本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種外胚層干細(xì)胞系及其建立方法與用途。
背景技術(shù)：
：哺乳動(dòng)物胚胎早期發(fā)育是一個(gè)快速而有序的過(guò)程。從內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(InnerCellMass,ICM)形成到胚胎著床的過(guò)程中，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞發(fā)育分化為上胚層(Epiblast)。上胚層經(jīng)原腸運(yùn)動(dòng)分化成為外胚層(Ectoderm)、中胚層(Mesoderm)和內(nèi)胚層(Endoderm)。其中，外胚層可進(jìn)一步分化為神經(jīng)和表皮等終末分化的組織。由于外胚層缺乏標(biāo)記基因，并且其發(fā)育過(guò)程的時(shí)間窗口短暫，目前對(duì)于外胚層譜系發(fā)育的研究相對(duì)較少。由于原腸運(yùn)動(dòng)時(shí)期小鼠胚胎個(gè)體極小，較難獲取足夠量的處于這一發(fā)育時(shí)期的胚胎材料，因此大多數(shù)早期發(fā)育的研究在小鼠多能干細(xì)胞系(Pluripotentstemcells,PSCs)的體外分化模型中展開(Rossant,2008)。目前從小鼠的早期胚胎可以獲得兩種多能干細(xì)胞系，分別為小鼠胚胎干細(xì)胞系(EmbryonicStemCells,ESCs)和小鼠上胚層干細(xì)胞系(Epiblaststemcells,EpiSCs)。ESCs來(lái)源于E3.5的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(EvansandKaufman,1981)，EpiSCs來(lái)源于E5.5-E6.5的上胚層(Bronsetal.,2007)，都是具有三胚層分化潛力的多能干細(xì)胞系。目前尚沒(méi)有建立對(duì)應(yīng)于外胚層的細(xì)胞系，對(duì)外胚層發(fā)育的分子機(jī)制研究造成了不便。我們實(shí)驗(yàn)室2010年研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)整外部信號(hào)通路的方法，可以從胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)得到上胚層干細(xì)胞(ESCderivedEpiSCs,ESD-EpiSCs)(Zhangetal.,2010)，提示體外的多能性干細(xì)胞系能夠響應(yīng)外部信號(hào)定向分化，模擬體內(nèi)的發(fā)育過(guò)程。我們實(shí)驗(yàn)室最新的研究發(fā)現(xiàn)，抑制ESD-EpiSCs的Activin/Nodal信號(hào)通路18個(gè)小時(shí)后可以得到外胚層前體細(xì)胞，這種外胚層前體細(xì)胞具有受BMP4調(diào)控分化成為神經(jīng)和表皮的潛能(Lietal.,2015)。但是，外胚層前體細(xì)胞不能在體外自我更新和增殖。并且這種誘導(dǎo)得到的類似于外胚層的狀態(tài)非常短暫，只能維持幾個(gè)小時(shí)，因此其應(yīng)用價(jià)值就受到了一定的限制。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種外胚層干細(xì)胞系及其 建立方法與用途。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：本發(fā)明的第一方面，提供了SB431542和bFGF在體外構(gòu)建外胚層干細(xì)胞中的用途。優(yōu)選地，所述用途具體是指在上胚層干細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中加入SB431542和bFGF，將上胚層干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為外胚層干細(xì)胞。優(yōu)選地，所述上胚層干細(xì)胞來(lái)自哺乳動(dòng)物。更優(yōu)選地，來(lái)自鼠。更優(yōu)選地，來(lái)自小鼠。上述SB431542和bFGF均可通過(guò)市售途徑獲得。其中，SB431542的CAS號(hào)為301836-41-9。本發(fā)明的第二方面，提供一種體外構(gòu)建外胚層干細(xì)胞系的方法，包括步驟：在上胚層干細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中加入SB431542和bFGF。優(yōu)選地，將SB431542和bFGF加入上胚層干細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。更優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為CDM。更優(yōu)選地，每1000ml所述CDM培養(yǎng)基中含有：500mlIMDM，500mlF12，7㎎Insulin，15㎎轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin)，450μmol硫代甘油，以及5gBSA。優(yōu)選地，加入的SB431542在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的終濃度為2-10μM。加入的bFGF在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的終濃度為10-20ng/ml。優(yōu)選地，所述上胚層干細(xì)胞來(lái)自哺乳動(dòng)物。更優(yōu)選地，來(lái)自鼠。更優(yōu)選地，來(lái)自小鼠。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供所述體外構(gòu)建外胚層干細(xì)胞系的方法在干細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明的第三方面，提供了一種外胚層干細(xì)胞系，由前述方法構(gòu)建獲得。