刺激器(Quincy，MA)進行電場刺激。刺激方案采用1至3Hz，10-ms持續(xù)時間，30至50V，溫度為37℃。用視頻邊緣檢測器VED 105(CrescentElectronics)、通過CCD BW照相機NL-2332(National Electronic)和Sony BW視頻監(jiān)視器PVM-97(Sony Corp)檢測獨特的EB的跳動。用pClamp8.2探測軟件、通過DigiData 1200A/D轉(zhuǎn)換器(均來自Axon Instruments，F(xiàn)oster City，CA)，在1kHz記錄到跳動的EB產(chǎn)生物的尖銳邊緣抽搐反應(yīng)。收縮反應(yīng)被正?；交A(chǔ)水平。通過雙自動溫度控制器TC-344B(Warner Instrument Corp)將實驗箱中的溫度控制在37±0.5℃。
在EB中的心臟分化我們最初的研究顯示，H1、H7、H9和H14 ES細(xì)胞系可以形成帶有自發(fā)性收縮產(chǎn)生物的EB。在分化約10天時觀察到跳動的EB，在30天后約10-25％的EB顯示自發(fā)的收縮。在每天溫和更換培養(yǎng)基以及低的EB密度條件下，EB在培養(yǎng)基中持續(xù)收縮，觀察到的持續(xù)時間最多達(dá)分化的95天。其余的實驗關(guān)注來自H9和H14細(xì)胞系的EB，從這兩種細(xì)胞系獲得的結(jié)果是無分別的。
進行免疫印跡來驗證跳動的EB產(chǎn)生物中CM的存在，并檢測收縮/肌節(jié)蛋白組織。消化跳動集中區(qū)，單層涂布，應(yīng)用抗α-輔肌動蛋白的抗體、肌節(jié)肌球蛋白(MHC)和心肌鈣蛋白I(cTn I)進行免疫印跡。置于蓋玻片上6-48小時后，從跳動的集中區(qū)分離到的細(xì)胞繼續(xù)開始自發(fā)的跳動。
用抗α-輔肌動蛋白抗體的印跡顯示不同的細(xì)胞質(zhì)方式，范圍從無組織的肌絲到有秩序的Z-線肌節(jié)肌絲。肌節(jié)MHC印跡顯示大量的信號，分布在整個細(xì)胞質(zhì)中，這是用所述抗體的典型的印跡方式。
在一些細(xì)胞中，CTn I的免疫印跡顯示有秩序的平行肌絲和帶條紋形式的I帶。這些觀察清楚地表明，心肌細(xì)胞存在于分化的EB中，并且一些CM顯示明顯的肌節(jié)組織。盡管細(xì)胞是來自跳動集中區(qū)的，核印跡顯示無CM，但缺少心臟特異的蛋白免疫印跡。從跳動集中區(qū)分離獲得的CM的百分?jǐn)?shù)具有很大的不同，從2％至70％不等。
對于β-腎上腺素刺激的正性肌力反應(yīng)對β-腎上腺素刺激作出反應(yīng)以增強心肌收縮需要適當(dāng)?shù)谋砻婺な荏w，偶聯(lián)到可刺激不同離子通道、膜轉(zhuǎn)運體和肌絲蛋白的信號通路上。然而，在發(fā)育過程中，β-腎上腺素刺激引起的心臟收縮反應(yīng)是變化的，最早期的胚胎心肌細(xì)胞對于β-腎上腺素激動劑是不反應(yīng)的。因此，我們嘗試檢測跳動的EB產(chǎn)生物對于β-腎上腺素激動劑異丙腎上腺素(Iso)的反應(yīng)，看其是否顯示收縮特性的變化。在電場刺激以控制跳動率過程中，應(yīng)用視頻邊緣檢測技術(shù)來測定EB產(chǎn)生物的收縮。每種受激的收縮對應(yīng)的產(chǎn)生物的邊緣的偏離量可用于收縮性的測量。圖2證實了在基礎(chǔ)條件下用1Hz刺激，然后用1μmol/L Iso超灌流后EB的收縮方式。觀察到收縮量有明顯的增強，1μmol/L Iso平均引起33±27％的收縮量增強(n＝5，p＝0.05)。所述測量顯示EB與EB之間明顯的可變性，部分是由于每種跳動的產(chǎn)生物的獨特和復(fù)雜的幾何條件。這些結(jié)果證實，β-腎上腺素受體存在于人胚胎干細(xì)胞-來源的心肌細(xì)胞，并且，刺激這些受體可產(chǎn)生正性肌力反應(yīng)。
