本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由心肌細(xì)胞功能障礙引起的心臟衰竭是世界范圍內(nèi)的一種主要的疾病，心衰患者最終死亡的原因主要是心臟泵血功能喪失或心律不齊。嚴(yán)重的心衰患者一年期死亡率超過(guò)50％。雖然晚期患者可以進(jìn)行心臟移植，然而由于供體器官缺乏，約有20％的病人在等待器官移植的過(guò)程中死亡。由于心力衰竭的高發(fā)病率和死亡率、移植心臟的死亡、免疫排斥反應(yīng)等并發(fā)癥以及移植心臟后期失效等客觀現(xiàn)狀，亟待發(fā)展新的治療方法以提高心肌細(xì)胞的功能，阻止心力衰竭的發(fā)生。目前對(duì)心力衰竭的治療方法主要集中于早期血管再生和抑制進(jìn)一步的心肌細(xì)胞損失，而心肌細(xì)胞是一種終端分化的細(xì)胞，增殖能力極其有限，損失后極難恢復(fù)。而心肌細(xì)胞移植療法著重于重建心肌功能，恢復(fù)再生心肌組織的泵血能力，也有研究發(fā)現(xiàn)注入心臟的心肌細(xì)胞能夠形成新的心肌組織。但細(xì)胞移植治療關(guān)鍵因素是確定合適的供體細(xì)胞類型。因此，如何誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化為心肌細(xì)胞以用于醫(yī)藥治療是亟待解決的技術(shù)難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法及其應(yīng)用。

本發(fā)明提出的一種人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法，包括如下步驟：將人胎盤亞全能干細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔接種于含有干細(xì)胞培養(yǎng)液的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，將干細(xì)胞培養(yǎng)液去除，再加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)28天，每3天換液。

優(yōu)選地，干細(xì)胞培養(yǎng)液包括：DMEM培養(yǎng)基、羥乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氫鉀、二乙胺四乙酸鈉鹽、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、透明質(zhì)酸、?；撬?、胎盤生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黃芪多糖、黨參多糖、大棗多糖。

優(yōu)選地，干細(xì)胞培養(yǎng)液中，羥乙基淀粉的濃度為3～3.5g/L，人血清白蛋白的濃度為1.8～2.3g/L，碳酸氫鉀的濃度為0.5～0.6g/L，二乙胺四乙酸鈉鹽的濃度為0.3～0.6μg/L，亞硒酸鈉的濃度為0.2～0.5μg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為50～100mg/L，透明質(zhì)酸的濃度為2～5μg/L，牛磺酸的濃度為5～8μg/L，胎盤生長(zhǎng)因子的濃度為10～20μg/L，成纖維細(xì)胞因子的濃度為10～20μg/L，谷胱甘肽的濃度為50～80mg/L，硫辛酸的濃度為15～25mg/L，黃芪多糖的濃度為20～40mg/L，黨參多糖的濃度為30～60mg/L，大棗多糖的濃度為40～80mg/L。

優(yōu)選地，心肌細(xì)胞培養(yǎng)液包括：RPMI-1640培養(yǎng)基，海藻糖，?；撬?，成纖維生長(zhǎng)因子，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，碳酸氫鉀，氨基酸螯合硒，谷氨酰胺，黃體酮，輔酶I，硫辛酸，丹酚酸B，黃精多糖，人參皂苷。

優(yōu)選地，心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中，海藻糖的濃度為2.5～3.5g/L，?；撬岬臐舛葹?～1.2g/L，成纖維生長(zhǎng)因子的濃度為25～40mg/L，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為20～30μg/L，碳酸氫鉀的濃度為0.8～1.3g/L，氨基酸螯合硒的濃度為1～2μg/L，谷氨酰胺的濃度為50～80mg/L，黃體酮的濃度為10～20mg/L，輔酶I的濃度為60～120μg/L，硫辛酸的濃度為15～25mg/L，維生素的濃度為50～100mg/L，丹酚酸B的濃度為20～40mg/L，黃精多糖的濃度為15～30mg/L，人參皂苷的濃度為30～50mg/L。

