專利名稱：糖化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備標(biāo)準(zhǔn)高質(zhì)量的麥芽汁和制備同樣高質(zhì)量啤酒的經(jīng)改進(jìn)的糖化方法。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)的啤酒僅由大麥芽、啤酒花和水釀造而成。在許多國(guó)家，大麥芽依然是制備啤酒必不可少的。然而，通常部分大麥芽被輔料(adjunct)代替，所述輔料諸如玉米(corn)、稻(rice)、高粱(sorghum)、小麥(wheat)、精制淀粉，或者諸如糖或糖漿的易于發(fā)酵的碳水化合物。使用這些輔料主要是因?yàn)樗鼈兲峁┨妓衔锏某杀颈葟拇篼溠恐蝎@取要低。由于這些輔料沒(méi)有或者沒(méi)有足夠酶活性來(lái)使淀粉轉(zhuǎn)變成可發(fā)酵糖，所以大麥芽必須包含足夠的內(nèi)源性酶活性，以使大麥芽和輔料分解成為可發(fā)酵糖和游離氨基酸作為酵母菌的營(yíng)養(yǎng)。因此，在常規(guī)的糖化方法中，所產(chǎn)生的麥芽汁的質(zhì)量取決于所使用的大麥芽的酶活。但是，如果提供一種制備高質(zhì)量麥芽汁和啤酒的糖化方法，其中所述質(zhì)量不受大麥芽?jī)?nèi)源性酶活性的影響，那么在啤酒的制造中就可以使用更多種標(biāo)準(zhǔn)的大麥芽。本發(fā)明的目的即提供這樣的方法。
發(fā)明概要本發(fā)明的第一方面提供了一種制備麥芽汁的方法，包括，形成一種醪液，它包含5％到100％的大麥芽，在形成所述醪液之前、中間或者之后添加蛋白酶(E.C.3.4.)和纖維素酶(EC3.2.1.4)，在醪液形成15分鐘內(nèi)使初始溫育溫度達(dá)到至少70℃，接著，在至少70℃的溫度保溫所述醪液足夠的時(shí)間，以達(dá)到80％的提取回收率，然后從酒糟中分離麥芽汁。
本發(fā)明的第二方面提供了一種制備啤酒的方法，包括，獲得第一方面的麥芽汁，用酵母發(fā)酵上述麥芽汁，以及獲得啤酒。
本發(fā)明的第三方面提供了一種制備啤酒的方法，包括，獲得第一方面的麥芽汁，將上述麥芽汁同第二種麥芽汁混合，用酵母發(fā)酵混合的麥芽汁，獲得啤酒。
本發(fā)明的第四方面提供了一種制備啤酒的方法，包括，獲得第一方面的麥芽汁，用酵母發(fā)酵上述麥芽汁，將上述發(fā)酵了的麥芽汁同第二種發(fā)酵了的麥芽汁與混合，并獲得啤酒。
本發(fā)明的第五方面和第六方面分別提供由本發(fā)明的方法制得的麥芽汁和啤酒。
發(fā)明的詳細(xì)描述本領(lǐng)域眾所周知啤酒的釀造方法，其一般包括以下幾個(gè)步驟麥粒發(fā)芽(malting)、糖化(mashing)和發(fā)酵(fermentation)。在傳統(tǒng)釀造方法中，麥粒發(fā)芽的目的是將不能溶解的淀粉轉(zhuǎn)化為可溶解的淀粉，減少?gòu)?fù)合物蛋白質(zhì)，產(chǎn)生帶有顏色和口味(flavor)的化合物，為產(chǎn)生酵母菌發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)，以及酶的出現(xiàn)。麥粒發(fā)芽的三個(gè)主要步驟是浸漬(steeping)、發(fā)芽(germination)和焙烤(kilning)。
浸漬包括用將大麥粒與水混合，提高濕潤(rùn)程度，激活休眠麥粒的新陳代謝過(guò)程。在接下來(lái)的步驟中，濕潤(rùn)的大麥保持在適宜的溫度和濕度條件下發(fā)芽，直到例如淀粉分解和酶活化等適當(dāng)?shù)男揎棸l(fā)生。最后的步驟是在干燥爐中干燥綠麥芽。干燥爐中的溫度情況決定大麥芽的顏色和保存下來(lái)用在糖化過(guò)程中的酶量。在有必要保持酶活性時(shí)，低溫干燥更適合麥芽。高溫焙燒的麥芽將沒(méi)有或者只有很低的酶活性，卻含很多產(chǎn)色化合物如焦糖和產(chǎn)味化合物。
糖化是將淀粉從粉碎的大麥芽和固體輔料轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵的和不可發(fā)酵的糖，從而產(chǎn)生具有所需組成的麥芽汁的過(guò)程。傳統(tǒng)的糖化涉及以一定溫度和容積，將水與粉碎的大麥芽和輔料混合，以繼續(xù)在糖化過(guò)程中開(kāi)始的生化變化。為了活化負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)和碳水化合物分解的內(nèi)源性酶，糖化過(guò)程在一段時(shí)間內(nèi)在各種溫度進(jìn)行。到目前為止，在糖化過(guò)程中最重要的變化是淀粉分子轉(zhuǎn)變?yōu)榭砂l(fā)酵糖。在傳統(tǒng)糖化方法中，負(fù)責(zé)淀粉轉(zhuǎn)化的主要酶是α和β-淀粉酶。α-淀粉酶通過(guò)將淀粉分子分裂為許多能夠被β-淀粉酶攻擊的短鏈，而迅速減少不溶和可溶的淀粉。
傳統(tǒng)的糖化方法是浸漬(infusion)方法，其中啤酒制造商可以在單一糖化溫度制備并回收麥芽汁。這常與愛(ài)兒啤酒和濃烈黑啤酒的制備有關(guān)，并且許多大型啤酒制造商都成功地使用了這種方法。傳統(tǒng)地，陳貯啤酒(lagerbeer)通常是用“分步浸漬法(step-infusion)”釀造的。該糖化過(guò)程包括在不同溫度下的一系列的靜置(rest)，每次靜置都有利于一種必要內(nèi)源性酶的活性。當(dāng)今，雙醪液浸漬系統(tǒng)(double-mash infusion system)是工業(yè)制備啤酒尤其是陳貯啤酒，所最廣泛使用的系統(tǒng)。該系統(tǒng)制備兩種分離的醪液。它利用用于煮沸輔料的谷物煮機(jī)(cereal cooker)，以及用于良好修飾的、高度酶活性的麥芽的醪液發(fā)酵桶(mash tun)。由于傳統(tǒng)的糖化方法利用大麥芽的內(nèi)源性酶，因此溫度控制在70℃以下，否則酶會(huì)失活。
在糖化以后，當(dāng)所有的淀粉都被分解以后，就需要將液體提取物(麥芽汁)從固體(酒糟)中分離。麥芽汁的分離很重要，因?yàn)楣腆w包含大量的蛋白質(zhì)、修飾不充分的淀粉、脂肪物質(zhì)、硅酸鹽(酯)和多酚(鞣酸)。分離麥芽汁的目的包括產(chǎn)生澄清的麥芽汁獲得良好的提取回收率，以及在可以接受的循環(huán)時(shí)間內(nèi)操作麥芽汁的澄清度、提取回收率以及整個(gè)循環(huán)時(shí)間在很大程度上受谷物的標(biāo)準(zhǔn)的影響，例如大麥芽和輔料種類，以及所應(yīng)用的糖化方法。
在把麥芽汁從酒糟中分離之后，麥芽汁就可以用于啤酒酵母(brewersyeast)發(fā)酵制備啤酒了。
如需常規(guī)釀造過(guò)程的其它資料可以查閱柏林發(fā)酵和生物技術(shù)研究所(VLB)的沃爾夫?qū)だ?Wolfgang Kunze)所著的《釀造和麥粒發(fā)芽方法)》，1999年第二修訂版，ISBN 3-921690-39-0(″Technology Brewing and Malting″，Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute of Brewing，Berlin(VLB)，2nd revised Edition 1999，ISBN 3-921690-39-0)。
本發(fā)明提供使用在常規(guī)糖化方法中得不到質(zhì)量合格產(chǎn)品這一標(biāo)準(zhǔn)的大麥芽，來(lái)制備高質(zhì)量麥芽汁和高質(zhì)量啤酒的方法。在本發(fā)明方法中應(yīng)用高溫保證了大麥芽或輔料中的多種內(nèi)源性酶的活性被顯著降低甚至除去。因此，在70℃到78℃的溫度區(qū)間內(nèi)，只有大麥芽α和β-淀粉酶有明顯活性，在78℃以上的溫度，內(nèi)源性酶的活性可以忽略。在本發(fā)明的糖化方法中，加入的酶將構(gòu)成大部分或全部酶活性。大麥芽的內(nèi)源性酶，包括不需要的活性例如脂氧合酶，將在本發(fā)明中的高溫步驟中被除去。而大麥芽的積極性質(zhì)，例如顏色和口味成分以及蛋白質(zhì)成分，都被保留下來(lái)。熱穩(wěn)定性酶的標(biāo)準(zhǔn)化混合物的應(yīng)用確保了高提取量，蛋白酶活性的完全控制可以達(dá)到最佳的泡沫穩(wěn)定性，而且含非常少量的β-葡聚糖成分可以促進(jìn)麥芽汁的分離，從而即使用含較高百分比的未發(fā)芽大麥或修飾不完全的(undermodified)大麥也可縮短循環(huán)時(shí)間。本發(fā)明還提供允許制備其中的反式-2-壬烯醛(trans-2-nonenal)(T2N)和/或二甲硫(DMS)的量降低的麥芽汁和/或啤酒的方法，這兩種化合物與制造啤酒中出現(xiàn)的兩種主要異味相關(guān)。