自發(fā)電活動的方式對培養(yǎng)中跳動的EB的觀察顯示至少兩種不同方式的跳動，連續(xù)跳動或陣發(fā)跳動。為了進一步研究跳動方式，我們在20個自發(fā)性收縮EB中，用尖銳微電極測定了動作電位的細(xì)胞內(nèi)記錄。在12/20EB中發(fā)現(xiàn)有連續(xù)的電活動。連續(xù)電活動的EB具有自發(fā)的動作電位速率，其在整個過程中是相對恒定的，范圍在38和106bpm之間。在8/20EB中，觀察到陣發(fā)的電活動，明顯具有清晰的活動周期。每一次發(fā)生時，動作電位恢復(fù)到一個相對快速的速率然后逐漸變小，接著又伴隨著另一次的暫停。對于陣發(fā)活動，活動期和暫停的持續(xù)時間在EB與EB之間是不同的，并且每一EB的自發(fā)電活動和暫停的持續(xù)時間大體平行。
動作電位的多樣類型為了定性EB中的心肌細(xì)胞的類型，我們從20種不同EB的105個穩(wěn)定穿刺中檢測了動作電位的形態(tài)和特性。在我們研究的時間窗內(nèi)(40-95天)，在動作電位的形態(tài)學(xué)中具有清楚的多相性；然而，所述動作電位可分為3種主要類型結(jié)節(jié)樣的、胚胎心房樣的以及胚胎心室樣的(圖)。所述分類基于動作電位的特性，其通過動作電位的最大上升速度(dV/dtmax)、動作電位時程(APD)、動作電位振幅(APA)以及如表中概括的4期去極化化的突出性來測定。結(jié)節(jié)樣動作電位(圖)的特性為突出的4期去極化化、延遲上升支(dV/dtmax)以及較小的APA。胚胎心室-類似的動作電位存在明顯的動作電位穩(wěn)定期，引起與更趨于三角形的胚胎心房動作電位相比具有明顯較長的時程。并且，在40至95天中，通常EB在培養(yǎng)中保持的時間越長，胚胎心室-類似的動作電位呈現(xiàn)越慢的自發(fā)活動速率。
后面兩類的動作電位是關(guān)于胚胎的，因為它們具有更多的胚胎心臟記憶特性，其與新生的和成熟的心肌不同。特別地，所述胚胎動作電位具有更多去極化化的最大心臟舒張電位(MDP)和基于低dV/dtmax(約5-30伏/秒)的“延遲”型動作電位。
為了在給定的EB產(chǎn)生物中比較動作電位以及心臟細(xì)胞類型，我們制備了多種分離的穿刺物，每種產(chǎn)生物最多達(dá)14個分離的記錄。我們的結(jié)論是來自單一EB的多種細(xì)胞內(nèi)記錄具有主導(dǎo)的動作電位顯型。為了獲得定量的來自每種單一EB穿刺物的所有動作電位記錄的比較，我們對每種EB所測得的多個APD90按組劃分。通常，一種給定的EB的APD90非常接近，但在EB與EB之間顯示出可變性。這些結(jié)果證明，對于任何給定的跳動的EB產(chǎn)生物，自發(fā)分化偏向于一種主導(dǎo)的心肌細(xì)胞類型，基于觀察到的可再現(xiàn)的動作電位形態(tài)。
動作電位的速率調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的基本特性是具有適應(yīng)心率提高的能力，伴隨著APD的降低。心率調(diào)節(jié)存在于心房和心室肌肉中，并且在某些疾病狀態(tài)中其可被削弱。APD的縮短也在胚胎(7-12wk)人心室肌肉中觀察到。因而，我們嘗試去判斷胚胎心室樣的動作電位是否顯示適當(dāng)?shù)乃俾收{(diào)節(jié)。分離的EB產(chǎn)生物被施加三種不同速率下的電場刺激，然后記錄和分析平穩(wěn)狀態(tài)的動作電位。刺激頻率從1上升到2Hz引起APD50和APD90平均縮短約20％(圖5C)，當(dāng)升高到3Hz時APD又發(fā)生小的下降。然而，在所測試的不同刺激速率下，APA或動作電位的上升支沒有變化。這些結(jié)果證明，存在于跳動的EB的胚胎心室樣的心肌細(xì)胞具有必要的離子通道以及調(diào)節(jié)特性。在胚胎心房樣的肌細(xì)胞中我們也觀察到了相似的結(jié)果。