本發(fā)明還提出的一種心肌細(xì)胞，采用上述人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法制得。

本發(fā)明還提出的上述心肌細(xì)胞用于制備預(yù)防或治療心肌細(xì)胞功能障礙疾病的藥物組合物。

本發(fā)明能夠?qū)⑷颂ケP亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞，所得心肌細(xì)胞具有正常心肌細(xì)胞特異性分子標(biāo)簽，并且具有正常心肌的功能，為再生醫(yī)學(xué)的細(xì)胞來(lái)源問(wèn)題提供一種新的途徑。

具體實(shí)施方式

下面，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

實(shí)施例1

本發(fā)明提出的一種人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法，包括如下步驟：將人胎盤亞全能干細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔接種于含有干細(xì)胞培養(yǎng)液的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，將干細(xì)胞培養(yǎng)液去除，再加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)28天，每3天換液。

干細(xì)胞培養(yǎng)液包括：DMEM培養(yǎng)基、羥乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氫鉀、二乙胺四乙酸鈉鹽、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、透明質(zhì)酸、?；撬帷⑻ケP生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黃芪多糖、黨參多糖、大棗多糖。其中羥乙基淀粉的濃度為3.2g/L，人血清白蛋白的濃度為2/L，碳酸氫鉀的濃度為0.55g/L，二乙胺四乙酸鈉鹽的濃度為0.4μg/L，亞硒酸鈉的濃度為0.4μg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為70mg/L，透明質(zhì)酸的濃度為3.5μg/L，?；撬岬臐舛葹?μg/L，胎盤生長(zhǎng)因子的濃度為15μg/L，成纖維細(xì)胞因子的濃度為15μg/L，谷胱甘肽的濃度為65mg/L，硫辛酸的濃度為20mg/L，黃芪多糖的濃度為30mg/L，黨參多糖的濃度為50mg/L，大棗多糖的濃度為60mg/L。

心肌細(xì)胞培養(yǎng)液包括：RPMI-1640培養(yǎng)基，海藻糖，?；撬幔衫w維生長(zhǎng)因子，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，碳酸氫鉀，氨基酸螯合硒，谷氨酰胺，黃體酮，輔酶I，硫辛酸，丹酚酸B，黃精多糖，人參皂苷。其中海藻糖的濃度為3g/L，?；撬岬臐舛葹?.1g/L，成纖維生長(zhǎng)因子的濃度為32mg/L，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為25μg/L，碳酸氫鉀的濃度為1g/L，氨基酸螯合硒的濃度為1.5μg/L，谷氨酰胺的濃度為70mg/L，黃體酮的濃度為15mg/L，輔酶I的濃度為90μg/L，硫辛酸的濃度為20mg/L，維生素的濃度為75mg/L，丹酚酸B的濃度為30mg/L，黃精多糖的濃度為20mg/L，人參皂苷的濃度為40mg/L。

實(shí)施例2

本發(fā)明提出的一種人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法，包括如下步驟：將人胎盤亞全能干細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔接種于含有干細(xì)胞培養(yǎng)液的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，將干細(xì)胞培養(yǎng)液去除，再加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)28天，每3天換液。

干細(xì)胞培養(yǎng)液包括：DMEM培養(yǎng)基、羥乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氫鉀、二乙胺四乙酸鈉鹽、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、透明質(zhì)酸、?；撬?、胎盤生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黃芪多糖、黨參多糖、大棗多糖。其中羥乙基淀粉的濃度為3g/L，人血清白蛋白的濃度為2.3g/L，碳酸氫鉀的濃度為0.5g/L，二乙胺四乙酸鈉鹽的濃度為0.6μg/L，亞硒酸鈉的濃度為0.2μg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為100mg/L，透明質(zhì)酸的濃度為2μg/L，牛磺酸的濃度為8μg/L，胎盤生長(zhǎng)因子的濃度為10μg/L，成纖維細(xì)胞因子的濃度為20μg/L，谷胱甘肽的濃度為50mg/L，硫辛酸的濃度為25mg/L，黃芪多糖的濃度為20mg/L，黨參多糖的濃度為60mg/L，大棗多糖的濃度為40mg/L。