不受理論限制，有人認(rèn)為T(mén)2N的減少是由于在70℃以上時(shí)麥芽脂氧合酶和過(guò)氧化物酶失活。在常規(guī)方法中應(yīng)用這樣的溫度是不可行的，因?yàn)樵诟邷靥腔^(guò)程中所需的內(nèi)源性酶將失活。
從公開(kāi)內(nèi)容可見(jiàn)，本發(fā)明提供一種獨(dú)特的可能性來(lái)在統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的麥芽汁質(zhì)量方面控制糖化過(guò)程，進(jìn)而產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量的啤酒。
定義在本說(shuō)明書(shū)中，所使用的各個(gè)術(shù)語(yǔ)是該領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員都能夠理解的。但數(shù)個(gè)的術(shù)語(yǔ)有其獨(dú)特的意思，其定義如下。
在這里所使用的術(shù)語(yǔ)“谷物(grist)”，是指含有制造啤酒所需含淀粉或糖的物質(zhì)，例如，大麥芽和輔料。
術(shù)語(yǔ)“麥芽(malt)”，是指任何發(fā)芽的谷物，尤其是大麥。
術(shù)語(yǔ)“輔料(adjunct)”，是指非大麥芽的谷物部分。輔料可以是任何富含淀粉的植物原料。
術(shù)語(yǔ)“醪液(mash)”，是指淀粉漿，其包含搗碎的大麥芽、其它含淀粉的原料或其組合物，所述淀粉漿浸漬在水中以制備麥芽汁。
術(shù)語(yǔ)“麥芽汁(wort)”，是指在糖化過(guò)程中從谷物中提取的未發(fā)酵的液體。
術(shù)語(yǔ)“酒糟(spent grains)”，是指谷物經(jīng)提取，并分離麥芽汁以后的瀝干的固體殘留物。
術(shù)語(yǔ)“啤酒”，在這里是指發(fā)酵的麥芽汁，例如，由大麥芽、以及任意的輔料和啤酒花釀造的酒精飲料。
術(shù)語(yǔ)“糊化溫度(gelatinization temperature)”，是指淀粉開(kāi)始糊化的溫度。淀粉在60℃到70℃之間開(kāi)始糊化，提取溫度取決于淀粉的具體種類。
術(shù)語(yǔ)在麥芽汁中的“提取回收率(extract recovery)”，是指從谷物(麥芽和輔料)中提取到的可溶解物質(zhì)的總數(shù)，表達(dá)為基于干物質(zhì)的百分比。
術(shù)語(yǔ)“溫育(incubatinon)”，是指方法中從達(dá)到初始溫育溫度一直持續(xù)直到溫度降低到終溫育溫度以下的部分。所述溫育可以包含在不同溫度的一個(gè)或者多個(gè)步驟，所有溫度均至少為70℃。
術(shù)語(yǔ)“初始溫育溫度”，是指所述溫育初始部分過(guò)程中的溫度狀態(tài)。
術(shù)語(yǔ)“終溫育溫度”，是指所述溫育最后部分過(guò)程中的溫度狀態(tài)。
術(shù)語(yǔ)“熱穩(wěn)定性酶”，是指在本發(fā)明方法流程所用的溫度狀態(tài)和溫育過(guò)程中所添加的酶，所述酶的量能夠充分分解目的底物。
術(shù)語(yǔ)“麥芽糖生成酶”，指的是一種外部作用酶，它催化線性淀粉α-1-4連接的分裂，并限制糊精產(chǎn)生麥芽糖。麥芽糖生成酶的實(shí)例是β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)和產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)。
反式-2-壬烯醇(T2N)發(fā)出不新鮮的異味，稱為紙板味。T2N是一種氧化產(chǎn)品，是通過(guò)脂類的自動(dòng)氧化(autooxidation)和/或酶催化氧化產(chǎn)生的。T2N的水平既受原材料的影響也受到糖化方法的影響。含低水平前體和低水平脂氧合酶的大麥品種受到關(guān)注。此外，已知最終產(chǎn)品中的低PH值有利于T2N的生成，而SO2量的增加則減少T2N的生成。
二甲硫(DMS)是最重要的硫味化合物，也是啤酒中的一種比較討厭的味道。從煮玉米到煮蔬菜、尤其是煮玉米、芹菜、卷心菜或歐洲防風(fēng)草(parsnip)，甚至大蒜，所發(fā)出的這種氣味強(qiáng)度不同。在極端的情況下，它還可能讓人感覺(jué)聞到了貝類或者煮蝦水的味道。DMS通常是由S-甲基蛋氨酸(SMM)轉(zhuǎn)變而來(lái)的。DMPS(P)代表著DMS前體的水平，例如S-甲基蛋氨酸(SMM)和二甲基亞砜(DMSO)。
在本文中術(shù)語(yǔ)“同源性”用于多肽或者DNA序列時(shí)，是指兩個(gè)序列的同源程度，表明第一個(gè)序列與第二個(gè)序列之間的差異。同源性可以用本領(lǐng)域已知的計(jì)算機(jī)程序適當(dāng)確定，所述程序如GCG程序包中提供的GAP(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Ge-neticsComputer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-453)。使用以下設(shè)置用于對(duì)比多肽序列缺口產(chǎn)生罰分(GAP creationpenalty)為3.0和缺口延伸罰分(GAP extension penalty)為0.1。
與本發(fā)明第一部分對(duì)應(yīng)，含淀粉漿液即醪液是通過(guò)將谷物與水混合獲得的，所述谷物包含至少5％，或優(yōu)選至少10％，或更優(yōu)選至少15％，甚至更優(yōu)選至少25％，或最優(yōu)選至少35％，例如至少50％，至少75％，至少90％，甚至100％(谷物w/w)的大麥芽。優(yōu)選至少5％，或優(yōu)選至少10％，更優(yōu)選至少20％，甚至更優(yōu)選至少50％，至少75％，甚至100％的大麥芽是修飾良好(well-modified)的大麥芽。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，所述谷物包含除大麥芽以外的其它發(fā)芽谷物，使得至少10％，至少25％，優(yōu)選至少35％，更優(yōu)選至少50％，甚至更優(yōu)選至少75％，最優(yōu)選至少90％(w/w)的谷物是其它發(fā)芽的谷物而不是大麥芽。
在形成醪液之前，發(fā)芽的和/或沒(méi)發(fā)芽的谷物優(yōu)選被粉碎，并最優(yōu)選干燥粉碎。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在形成醪液前從已發(fā)芽的和/或未發(fā)芽的谷物去除外殼。可包含75℃以上的溫度的糖化方案中進(jìn)行去殼，所述溫度例如在76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃以上的溫度，或甚至86℃以上的溫度。
根據(jù)本發(fā)明，糖化過(guò)程繼續(xù)所需要的酶活性是由外源補(bǔ)給的，并可以在形成所述醪液之前，期間或者之后添加到醪液成分如水或者谷物中。優(yōu)選在該過(guò)程開(kāi)始時(shí)一次性加入所有的酶，但是，也可以在在本發(fā)明的方法之前、開(kāi)始時(shí)或過(guò)程中間一次或多次加入一種或多種酶。以下的酶活性加入到了所述醪液中蛋白酶(E.C.3.4.)和纖維素酶(E.C.3.2.1.4)。在尤其優(yōu)選的實(shí)施方案中，還添加α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)和/或麥芽糖生成酶。所述麥芽糖生成酶優(yōu)選β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)，或更優(yōu)選產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)。
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中進(jìn)一步添加酶，所述酶選自漆酶、脂酶、葡糖淀粉酶、含磷脂肪酶(phospholipolase)、肌醇六磷酸酶、植酸鈣鎂酯酶(phytinesterase)、普魯蘭酶(pullulanase)或木聚糖酶。
為使醪液在形成時(shí)所述醪液達(dá)到初始保溫溫度，水在加入到谷物之前最好先預(yù)熱。如果形成醪液的溫度低于初始保溫溫度，為達(dá)到初始保溫溫度最好另外加熱。適宜的初始保溫溫度最好在醪液形成后的15分鐘之內(nèi)達(dá)到，更優(yōu)選的則為10分鐘之內(nèi)，例如9、8、7、6、5、4、2或更優(yōu)選1分鐘之內(nèi)達(dá)到，或者在形成醪液時(shí)達(dá)到初始溫育溫度則最佳。