來源于人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞具有明顯的Ikr心臟動作電位的復(fù)極化歸因于多樣的離子電流，通過電壓門控K+通道發(fā)揮重要的作用；然而，K+通道的確切類型具有明顯的種類可變性。在人心臟中，通過HERG鉀通道(KCNH2)的電流Ikr在動作電位的復(fù)極化中發(fā)揮重要作用。HERG通道在藥物研發(fā)中也是重要的，因為它們代表了一種藥物阻滯的混雜的靶點，可導(dǎo)致動作電位延長以及潛在致死的心室心率失常尖端扭轉(zhuǎn)性室速。因此，我們應(yīng)用HERG特異的通道阻滯劑E-4031，檢測了Ikr對于人胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞中動作電位的復(fù)極化的影響。500nM的E-4031的應(yīng)用同時導(dǎo)致胚胎心房樣和胚胎心室樣心肌細(xì)胞中動作電位的延長。動作電位的延長對于末期復(fù)極化(3期)最明顯，其中HERG電流最大。在胚胎心房樣的心肌細(xì)胞中，APD90而非APD50被顯著延長；在胚胎心室樣心肌細(xì)胞中，APD90和APD50都被顯著延長，對于APD90影響更大。E-4031的APA或MDP沒有統(tǒng)計上明顯的影響。這些結(jié)果證明，HERG通道在胚胎心房樣的和胚胎心室樣的心肌細(xì)胞中都有表達(dá)，并且Ikr對于這兩種細(xì)胞類型中動作電位的復(fù)極化都有明顯作用。
觸發(fā)的早后去極化和遲后去極化某些類型的心臟心率失常的主要機制是觸發(fā)激動的，其由后去極化引起。這可以分為早后去極化(early after depolarization，EAD)，其在動作電位的復(fù)極化過程中發(fā)生；或遲后去極化(delayed after depolarization，DAD)，其在完全復(fù)極化后發(fā)生。EAD和DAD是由不同的細(xì)胞內(nèi)機制引起的，但它們都需要一種特異和復(fù)合形式的離子通道以及存在于心肌細(xì)胞的Ca2+周期蛋白。因此，我們檢測了胚胎心室樣的心肌細(xì)胞促進EAD和DAD的能力。EAD通常在延長的動作電位形成過程中出現(xiàn)。EAD被定義為在動作電位平穩(wěn)狀態(tài)附近發(fā)生的去極化作用，在3/5個由E-4031處理的胚胎心室樣CM中被觀察到。在E-4031不存在的狀況下從未觀察到過EAD。DAD通常在Ca2+過量的情況下出現(xiàn)，如由損傷或地高辛毒性引起。觀察到在少量細(xì)胞中，微電極穿刺之后即刻自發(fā)地出現(xiàn)DAD，可能是由于與穿刺相關(guān)的損傷以及相關(guān)的Ca2+過量有關(guān)。這些細(xì)胞不能用于動作電位特性的定性，但它們證實了人胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞顯示DAD的能力。
權(quán)利要求
1.一種用于測試試劑對人心臟細(xì)胞所產(chǎn)生的影響的方法，所述方法包含以下步驟培養(yǎng)來自人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞；測定至少一個心肌細(xì)胞的跨膜動作電位；將所述心肌細(xì)胞暴露于試劑；以及在接觸后觀察所述心肌細(xì)胞的動作電位是否變化。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述心肌細(xì)胞選自心房型、心室型和結(jié)節(jié)型心肌細(xì)胞。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述培養(yǎng)通過使人胚胎干細(xì)胞形成胚狀體來進行，且其中所述的測定包括用電極穿刺胚狀體。