本發(fā)明的第四方面，提供了一種用于體外構(gòu)建胚胎干細(xì)胞的組合物，所述組合物包括上胚層干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、SB431542和bFGF。優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為CDM。更優(yōu)選地，每1000ml所述CDM培養(yǎng)基中含有：500mlIMDM，500mlF12，7㎎Insulin，15㎎轉(zhuǎn)鐵蛋白transferrin，450μmol硫代甘油，以及5gBSA。優(yōu)選地，SB431542在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的終濃度為2-10μM。bFGF在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的終濃度為10-20ng/ml。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)，在上胚層干細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中加入SB431542和bFGF，將上胚層干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為外胚層干細(xì)胞。通過(guò)此方法構(gòu)建獲得的外胚層干細(xì)胞，可以連續(xù)傳代40代以上，并保持類似于上胚層干細(xì)胞的形態(tài)，具有外胚層的分化潛能。所述外胚層干細(xì)胞在 不加BMP4的條件下也同樣可以很快分化到神經(jīng)命運(yùn)，神經(jīng)標(biāo)記基因的表達(dá)比上胚層干細(xì)胞分化得到的神經(jīng)前體細(xì)胞略高。在添加BMP4的條件下，外胚層干細(xì)胞能夠向表皮分化，并且表皮標(biāo)記基因的表達(dá)水平比上胚層干細(xì)胞分化得到的表皮前體細(xì)胞高很多。，外胚層干細(xì)胞在添加BMP4的條件下，不能向中內(nèi)胚層分化，中內(nèi)胚層的標(biāo)記基因的表達(dá)不能上調(diào)，始終保持很低的表達(dá)水平。亦即，所述外胚層干細(xì)胞在分化能力上更類似于外胚層，缺乏分化成為中內(nèi)胚層的能力，但是向表皮分化的能力與上胚層干細(xì)胞相比更強(qiáng)。相比于多能性的上胚層干細(xì)胞，本發(fā)明的外胚層多能干細(xì)胞其分化潛能更加特化。附圖說(shuō)明圖1：從上胚層干細(xì)胞建立外胚層干細(xì)胞系的建系流程示意圖，將上胚層干細(xì)胞培養(yǎng)在SB43+bFGF的條件下，每?jī)商靷饕淮D2：在體外傳代過(guò)程中，外胚層干細(xì)胞的形態(tài)和上胚層干細(xì)胞的形態(tài)類似。圖3：外胚層干細(xì)胞的基因表達(dá)譜和胚胎發(fā)育時(shí)間及空間上的對(duì)應(yīng)：(A)收取E5.5，E6.0，E6.5，E7.0，E7.5的小鼠胚胎，分取不同區(qū)域的組織，進(jìn)行RNA擴(kuò)增，然后做RNA測(cè)序分析；(B)外胚層干細(xì)胞的基因表達(dá)譜和胚胎各時(shí)期各區(qū)域的基因表達(dá)譜的皮爾森相關(guān)系數(shù)熱圖；(C)將B圖的對(duì)應(yīng)結(jié)果投射在胚胎上的示意圖。圖4：外胚層干細(xì)胞的體外分化潛能：將上胚層干細(xì)胞和外胚層干細(xì)胞分別在KSR培養(yǎng)液中進(jìn)行成團(tuán)分化4天，分別不添加BMP4和添加BMP4，不添加BMP4向神經(jīng)外胚層分化，添加BMP4向中內(nèi)胚層和表皮分化；收取第2天和第4天的樣品進(jìn)行Q-PCR檢測(cè)各類標(biāo)記基因的表達(dá)變化趨勢(shì)，(A-C)：神經(jīng)外胚層的標(biāo)記基因Sox1，Zfp521，Nestin；(D-F)：表皮標(biāo)記基因Ck18，Ck8，Ck19；(G-I)：中內(nèi)胚層標(biāo)記基因Flk1，Gata6，Sox17。圖5：(A)免疫熒光檢測(cè)分化到第4天的細(xì)胞團(tuán)里神經(jīng)外胚層標(biāo)記基因Tuj1和Nestin，表皮標(biāo)記基因Ck18，中內(nèi)胚層標(biāo)記基因Flk1和Nkx2.5的表達(dá)情況；(B)對(duì)A圖的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。具體實(shí)施方式以下通過(guò)特定的具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說(shuō)明書所揭 露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過(guò)另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說(shuō)明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒(méi)有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語(yǔ)是為了描述特定的具體實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍；在本發(fā)明說(shuō)明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個(gè)”、“一”和“這個(gè)”包括復(fù)數(shù)形式。