適宜的初始溫育溫度是在至少70℃，優(yōu)選至少71℃，更優(yōu)選至少72℃，更優(yōu)選至少73℃，或最優(yōu)選至少74℃，例如至少75℃，至少76℃，至少77℃，至少78℃，至少79℃，至少80℃，至少81℃，例如至少82℃。本發(fā)明的糖化過(guò)程包括在至少70℃的初始溫育溫度下溫育所述醪液，并將溫度保持在至少70℃，優(yōu)選指少71℃，更優(yōu)選至少72℃，更優(yōu)選至少73℃，或最優(yōu)選至少74℃，例如至少75℃，至少76℃，至少77℃，至少78℃，至少79℃，至少80℃，至少81℃，至少82℃，至少83℃，至少84℃，或至少85℃，即在溫育期間溫度不得低于70℃。在溫育期間，溫度最好控制在100℃以下，例如99℃、98℃、97℃、96℃、95℃、94℃、93℃、92℃和91℃以下，或者甚至90℃以下。
在溫育期間溫度宜恒定，或在溫育第一部分基本恒溫(初始溫育溫度)一段時(shí)間后，可以是緩慢逐漸升高溫度，也可以在溫育期間一次或多次階梯式地增加。可選也可以在溫育期間降低溫度。一個(gè)實(shí)施方案是初始溫育溫度為至少70℃，然后在溫育期間溫度增長(zhǎng)至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃，9℃，或優(yōu)選至少10℃，更優(yōu)選至少12℃，例如15℃。另一個(gè)實(shí)施方案是初始溫育溫度為至少75℃，或優(yōu)選至少80℃，并且在溫育期間溫度降低至少5℃，或優(yōu)選降低至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃，或優(yōu)選降低至少10℃，或更優(yōu)選降低至少15℃。一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述溫育包括將醪液保持在至少75℃，優(yōu)選至少76℃，更優(yōu)選至少77℃，甚至更優(yōu)選78℃，例如至少79℃，至少80℃，至少81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃，或至少90℃的溫度，持續(xù)至少1分鐘，優(yōu)選至少5分鐘，更優(yōu)選至少15分鐘，甚至更優(yōu)選至少20分鐘，例如至少30分鐘，至少40分鐘，至少50分鐘，至少60分鐘，至少90分鐘，或至少120分鐘。另一具體實(shí)施方案是所述溫育包括將醪液溫度保持在至少75℃，優(yōu)選至少76℃，更優(yōu)選至少77℃，甚至更優(yōu)選78℃，例如至少79℃，至少80℃，至少81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃，或至少90℃，持續(xù)至少總保溫時(shí)間的1％，優(yōu)選至少5％，更優(yōu)選至少15％，更優(yōu)選至少20％，或至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，例如總保溫時(shí)間的100％。
溫育時(shí)間至少為15分鐘，一般在30分鐘和2.5小時(shí)之間，例如至少45分鐘，至少1小時(shí)，至少1.25小時(shí)，至少1.5小時(shí)，至少1.75小時(shí)，或者至少2小時(shí)。
除了大麥芽以外，所述谷物可優(yōu)選包含輔料，例如未發(fā)芽的大麥或其它發(fā)芽的或未發(fā)芽的的谷物，如小麥、黑麥(rye)、燕麥(oat)、玉米(corn)、稻(rice)、買羅高梁(milo)、粟(millet)和/或高粱屬(sorghum)，或未加工的和/或精制的淀粉和/或含糖的物質(zhì)，所述含糖物質(zhì)源于小麥(wheat)、黑麥(rye)、燕麥(oat)、玉米(corn)、稻(rice)、買羅高梁(milo)、粟(millet)、高梁屬植物(sorghum)、馬鈴薯(potato)、甘薯(sweet potato)、木薯(cassava)、木薯粉(tapioca)、西米(sago)、香蕉、糖用甜菜(sugar beet)和/或甘蔗(sugar cane)等。對(duì)于本發(fā)明，輔料可以來(lái)源于塊莖、根、莖、葉、豆類(legume)、谷類(cereal)和/或整個(gè)谷物(whole grain)。添加到本發(fā)明醪液中的輔料的糊化溫度等于或低于加工溫度。如果在本發(fā)明的方法中使用輔料如稻或玉米，或其它有類似高糊化溫度的輔料，它們優(yōu)選分別煮熟，以保證在添加到本發(fā)明的醪液中時(shí)已經(jīng)糊化?；蛘咄ㄟ^(guò)添加適當(dāng)?shù)拿缚蓪⒑o料淀粉和本發(fā)明的醪液分別糖化，來(lái)保證輔料在添加到本發(fā)明的醪液之前的糖化。在該方法中，釀造輔料所用的糊化和糖化方法是本領(lǐng)域眾所周知的。輔料包含易于發(fā)酵的碳水化合物，如糖或糖漿，所述輔料可以在本發(fā)明的糖化過(guò)程前、中間或者之后添加到大麥芽醪液中去；但優(yōu)選在糖化過(guò)程之后。在添加到本發(fā)明的醪液前，部分輔料最好用蛋白酶和/或β-葡聚糖酶處理。在糖化過(guò)程中，從谷物中提取的淀粉逐漸水解成為可發(fā)酵糖和較小的糊精。在提取麥芽汁之前，所述醪液的淀粉碘測(cè)試最好呈陰性。
通常，從醪液中獲得麥芽汁包括從酒糟(即不可溶解的谷物和谷物的殼類物質(zhì)形成部分)中過(guò)濾麥芽汁。可以使熱水流經(jīng)酒糟，沖洗掉或噴掉任何殘留在谷物上的提取物。在本發(fā)明過(guò)程中應(yīng)用的熱穩(wěn)定的纖維素酶可以有效的降低β-葡聚糖水平，促進(jìn)麥芽汁的過(guò)濾，從而保證縮短循環(huán)時(shí)間和較高的提取回收率。優(yōu)選提取回收率至少80％，優(yōu)選至少81％，更優(yōu)選至少82％，更優(yōu)選至少83％，或最優(yōu)選至少84％，例如至少85％，或至少86％。
在將外殼從谷物中包含的發(fā)芽的和/或未發(fā)芽谷類(grain)的谷物中除去的這個(gè)實(shí)施方案中，麥芽汁的分離可以包含離心步驟。
根據(jù)本發(fā)明的第二部分，由本發(fā)明第一部分所制備的麥芽汁可以用來(lái)發(fā)酵制造啤酒。麥芽汁的發(fā)酵包括向麥芽汁中加入含新鮮酵母的酵母漿，即在本發(fā)明沒(méi)有使用過(guò)的酵母或是可再循環(huán)的酵母。所使用的酵母可以是任何適合于啤酒釀造的的酵母，尤其是從酵母屬(Sacchromyces spp.)中所得的酵母，如釀酒酵母和葡萄汁酵母(S.uvarum)，包括這些有機(jī)體的天然或人工產(chǎn)生的變體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員熟知制備啤酒時(shí)麥芽汁的發(fā)酵方法。
根據(jù)本發(fā)明的第三部分，為了制備啤酒，本發(fā)明第一部分的方法產(chǎn)生的麥芽汁可以在發(fā)酵之前與第二份麥芽汁混合。
根據(jù)本發(fā)明的第四部分，為了制備啤酒，本發(fā)明的第二部分或者第三部分的方法產(chǎn)生的啤酒可以與發(fā)酵的第二份麥芽汁混合。
在第三和第四部分中的第二份麥芽汁可以是本發(fā)明方法的產(chǎn)品，或者是常規(guī)方法的產(chǎn)品。一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述第二份麥芽汁為在至少70℃的溫度進(jìn)行的糖化過(guò)程的產(chǎn)物。優(yōu)選所述第二份麥芽汁從含至少10％，至少25％，至少50％，至少75％，或至少90％的未發(fā)芽大麥的谷物中制得的。優(yōu)選所述第二份麥芽汁從沒(méi)有添加蛋白酶的醪液中制備。優(yōu)選所述第二份麥芽汁從添加β-葡聚糖酶和/或α-淀粉酶的醪液中制備。
在第二、三和四部分的方法中包括向發(fā)酵的麥芽汁中加入硅凝膠，以增加啤酒的膠體穩(wěn)定性。該方法還包括向發(fā)酵的麥芽汁中加入硅藻土(kieselguhr)并過(guò)濾，以使啤酒色澤較亮。
在本發(fā)明的第二、三和四部分過(guò)程中制備的啤酒可以是任何類型的啤酒。優(yōu)選的啤酒類型包括愛(ài)兒啤酒(ales)、烈性愛(ài)兒啤酒(strong ales)、烈性啤酒(stouts)、英國(guó)黑啤(porters)、陳貯啤酒(lagers)、苦啤酒(bitters)、出口啤酒(export beers)、麥芽液(malt liquors)、發(fā)泡酒(happoushu)、高酒精度數(shù)啤酒(high-alcohol beer)、低酒精度數(shù)啤酒(low-alcohol beer)、低熱量啤酒(low-calorie beer)或清淡啤酒(light beer)。