4.一種用于測試試劑對人心臟細(xì)胞所產(chǎn)生的影響的方法，所述方法包含以下步驟培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞以形成胚狀體；鑒定培養(yǎng)中產(chǎn)生的物理收縮的胚狀體；測定所述胚狀體收縮的物理特性；將胚狀體暴露于試劑；以及觀察胚狀體收縮的特性的任何變化。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所測定的收縮的特性是收縮的物理量。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所測定的收縮的特性是收縮率。
7.一種用于測試試劑對人心臟細(xì)胞中HERG通道的電學(xué)特性的影響的方法，所述方法包含以下步驟培養(yǎng)來自人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞；將電極插入至少一個培養(yǎng)中的心肌細(xì)胞；測定所述心肌細(xì)胞的跨膜動作電位的時程；將心肌細(xì)胞暴露于試劑；以及觀察所述動作電位是否由試劑而變化，推測HERG通道是否改變。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述心肌細(xì)胞選自心房型、心室型和結(jié)節(jié)型心肌細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述培養(yǎng)通過使人胚胎干細(xì)胞形成胚狀體來進行，且其中所述的測定包括用電極穿刺胚狀體。
10.一種測試試劑在人心臟細(xì)胞發(fā)生極化作用后激發(fā)延遲的可能性的方法，所述方法包含以下步驟培養(yǎng)來自人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞；獲得心肌細(xì)胞跨膜動作電位與時間的圖表；將所述心肌細(xì)胞暴露于試劑；以及觀察在極化作用后是否由所述試劑激發(fā)了延遲。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述心肌細(xì)胞選自心房型、心室型和結(jié)節(jié)型心肌細(xì)胞。
12.權(quán)利要求10的方法，其中，所述培養(yǎng)通過使人胚胎干細(xì)胞形成胚狀體來進行，且其中所述的測定包括用電極穿刺胚狀體。
13.一種測試試劑在人心臟細(xì)胞中激發(fā)長QT綜合征的可能性的方法，所述方法包含以下步驟培養(yǎng)來自人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞；獲得心肌細(xì)胞跨膜動作電位與時間的圖表；將所述心肌細(xì)胞暴露于試劑；以及觀察在任何心肌細(xì)胞中是否由試劑激發(fā)了長QT綜合征。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述心肌細(xì)胞選自心房型、心室型和結(jié)節(jié)型心肌細(xì)胞。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述培養(yǎng)通過使人胚胎干細(xì)胞形成胚狀體來進行，且其中所述的測定包括用電極穿刺胚狀體。
全文摘要
人胚胎干細(xì)胞可形成胚狀體，所述胚狀體包含分化的人細(xì)胞。胚狀體中的一些人細(xì)胞可分化為心肌細(xì)胞。這里描述了所述心肌細(xì)胞的生物學(xué)和電學(xué)特性，并涉及將來自人胚胎干細(xì)胞的心肌細(xì)胞應(yīng)用于藥物篩選方案以研究心臟毒性機制。
文檔編號C12N5/08GK1671860SQ03817903
公開日2005年9月21日 申請日期2003年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月26日
發(fā)明者J·A·湯姆森, T·J·坎普, Y·馬, J·－Q·何 申請人:威斯康星校友研究基金會