心肌細(xì)胞培養(yǎng)液包括：RPMI-1640培養(yǎng)基，海藻糖，牛磺酸，成纖維生長(zhǎng)因子，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，碳酸氫鉀，氨基酸螯合硒，谷氨酰胺，黃體酮，輔酶I，硫辛酸，丹酚酸B，黃精多糖，人參皂苷。其中海藻糖的濃度為3.5g/L，?；撬岬臐舛葹?g/L，成纖維生長(zhǎng)因子的濃度為40mg/L，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為20μg/L，碳酸氫鉀的濃度為1.3g/L，氨基酸螯合硒的濃度為1μg/L，谷氨酰胺的濃度為80mg/L，黃體酮的濃度為10mg/L，輔酶I的濃度為120μg/L，硫辛酸的濃度為15mg/L，維生素的濃度為100mg/L，丹酚酸B的濃度為20mg/L，黃精多糖的濃度為30mg/L，人參皂苷的濃度為30mg/L。

實(shí)施例3

本發(fā)明提出的一種人胎盤亞全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的方法，包括如下步驟：將人胎盤亞全能干細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔接種于含有干細(xì)胞培養(yǎng)液的24孔板中，待細(xì)胞貼壁后，將干細(xì)胞培養(yǎng)液去除，再加入心肌細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)28天，每3天換液。

干細(xì)胞培養(yǎng)液包括：DMEM培養(yǎng)基、羥乙基淀粉、人血清白蛋白、碳酸氫鉀、二乙胺四乙酸鈉鹽、亞硒酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、透明質(zhì)酸、牛磺酸、胎盤生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞因子、谷胱甘肽、硫辛酸、黃芪多糖、黨參多糖、大棗多糖。其中羥乙基淀粉的濃度為3.5g/L，人血清白蛋白的濃度為1.8g/L，碳酸氫鉀的濃度為0.6g/L，二乙胺四乙酸鈉鹽的濃度為0.3μg/L，亞硒酸鈉的濃度為0.5μg/L，轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為50mg/L，透明質(zhì)酸的濃度為5μg/L，?；撬岬臐舛葹?μg/L，胎盤生長(zhǎng)因子的濃度為20μg/L，成纖維細(xì)胞因子的濃度為10μg/L，谷胱甘肽的濃度為80mg/L，硫辛酸的濃度為15mg/L，黃芪多糖的濃度為40mg/L，黨參多糖的濃度為30mg/L，大棗多糖的濃度為80mg/L。

心肌細(xì)胞培養(yǎng)液包括：RPMI-1640培養(yǎng)基，海藻糖，?；撬?，成纖維生長(zhǎng)因子，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，碳酸氫鉀，氨基酸螯合硒，谷氨酰胺，黃體酮，輔酶I，硫辛酸，丹酚酸B，黃精多糖，人參皂苷。其中海藻糖的濃度為2.5g/L，?；撬岬臐舛葹?.2g/L，成纖維生長(zhǎng)因子的濃度為25mg/L，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為30μg/L，碳酸氫鉀的濃度為0.8g/L，氨基酸螯合硒的濃度為2μg/L，谷氨酰胺的濃度為50mg/L，黃體酮的濃度為20mg/L，輔酶I的濃度為60μg/L，硫辛酸的濃度為25mg/L，維生素的濃度為50mg/L，丹酚酸B的濃度為40mg/L，黃精多糖的濃度為15mg/L，人參皂苷的濃度為50mg/L。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。