本發(fā)明過(guò)程中所應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)化酶組合物以及高溫具有減少重要的生異味化合物濃度的作用。相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化法(standard Congress mashingprocedure)所制備的麥芽汁或啤酒而言，優(yōu)選所述麥芽汁和/或啤酒中DMS的濃度降低，例如相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化法所制備的麥芽汁或啤酒降低至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，或至少60％。相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)法的糖化方法所制備的麥芽汁或啤酒水平而言，麥芽汁或啤酒中的T2N濃度也優(yōu)選降低，例如下降至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，或至少60％。
酶本發(fā)明中所應(yīng)用的酶的選擇應(yīng)根據(jù)它們?cè)谳^高溫度下，如在本發(fā)明方法的加工溫度下，保持足夠活性的穩(wěn)定性，還應(yīng)根據(jù)它們?cè)邗惨褐羞m度酸性pH條件下保持足夠活性的能力來(lái)選擇，并且應(yīng)添加有效量。酶可以來(lái)自任何來(lái)源，優(yōu)選來(lái)自植物或藻類，更優(yōu)選來(lái)源于微生物，例如細(xì)菌或真菌。
蛋白酶合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，如真菌類和細(xì)菌類蛋白酶。較佳的蛋白酶為酸性蛋白酶，即在PH值低于7的酸性條件具有水解蛋白質(zhì)的能力的蛋白酶。
理想的酸性真菌類蛋白酶包括從曲霉屬(Aspergillus)、毛霉屬(Mucor)、根霉屬(Rhizopus)、念珠菌屬(Candida)、革蓋菌屬(Coriolus)、內(nèi)座殼屬(Endothia)、Enthomophtra、耙菌屬(Irpex)、青霉屬(Penicillium)和SclerotiumandTorulopsis衍生的真菌蛋白酶。還涉及以下來(lái)自以下真菌的蛋白酶黑曲霉(參見(jiàn)Koaze等，(1964)，Agr.Biol.Chem.Jepan，28，216)、齋藤曲霉(Aspergillussaitoi)(Yoshida，(1954)J.Agr.Chem.Soc.Japan，28，66)、盛泡曲霉(AspergillusAwamori)(Hayashida etal.，(1977)Agric.Biol.Chem.，42(5)，927-933)，棘胞曲霉(Aspergillus aculeatus)(WO 95/02044)，或米曲霉(Aspergillus oryzae)，例如pepA蛋白酶，以及來(lái)自微小毛霉(Mucor pusillus)或米黑毛霉(Mucor miehei)的酸性蛋白酶。
還涉及中性或者堿性蛋白酶，例如來(lái)自芽孢桿菌菌株的蛋白酶。本發(fā)明中的具體蛋白酶是從解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)中得到的，其序列可以由Swissprot登錄號(hào)P06832得到。還涉及這樣的蛋白酶，其與Swissprot登錄號(hào)P06832的氨基酸序列有至少90％的同源性，例如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具體至少99％的同源性。
還涉及這樣的蛋白酶，其與在丹麥專利申請(qǐng)PA 2001 01821和PA2002 00005中SEQ ID NO1公開(kāi)的氨基酸序列有至少90％的同源性，例如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具體至少99％的同源性。
還涉及木瓜蛋白酶樣蛋白酶，如E.C.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)中的蛋白酶，例如EC 3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、EC 3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、EC3.4.22.7(asclepain)，EC 3.4.22.14(actinidain)，EC 3.4.22.15(組織蛋白酶(cathepsin)L)、EC 3.4.22.25(甘氨酰內(nèi)肽酶(glycyl endopeptidase))和EC3.4.22.30(caricain)。
蛋白酶可使醪液中的高分子量蛋白的總長(zhǎng)減少成低分子量蛋白。低分子量蛋白是酵母營(yíng)養(yǎng)的必需成分，而高分子量蛋白保證泡沫的穩(wěn)定性。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員已知加入的蛋白酶必須是一個(gè)平衡的量，在保證酵母擁有充足的自由氨基酸的同時(shí)，保留足夠的高分子量蛋白來(lái)穩(wěn)定泡沫。加入的蛋白酶的量可以是0.1-1000AU/kg dm，更優(yōu)選則為1-100AU/kg dm，最優(yōu)選為5-25AU/kg dm。
纖維素酶(E.C.3.2.1.4)纖維素酶可以來(lái)自微生物，例如來(lái)源于絲狀真菌菌株(如曲霉屬、木霉屬、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮孢屬(Fusarium))。具體的纖維素酶包括從H.insolens得到的內(nèi)切葡聚糖酶(內(nèi)切葡聚糖酶I)，其由WO 91/17244

圖14中的氨基酸序列定義，而43kD H.insolens內(nèi)切葡聚糖酶在WO 91/17243中有所描述。
在本發(fā)明方法中使用的纖維素酶是內(nèi)切葡聚糖酶，例如內(nèi)切-l，4-β-葡聚糖酶。所述具體β-葡聚糖酶與丹麥專利申請(qǐng)PA2002 00130 SEQ ID NO1中公開(kāi)的氨基酸序列有著至少90％同源性，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具體至少99％的同源性。
商業(yè)上可用的纖維酶制劑包括賽路克雷斯(CELLUCLAST)、纖維素酶(CELLUZYME)、賽沸路(CEREFLO)和ULTRAFLO(購(gòu)自諾維信公司)，LAMINEXTM和SPEZYME CP(購(gòu)自Genencor公司)，以及ROHAMENT7069W(購(gòu)自德國(guó)Rhm公司)。
加入的β-葡聚糖酶的量可以是1.0-10000 BGU/kg dm，優(yōu)選則為10-5000BGU/kg dm，優(yōu)選50-1000BGU/kg dm，更優(yōu)選100-500BGU/kg dm。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)在本發(fā)明方法中所使用的具體α-淀粉酶可以是任何真菌α-淀粉酶。尤其是與在WO96/23874的SEQ ID No.10所示的氨基酸序列具有高度同源性的真菌α-淀粉酶，即有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％，甚至至少90％的同源性。加入的真菌α-淀粉酶的量可以是1-1000AFAU/kg DM，更優(yōu)選的為2-500AFAU/kgDM，最優(yōu)選的為20-100.AFAU/kg DM。
在本發(fā)明方法中使用的另一種α-淀粉酶可以是芽孢桿菌α-淀粉酶。熟知的芽孢桿菌α-淀粉酶包括從地衣芽胞桿菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌菌株中得到的α-淀粉酶。其它的芽孢桿菌α-淀粉酶包括從芽孢桿菌NCIB 12289、NCIB 12512、NCIB 12513或DSM 9375(所述菌株均詳見(jiàn)WO95/26397)的菌株中得到的α-淀粉酶，以及在Tsukamoto等人，Biochemical and Biophysical Research communications，151(1988)，25-31頁(yè)中描述的α-淀粉酶。在本發(fā)明涉及的芽孢桿菌α-淀粉酶是在WO99/19467第3頁(yè)18行到第6頁(yè)27行中定義的α-淀粉酶。優(yōu)選α-淀粉酶具有的氨基酸序列與WO99/19467的SEQ ID NO4有至少90％的同源性，例如至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具體至少99％的同源性。最優(yōu)選的產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶變體包含在WO99/43794中所公開(kāi)的變體。所述變體和雜合體在WO96/23874、WO97/41213和WO99/19467中描述。尤其涉及重組嗜熱脂肪芽胞桿菌α-淀粉酶變體，其具有突變I181*+G182*+N193F?？杉尤氲难挎邨U菌α-淀粉酶的量宜為1.0-1000NU/kg dm，優(yōu)選的為2.0-500NU/kg dm，優(yōu)選為10-200NU/kg dm。
產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶在本發(fā)明中所使用的一種具體的酶是產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)。產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶(葡聚糖1，4-α-麥芽糖水解酶(maltohydrolase))可以將支鏈淀粉和直鏈膠淀粉水解為α構(gòu)型的麥芽糖。此外，產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶還能夠水解麥芽三糖和環(huán)糊精。具體涉及的產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶來(lái)源于芽胞桿菌(Bacillus sp.)，優(yōu)選來(lái)源于嗜熱脂肪芽胞桿菌(Bacillusstearothermophilus)，更優(yōu)選來(lái)源于如EP 120.693中所描述的嗜熱脂肪芽胞桿菌C599。這種具體的產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶的氨基酸序列如在US 6,162,628中SEQ ID NO1的氨基酸1-686所示。優(yōu)選產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶的氨基酸序列與US 6,162,628中SEQ ID NO1的氨基酸1-686有著至少90％的同源性，優(yōu)選至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具體至少99％的同源性。最優(yōu)選的產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶變體包含WO99/43794中公開(kāi)的變體。
加入的產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶的量可以是0.1-1000MANU/kg dm，優(yōu)選為1-100MANU/kg dm，優(yōu)選為5-25MANU/kg dm。
β-淀粉酶在本發(fā)明方法使用的另一種具體的酶是β-淀粉酶(E.C 3.2.1.2)。
β-淀粉酶可以從各種植物和微生物中分離出來(lái)(W.M.Fogarty和C.T.Kelly，Progress in Industrial Microbiology，vol.15，pp.112-115，1979)。這些β-淀粉酶的特點(diǎn)是最適宜的溫度范圍為40℃到65℃且最適宜的PH值范圍為4.5到7.0。具體涉及的β-淀粉酶包括Genencor公司的SPEZYME BBA1500、SPEZYME DBA、OPTIMALTTMME和OPTIMALTTMBBAβ-淀粉酶，和諾維信公司(Novozymes A/S)的β-淀粉酶NOVOZYMTMWBA。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道β-淀粉酶的添加量宜為有效量。
其它酶在本發(fā)明過(guò)程中進(jìn)一步用到的另一具體酶是微生物或者植物來(lái)源的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)。優(yōu)選源自真菌或者細(xì)菌的葡糖淀粉酶，其選自以下酶曲霉屬葡糖淀粉酶，尤其是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等(1984)，EMBO J.3(5)，p.1097-1102)，或者其變體，如在WO92/00381和WO00/04136中所公開(kāi)的；盛泡曲霉葡糖淀粉酶(WO84/02921)，米曲霉(Agric.Biol.Chem.(1991)，55(4)，p.941-949)，或者其變體或片段。
其它曲霉屬葡糖淀粉酶變體包括用來(lái)增強(qiáng)耐熱性的變體G137A和G139A(Chen等(1996)，Prot.Engng.9，499-505)、D257E和D293E/Q(Chen等(1995)，Prot.Engng.8，575-582)、N182(Chen等(1994)，Bio-chem.J.301，275-281)、二硫鍵(disulfide bond)，A246C(Fierobe等(1996)，Bio-chem.J.，35，8698-8704；以及將Pro殘基導(dǎo)入位置A435和S436(Li等(1997)，ProteinEngng.10，1199-1204)。其它葡糖淀粉酶包括Talaromyces葡糖淀粉酶，尤其是從Talaromyces emersonii(WO99/28448)、Talaromyces leycettanus(美國(guó)專利Re.32,153)、Talaromyces duponti、Talaromyces thermophilus(美國(guó)專利4,587,215)中衍生的葡糖淀粉酶。涉及的細(xì)菌葡糖淀粉酶包括來(lái)自梭狀芽孢桿菌屬(Clostridium)的葡糖淀粉酶，尤其是來(lái)自C.thermoamylolyticum(EP135,138)和熱硫化氫熱厭氧桿菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO86/01831)中的葡糖淀粉酶。優(yōu)選的葡糖淀粉酶包括從米曲霉中得到的葡糖淀粉酶，例如與在WO00/04136中的SEQ ID NO2所示氨基酸序列有著至少90％、至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或具體至少99％的同源性的葡糖淀粉酶。還涉及商品AMG 200L、AMG 300L、SANTMSUPER和AMGTME(來(lái)自諾維信公司)；OPTIDEXTM300(來(lái)自Genencor公司)、AMIGASETM和AMIGASETMPLUS(來(lái)自DSM)；G-ZYMETMG900(來(lái)自Enzyme Bio-Systems公司)以及G-ZYMETMG990 ZR(黑曲霉葡糖淀粉酶和低蛋白酶含量)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道葡糖淀粉酶的添加量宜為有效量。
在方法中將會(huì)使用的另外一種酶是去分支酶(debranching enzyme)，例如異淀粉酶(isoamylase)(E.C.3.2.1.68)或普魯蘭酶(E.C.3.2.1.41)。異淀粉酶能水解支鏈淀粉和β-限制糊精(β-limit dextrin)中的α-1，6-D-葡萄糖苷分支連接，并其與普魯蘭酶相區(qū)分可以通過(guò)異淀粉酶不能攻擊普魯蘭，以及對(duì)α-限制糊精的限制性作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道去分支酶的添加量宜為有效量。
材料和方法酶一種蛋白酶(EC 3.4.24.28)，其源于解淀粉芽孢桿菌，并具有Swissprot登錄號(hào)P06832中公開(kāi)的序列。
一種蛋白酶，它具有丹麥專利申請(qǐng)PA 2001 01821和PA 2002 00005的SEQ ID NO2的氨基酸1-177所公開(kāi)的氨基酸序列。
一種纖維素酶(E.C.3.2.1.4)，其為β-葡聚糖酶，并具有丹麥專利申請(qǐng)PA2002 00130中SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
一種源于嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.Stearothermophilus)的α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)，它具有WO99/19467的SEQ ID NO4公開(kāi)的氨基酸序列，并具有突變I181*+G182*+N193F。
一種產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)，它具有專利申請(qǐng)WO 1016340中SEQ ID NO1的氨基酸序列1-686。
大麥芽所使用的大麥芽應(yīng)具有如下特性。
對(duì)實(shí)施例1到5中所使用的大麥芽的分析(Analytica-EBC方法)修飾的修飾良好的麥
方法蛋白水解活性(AU)蛋白水解活性可以用變性血紅蛋白作為底物來(lái)確定。在Anson-Hemoglobin蛋白水解活性確定法中，變性血紅蛋白被消化，未被消化的血紅蛋白與三氯醋酸(TCA)一起沉淀。TCA可溶產(chǎn)物的量由苯酚試劑測(cè)定，該試劑在遇酪氨酸和色氨酸時(shí)變藍(lán)。
一個(gè)安森單位(Anson Unit/AU)定義為在標(biāo)準(zhǔn)條件下(即25℃、PH值7.5以及10分鐘的反應(yīng)時(shí)間)以初始速率消化血紅蛋白的酶的量，所述酶量使得每分鐘釋放的TCA可溶物質(zhì)的量與苯酚試劑反應(yīng)所產(chǎn)生的顏色與一個(gè)毫當(dāng)量的酪氨酸相當(dāng)。
諾和諾德公司(Novo Nodisk A/S，Denmark)已將該分析方法的細(xì)節(jié)描述收集于檔案AF4/5中以便查閱。該檔案包含在參考文件之列。
α-淀粉酶活性(NU)淀粉分解的活性可以用馬鈴薯淀粉作為底物來(lái)確定。這種方法是基于酶對(duì)修飾后馬鈴薯淀粉的分解。在該反應(yīng)之后，將淀粉/酶溶液樣品與碘溶液混合。最初，將會(huì)呈現(xiàn)一種帶黑的藍(lán)色，但是在淀粉分解過(guò)程中，藍(lán)色會(huì)變淺，并逐漸變成紅棕色，將該顏色與有色玻璃標(biāo)準(zhǔn)品比較。
1000Novo α-淀粉酶單位(KNU)相當(dāng)于1000NU。1KNU是指在標(biāo)準(zhǔn)條件(即37℃+/-0.05，0.0003M Ca2+和PH值5.6)下糊化5.26克淀粉干物質(zhì)Merk Amylum solubile的酶的量。
諾和諾德公司已將該分析方法的細(xì)節(jié)描述收集于檔案AF9/6中以便查閱。該檔案包含在參考文件之列。
產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶活力(MANU)1個(gè)麥芽糖淀粉酶Novo單位(MANU)定義為標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘裂解1微摩爾的麥芽三糖所需要的酶的量。標(biāo)準(zhǔn)條件是10mg/ml麥芽三糖，37℃，pH值5.0以及30分鐘的反應(yīng)時(shí)間。通過(guò)NADH的生成，用葡萄糖脫氫酶(GlucDH，Merck)將所形成的葡萄糖修飾為葡糖酸內(nèi)酯，其通過(guò)光度計(jì)在340nm測(cè)定?？蓮闹Z維信公司獲得該分析法的細(xì)節(jié)(檔案代號(hào)EAL-SM-0203.01)。
葡糖淀粉酶活性(AGU)Novo葡糖淀粉酶單位(AGU)定義為在37℃、PH值4.3，每分鐘水解1微摩爾麥芽糖的酶量。
使用Boehringer Mannheim，124036的葡萄糖GOD-Perid試劑盒，通過(guò)隨后改良的方法(檔案代號(hào)AEL-SM-0131，可自諾維信公司獲得)以AGU/ml為單位測(cè)定所述活性。標(biāo)準(zhǔn)品(Standard)AMG-標(biāo)準(zhǔn)品(Standard)，批號(hào)7-1195，195AGU/ml。375微升底物(50mM乙酸鈉中含有1％的麥芽糖，pH值4.3)在37℃保溫5分鐘。然后加入用乙酸鈉稀釋的25微升的酶。10分鐘后通過(guò)加入100微升0.25M的NaOH來(lái)停止反應(yīng)。將20微升反應(yīng)物轉(zhuǎn)移到96孔板，并加入200微升GOD-Perid溶液(124036，Boehringer Mannheim)。在室溫30分鐘之后，在650nm測(cè)定吸光率，并由AMG-標(biāo)準(zhǔn)品以AGU/ml為單位計(jì)算活性。有關(guān)該分析法(檔案代號(hào)AEL-SM-0131)的詳盡描述可自諾維信公司獲得。
β-淀粉酶活(DP°)SPEZYME BBA1500的活性用糖化力程度(Degree of Diastatic Power)(DP°)來(lái)表示。這是指在0.1ml 5％的樣品酶制劑溶液中含有的酶量，所述酶可產(chǎn)生足夠的還原型糖，其在當(dāng)所述樣品與100ml的底物在20℃保溫1小時(shí)的情況下可還原5ml的菲令氏(Fehling)溶液。
β-葡聚糖酶活性(BGU)溶細(xì)胞活性可以測(cè)定為β-葡聚糖酶單位(BGU)。β-葡聚糖酶與β-葡聚糖反應(yīng)生成葡萄糖或者還原型碳水化合物(通過(guò)Somogyi-Nelson氏法確定為還原型糖)。1個(gè)β-葡聚糖酶單位(BGU)是指在標(biāo)準(zhǔn)條件下，釋放的葡萄糖或還原型碳水化合物的還原能力相當(dāng)于1μmol葡萄糖每分鐘的酶量。標(biāo)準(zhǔn)條件是0.5％的β-葡聚糖作為底物，在pH值7.5、30℃，反應(yīng)時(shí)間為30分鐘?？上蛑Z維信公司咨詢?cè)摲治龇?檔案代號(hào)EB-SM-0070.02/01)的細(xì)節(jié)。
標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化法(Standard Congress mashing process)標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化法依照EBC4.5.1 Extract of MaltCongress Mash中的步驟進(jìn)行。溫度范圍為初始溫育溫度45℃、持續(xù)30分鐘，然后以1.0℃/分鐘的速度增加到70℃并持續(xù)25分鐘，最后在70℃持續(xù)65分鐘，總保溫期為2個(gè)小時(shí)。
其它方法粗產(chǎn)品、麥芽汁、啤酒等的分析方法可以在歐洲啤酒工業(yè)大會(huì)(EBC)分析委員會(huì)制定的《Analytica-EBC》標(biāo)準(zhǔn)(1998)(Analytica-EBC，Analysiscommittee of EBC，the European Brewing Convention(1998)，Verlag HansCarl Geranke-Fachverlag)中找到。就本發(fā)明而言，用于測(cè)定下列參數(shù)的方法如下
柏拉圖度折射計(jì).
(Plato)可通化的氮基于EBC8.10，但使用TNBS(2，4，6三硝基苯磺酸)代替(水合)茚三酮作為試劑。TNBS在游離氨基或氨基酸和肽的溶液中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生黃顏色的復(fù)合物，在340nm用分光光度計(jì)測(cè)定。
β-葡聚糖EBC8.13.2(麥芽汁中含有的高分子量β-葡聚糖熒光測(cè)定法)。
顏色EBC4.7.2修飾度EBC4.14，麥芽汁的修飾和均勻程度，鈣劑法(calcoflour Method)過(guò)濾性濾出液體積(ml)測(cè)定根據(jù)EBC4.5.1(Extract ofMaltCongress Mash)，8.2.小節(jié)進(jìn)行。過(guò)濾在有凹槽的、直徑為320mm的濾紙過(guò)濾1小時(shí)后讀出濾出液的體積。使用Schleicher and Schüll公司的No.597，Machery，Nagel and Co.，漏斗中，直徑200mm，置于500ml的燒瓶中。
pH值EBC8.17(麥芽汁的pH值)。
庫(kù)爾巴哈指數(shù)EBC4.9.1(麥芽汁中的可溶性氮分光光度分析法)以及EBC3.3.1(大麥中氮的總含量凱氏(Kjeldahl)法(RM))。
T2N利用質(zhì)譜檢測(cè)(GC-MS)進(jìn)行氣相色譜分析。
DMS(P)和基于Hysert，D.W等(1979)的方法啤酒中硫酸二DMS甲酯的前體生化物質(zhì)，J.ASBC 37/4，169-174和Mundy，A.P(1991)用頂空氣相色譜分析法測(cè)定啤酒中的硫酸二甲酯——日本釀酒協(xié)會(huì)協(xié)作調(diào)研97，45-46(Hysert，D.W etal(1979)Dimethyl sulphide precursor in beer，J.ASBC37/4，169-174 and Mundy，A.P.(1991)Thedetermination of Dimethyl Sulphide in Beer byHeadspace Gas Chromatography-a Collaborativeinvestigation of Precession.J.Inst.Brew.，97，45-46).
提取回收率EBC4.5.1(Extract of MaltCongress Mash，Extract in dry)。術(shù)語(yǔ)麥芽汁提取回收率被定義為從谷物(麥芽和輔料)中提取的可溶性物質(zhì)的總和(葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，麥芽三糖，糊精，蛋白質(zhì)，膠質(zhì)(gum)，無(wú)機(jī)物，其它物質(zhì))，表達(dá)為基于干物質(zhì)的百分比。剩下的不可溶部分被定義為酒糟。
a)E1=P(M+800)100-P]]>b)E2=E1·100100-M]]>其中E1＝樣品的提取物含量，以％的形式(m/m)表示E2＝干谷物的提取物含量，以％的形式(m/m)表示P＝麥芽汁中提取物的含量，以％柏拉圖度(Plato)表示M＝谷物的濕物質(zhì)含量，以％的形式(m/m)表示800＝在100克谷物的醪液中加入蒸餾水的量。
DMS及反式-2-壬烯醛的鑒定和定量動(dòng)態(tài)頂空技術(shù)(Dynamic headspace)作為一種分離方法使用，其中通過(guò)含有麥芽汁的玻璃燒瓶封閉系統(tǒng)以及上方帶彎管的清潔頭(purge head)添加氮。按如下過(guò)程執(zhí)行收集在含200克麥芽汁的500ml燒瓶中加入1ml的4-甲基-1-戊醇(用作內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)(IS))。將燒瓶放置在30℃的水浴中，并以大約210轉(zhuǎn)/分鐘進(jìn)行電磁攪拌。使用流量計(jì)(flow-meter)(J & W ADM1000，J&Wscientific)來(lái)控制流過(guò)玻璃燒瓶的氮。
根據(jù)揮發(fā)性的不同，用溫和氮流以50ml/min持續(xù)15分鐘來(lái)收集和鑒定DMS，用上述氮流以300ml/min持續(xù)60分鐘的氮流來(lái)收集和鑒定t-2-n。DMS非常容易揮發(fā)，相對(duì)于t-2-n來(lái)說(shuō)需要用低速的氣流在短時(shí)間內(nèi)收集。DMS和t-2-n的保留時(shí)間(retention time)分別為2.2-2.3分和23.5-23.8分。流動(dòng)時(shí)間(flow time)和方法概述如下所列。
分離和鑒定以氦作為運(yùn)載氣體，利用帶有J&W Scientific DB-WAX柱(30m×0.25mm，0.25μm寬)的Hewlett-Packard，G1800A GCD操作系統(tǒng)(GC-MS)進(jìn)行。柱流速(column flow)是1ml/min，恒壓為kPa，溫度為53℃，分離噴射比率(split injection ratio)為1∶10。噴射器(injector)溫度控制在250℃，溫度圖譜為45℃持續(xù)10分鐘，然后以6℃/min的速度增加到250℃，并持續(xù)10分鐘。與GC設(shè)備相連的自動(dòng)熱解吸附裝置(AutomatedThermal Desorper)Perkin Elmer ATD 400利用芳香成分從Tenax-GR彎管(traps)的解吸附。鑒定是基于從GC-MS收集所得質(zhì)譜與G 1035 A Wiley PBM文庫(kù)(Hewlett-Packard)中發(fā)現(xiàn)的質(zhì)譜的比較進(jìn)行的。檢測(cè)器的質(zhì)量范圍為20-425mhz。
量化是按照已制備的二甲硫標(biāo)準(zhǔn)曲線和t-2-n標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)進(jìn)行的。DMS標(biāo)準(zhǔn)曲線包含0-150ppb的濃度，而t-2-n標(biāo)準(zhǔn)曲線包含0-5ppb的濃度。
醪液的制備除非另作說(shuō)明，糖化過(guò)程按下面步驟進(jìn)行。醪液按照EBC4.5.1，使用根據(jù)EBC1.1的麥芽來(lái)制備。糖化試驗(yàn)在有蓋子的500ml的容器中進(jìn)行，每個(gè)容器中盛有含50克谷物的醪液，并用溫預(yù)熱到初始溫育溫度+1℃的水調(diào)節(jié)總重量為450±0.2g。在糖化過(guò)程中，將所述容器置于水浴中保溫并攪拌。
實(shí)施例實(shí)施例1
加入各種酶，所述酶即100NU芽孢桿菌α-淀粉酶和10MANU產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶每千克醪液干物質(zhì)，以及根據(jù)表1的蛋白酶和β-葡聚糖酶，并且將所述容器在恒定80℃溫育2個(gè)小時(shí)。表1中的結(jié)果是2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。
表1恒定80℃進(jìn)行糖化2小時(shí)。蛋白酶和β-葡聚糖酶水平的效果。
N.a.未分析實(shí)施例2酶組成為每千克醪液的干物質(zhì)12.5AU蛋白酶，212BGU β-葡聚糖酶，100NU芽孢桿菌α-淀粉酶和10MANU產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶。溫度圖譜為在初始溫育溫度70℃持續(xù)60分鐘，接著以1.33℃/min的速度升高溫度15分鐘，最后停在90℃進(jìn)行45分鐘，總溫育期為2個(gè)小時(shí)。表2中的結(jié)果為4次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。
表2在70-90℃下浸漬糖化(infusion mashing)，溫育期2小時(shí)
實(shí)施例3本發(fā)明的2種高溫糖化法與沒(méi)有添加其它酶的標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化法的比較，上述兩種方法的溫育期分別為2個(gè)小時(shí)和1.5個(gè)小時(shí)，其中的酶組合包含每kg dm 212 BGUβ-葡聚糖酶、100NU芽孢桿菌α-淀粉酶、10MANU產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶和12.5AU蛋白酶。
分析生成的麥芽汁的提取回收率、可利用氮、顏色和β-葡聚糖含量(表3)，以及各種芳香化合物(表4)。所示數(shù)據(jù)是2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。
溫度圖譜為高溫2個(gè)小時(shí)在初始溫育溫度70℃持續(xù)60分鐘，然后以1.33℃/min在15分鐘內(nèi)增加到90℃，最后在90℃持續(xù)45分鐘，總溫育期為2個(gè)小時(shí)。
高溫1.5小時(shí)在初始溫育溫度70℃持續(xù)40分鐘，然后以1.33℃/min在15分鐘內(nèi)增加到90℃，最后在90℃持續(xù)35分鐘，總溫育期為1.5個(gè)小時(shí)。
表3本發(fā)明的高溫糖化過(guò)程A和B與標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化法C的比較，所述A和B利用上述酶組合在70-90℃分別進(jìn)行2小時(shí)和1.5小時(shí)。
表4與標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化相比，本發(fā)明的兩種方法制備的麥芽汁的香味分析結(jié)果，本發(fā)明的兩種方法是利用上文中所述的酶組合在70-90℃進(jìn)行的。
實(shí)施例4本發(fā)明高溫糖化法中制備的麥芽汁和發(fā)酵麥芽汁與不添加酶的標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化法所得的類似產(chǎn)品的比較，本發(fā)明采用1.75小時(shí)的溫育期，以及含每kg dm 212BGU β-葡聚糖酶、100NU芽孢桿菌α-淀粉酶、10MANU產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶和12.5AU蛋白酶的酶組合。
溫度圖譜包括初始溫育溫度70℃持續(xù)40分鐘，然后以1.33℃/分鐘在15分鐘內(nèi)增加到90℃，最后在90℃持續(xù)35分鐘，總溫育期為1.75個(gè)小時(shí)。所示的數(shù)據(jù)是2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。
表5麥芽汁分析。本發(fā)明高溫糖化法與標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化法的對(duì)比，本發(fā)明的方法有上文所述溫度圖譜和酶組合。
用高溫糖化法和歐啤協(xié)糖化法得到的麥芽汁將被轉(zhuǎn)移到2升的試管中，加入2.5克酵母每升，并在14℃下發(fā)酵7天。在發(fā)酵的過(guò)程中，在第0、1、2、3、4和7天，取樣品來(lái)測(cè)定柏拉圖度、pH值和酵母生長(zhǎng)情況。
發(fā)酵以后，取樣品做反式-2-壬烯醛和DMS分析。
表6分析發(fā)酵中的麥芽汁。在0天加入酵母。
表7已經(jīng)發(fā)酵的麥芽汁的分析。
實(shí)施例五本發(fā)明的數(shù)個(gè)高溫糖化過(guò)程均在2升容器進(jìn)行中，使用的谷物包含未發(fā)芽的大麥、修飾不完全的大麥芽(β-葡聚糖200mg/l)、修飾的大麥芽(β-葡聚糖135mg/l)，修飾良好的大麥芽(β-葡聚糖82mg/l)或不同比例的大麥芽和未發(fā)芽的大麥(谷物與水的比率為1∶8以上)。在表8中的數(shù)據(jù)是3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，而表9到12中的是2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值。
表8在以下溫度圖譜進(jìn)行糖化的結(jié)果70℃持續(xù)40分鐘，15分鐘內(nèi)增加到90℃，最后在90℃持續(xù)65分鐘(總共2小時(shí))。使用的酶是400BGU/kg dm β-葡聚糖酶，12.5AU/kg dm蛋白酶，100NU/g dm芽孢桿菌α-淀粉酶。
表9在以下溫度圖譜糖化的結(jié)果75℃持續(xù)15分鐘，15分鐘內(nèi)增加到90℃，最后在90℃持續(xù)30分鐘(總共1小時(shí))。使用的酶是400BGU/kg dmβ-葡聚糖酶，12.5AU/kg dm蛋白酶，100NU/g dm芽孢桿菌α-淀粉酶。
表10在75℃持續(xù)1小時(shí)的溫度圖譜進(jìn)行糖化的結(jié)果。使用的酶是400BGU/kg dm β-葡聚糖酶，12.5AU/kg dm蛋白酶，100NU/g dm芽孢桿菌α-淀粉酶。
表11在82℃持續(xù)1小時(shí)的溫度圖譜進(jìn)行糖化的結(jié)果。使用的酶是333BGU/kg dm β-葡聚糖酶，12.5AU/kg dm蛋白酶，100NU/g dm芽孢桿菌α-淀粉酶，10MANU/kg dm產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶。
實(shí)施例六高度修飾不完全的麥芽用以下方法糖化不添加酶的標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)法(表12)，添加酶的標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化法(表13)，和添加酶的高溫糖化法(表14)。表12標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化(無(wú)添加酶)制備的高度未修飾麥芽的表征，n＝4。
表13加酶標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化法制備的高度未修飾麥芽的結(jié)果概述。
1β-葡聚糖，mg/l n＝4；2700nm的平均OD，n＝2；3提取物E2，n＝4干麥芽中，％(m/m)；4平均粘性n＝8(mPa*s)；520mg EP1/kg dm，100KNU/kg dm，10AU/kg dm；6100KNU/kg dm，300FXU/kg dm；7100KNU/kg dm，600FXU/kg dm.
表14高度未修飾麥芽在70-90℃高溫糖化1小時(shí)的結(jié)果概述。
1β-葡聚糖，mg/l n＝4；2700nm的平均OD n＝2；3提取物E2，n＝4干麥芽中，％(m/m)；4平均粘性n＝8(mPa*s)；522.5mg EP/kg dm，100KNU/kgdm，12.5AU/kg dm 300 FXU/kg dm；6100KNU/kg dm，12.5AU/kg dm，300 FXU/kg dm；75x std.劑量的UltrafloL(1000 ppm).
1(mg EP/kg dm)表示每千克干物質(zhì)(dm)中純酶蛋白的mg數(shù)。
權(quán)利要求
1.一種制備麥芽汁的方法，包括a)形成含5％到100％的大麥芽(谷物的w/w)的醪液；b)在a)之前，期間或者之后添加纖維素酶(E.C.3.2.1.4)；c)在a)的15分鐘內(nèi)達(dá)到至少70℃的初始溫育溫度；d)c)之后，在至少70℃溫育所述醪液一段時(shí)間，所述時(shí)間獲得至少80％的提取物回收率；和，e)將麥芽汁從酒糟中分離。
2.權(quán)利要求1的方法，其中進(jìn)一步添加蛋白酶(E.C.3.4.)。
3.前述任一權(quán)利要求的方法，其中進(jìn)一步添加α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)。
4.前述任一權(quán)利要求的方法，其中進(jìn)一步添加麥芽糖生成酶。
5.一種制備啤酒的方法，包括獲得權(quán)利要求1到4任一方法制備的麥芽汁，用酵母發(fā)酵上述麥芽汁，并得到啤酒。
6.一種制備啤酒的方法，包括獲得權(quán)利要求1到4任一方法制備的麥芽汁，將所述麥芽汁與第二份麥芽汁混合，用酵母發(fā)酵所述混合麥芽汁，并得到啤酒。
7.一種制備啤酒的方法，包括取得權(quán)利要求1到4任一方法制備的麥芽汁，用酵母發(fā)酵所述麥芽汁，將經(jīng)過(guò)發(fā)酵的麥芽汁與第二份經(jīng)過(guò)發(fā)酵的麥芽汁混合，并得到啤酒。
8.前述任一權(quán)利要求的方法，其中權(quán)利要求1所述麥芽汁谷物中至少10％，或更優(yōu)選至少15％.更優(yōu)選至少25％，或最有選至少35％，例如至少50％，至少75％，至少90％，或甚至100％(w/w)為大麥芽。
9.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述起始溫育溫度是在醪液形成后14分鐘內(nèi)達(dá)到，或更優(yōu)選在13分鐘內(nèi)，例如在12，11，10，9，8，7，6，5，4，3或2分鐘內(nèi)達(dá)到，或者甚至更優(yōu)選在1分鐘之內(nèi)達(dá)到，或最優(yōu)選在所述醪液形成時(shí)達(dá)到。
10.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述起始溫育溫度是至少71℃，優(yōu)選至少72℃，更優(yōu)選至少73℃，甚至更優(yōu)選至少74℃，或最優(yōu)選至少75℃，例如至少76℃，至少77℃，至少78℃，至少79℃，至少80℃，至少81℃或至少82℃。
11.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述溫度在溫育過(guò)程中增加和/或降低至少1℃，2℃，3℃，4℃，5℃，6℃，7℃，8℃，9℃，或優(yōu)選降低10℃，或更優(yōu)選降低12℃，例如至少15℃。
12.前述任一權(quán)利要求的方法，其中步驟d)的溫育包括將醪液的溫度在至少75℃，優(yōu)選指少76℃，更優(yōu)選至少77℃，甚至更優(yōu)選至少78℃，例如至少79℃，至少80℃，至少81℃，82℃，83℃，84℃，85℃，86℃，87℃，88℃，89℃，或至少90℃保持至少1分鐘，優(yōu)選至少5分鐘，更優(yōu)選至少15分鐘，甚至更優(yōu)選至少20分鐘，例如至少30分鐘，至少40分鐘，至少50分鐘，至少60分鐘，至少90分鐘或至少110分鐘。
13.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述保溫的時(shí)間在15分鐘到2.5小時(shí)，例如至少30分鐘，至少45分鐘，至少1小時(shí)，至少1.25小時(shí)，至少1.5小時(shí)，至少1.75小時(shí)，或至少2小時(shí)。
14.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述溫育期時(shí)間在15分鐘到2.5小時(shí)，例如至少30分鐘，至少45分鐘，至少1小時(shí)，至少1.25小時(shí)，至少1.5小時(shí)，至少1.75小時(shí)或至少2小時(shí)。
15.權(quán)利要求5-14之一的方法，其中所述啤酒是愛(ài)兒啤酒、烈性愛(ài)兒啤酒、苦啤酒、濃烈黑啤酒、英國(guó)黑啤、陳貯啤酒、出口啤酒、麥芽液、大麥酒、發(fā)泡酒、高酒精度數(shù)啤酒、低酒精度數(shù)啤酒、低熱量啤酒或清淡啤酒。
16.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述麥芽汁或啤酒與按照標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化法制備的麥芽汁或者啤酒相比，二甲硫的含量降低，例如降低1％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，或至少60％。
17.前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述麥芽汁或啤酒與按照標(biāo)準(zhǔn)歐啤協(xié)糖化法制備的麥芽汁或者啤酒相比，所含的反式-2-壬烯醛的濃度減少，例如減少至少1％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，或至少60％。
18.權(quán)利要求3-17之一的方法，其中所述α-淀粉酶來(lái)自芽孢桿菌。
19.權(quán)利要求3-18之一的方法，其中所述芽孢桿菌α-淀粉酶具有與WO99/19467中的SEQ ID NO4具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同源性的氨基酸序列。
20.權(quán)利要求4-19之一的方法，其中所述麥芽糖生成酶是β-淀粉酶(E.C.3.2.1.2)或產(chǎn)麥芽糖α-淀粉酶(E.C.3.2.1.133)。
21.權(quán)利要求4-20之一的方法，其中所述麥芽糖α淀粉酶來(lái)自芽孢桿菌，優(yōu)選來(lái)自嗜熱脂肪芽孢桿菌。
22.權(quán)利要求4-21之一的方法，其中所述麥芽糖α淀粉酶與US6,162,628中的SEQ ID NO1所示的氨基酸序列具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同源性。
23.前述權(quán)利要求任一的方法，其中所述蛋白酶來(lái)自解淀粉芽孢桿菌，并與Swissprot登錄號(hào)P06832的氨基酸序列具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同源性。
24.前述權(quán)利要求任一的方法，其中所述蛋白酶與丹麥專利申請(qǐng)PA2001 01821和PA 2002 00005中SEQ ID NO2的氨基酸序列1-177所公開(kāi)的序列具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同源性。
25.前述權(quán)利要求任一的方法，其中所述纖維素酶是內(nèi)切葡聚糖酶，例如內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶，且所述纖維素酶與丹麥專利申請(qǐng)PA 2001 00130中SEQ ID NO2的氨基酸序列1-177所公開(kāi)的序列具有至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％的同源性。
26.權(quán)利要求1-25任一方法制備的麥芽汁。
27.權(quán)利要求5-25任一方法制備的啤酒。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用高溫糖化的谷物制備麥芽汁和啤酒的方法。
文檔編號(hào)C12C7/047GK1671833SQ03817834
公開(kāi)日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2003年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月25日
發(fā)明者亨里克·比斯加德弗朗曾, 沃爾夫?qū)h尼曼, 賴克·費(fèi)斯特森, 波爾·B·R·波爾森, 庫(kù)爾特·多里克 申請(qǐng)人:諾維信公司