當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說(shuō)明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)與本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外，根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來(lái)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說(shuō)明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測(cè)方法、制備方法均采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說(shuō)明，具體可參見Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。實(shí)施例1從小鼠上胚層干細(xì)胞建立外胚層干細(xì)胞依據(jù)體內(nèi)早期胚胎發(fā)育研究基礎(chǔ)，我們?cè)谏吓邔痈杉?xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基CDM(Chemicallydefinedmedium)中添加Nodal抑制劑SB431542和bFGF信號(hào)通路因子，將小鼠上胚層干細(xì)胞(Epiblaststemcells,EpiSCs)誘導(dǎo)為外胚層干細(xì)胞(Ectodermstemcells,EctSCs)。上胚層干細(xì)胞的制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，可參照：Brons,I.G.,etal.,Derivationofpluripotentepiblaststemcellsfrommammalianembryos.Nature,2007.448(7150):p.191-5.具體方法為，先將小鼠上胚層干細(xì)胞用四型膠原酶消化成小塊，然后將細(xì)胞團(tuán)塊以大約1.5×105密度種在由血清(FBS)包被過(guò)夜并用PBS漂洗兩次的的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為含有SB431542(2μM))及bFGF(10ng/ml)的CDM，所述CDM的配方為50mlIMDM，50mlF12，添加7μg/mlInsulin，15μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白transferrin，450μM硫代甘油，以及5mg/mlBSA。兩天后以大約1.5×105的密度傳代，繼續(xù)培養(yǎng)在含有SB431542(2μM))及bFGF(10ng/ml)的CDM中(如圖1所示)。所得到的外胚層干細(xì)胞能夠在體外穩(wěn)定傳代40代以上，并保持類似于上胚層干細(xì)胞的形態(tài)，均為柱狀上皮細(xì)胞，核質(zhì)比大的干細(xì)胞形態(tài)(如圖2所示)。此外，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CDM中，所添加的SB431542的終濃度為2-10μM，bFGF的終濃度為10-20ng/ml時(shí)，均能夠較好地將上胚層干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為外胚層干細(xì)胞。實(shí)施例2外胚層干細(xì)胞系在基因表達(dá)譜上與小鼠外胚層類似為了研究實(shí)施例所得到的外胚層干細(xì)胞對(duì)應(yīng)于小鼠胚胎的哪一個(gè)時(shí)期和哪一個(gè)位置，我們對(duì)所得外胚層干細(xì)胞的基因表達(dá)譜和胚胎各時(shí)期各區(qū)域組織的基因表達(dá)譜進(jìn)行皮爾森相關(guān)系數(shù)分析。相關(guān)系數(shù)熱圖反映出不同細(xì)胞狀態(tài)對(duì)應(yīng)的胚胎位置。結(jié)果顯示，外胚層干細(xì)胞對(duì)應(yīng)于E7.0胚胎的AP部分，以及E7.5胚胎的AP和AD部分(如圖3B-C所示)。E是Embryonicday的簡(jiǎn)稱，E5.5就是胚胎發(fā)育5.5天的意思。具體方法為如下：胚胎解剖與分區(qū)我們對(duì)E5.5，E6.0，E6.5，E7.0，E7.5天的胚胎進(jìn)行解剖和切割，把E5.5和E6.0的胚胎分成上胚層(Epiblast)和胚外(ExE)部分。E6.5的胚胎將ExE分離后，又將上胚層分為前端(Anterior,A)和后端(Posterior,P)部分，共三個(gè)部分。E7.0和E7.5的胚胎將ExE分離后，又將上胚層分為前端近軸端(Anteriorproximal,AP),前端遠(yuǎn)軸端(Anteriordistal,AD)和后端(Posterior,P)部分,共四個(gè)部分(如圖3A所示)。然后將除去ExE之后的10個(gè)胚胎組織樣品做RNA擴(kuò)增和RNA測(cè)序分析。實(shí)驗(yàn)步驟如下：RNA擴(kuò)增和RNA測(cè)序分析(1)樣品裂解及RNA提取(a)向每個(gè)收集管中加入50μl4M異硫氰酸胍(GuanidineIsothiocyanate)溶液。(b)將收集管放于42℃烘箱中加熱15分鐘。(c)7000rpm4℃離心30秒，使裂解液離心到管底。注意離心速度不宜過(guò)高。(d)將裂解液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入150μlnuclease-free水，600μl無(wú)水乙醇，20μl醋酸鈉(1.5M,pH5.5)以及1μl糖原(20mg/ml)。(e)混合均勻后，放于-80℃至少30分鐘(-80℃可以放置過(guò)夜)。(f)12000rpm4℃離心30分鐘。(g)去掉上清，75％乙醇(nuclease-free水配制)洗一遍。(h)12000rpm4℃離心10分鐘，去上清。用槍頭吸盡殘余液體，室溫下使沉淀徹底干燥。干燥后立即進(jìn)行下一步溶解步驟。(2)RNA溶解及變性(a)按下表配制溶解buffer，放置于冰上：ComponentVolume(μl)FinalconcentrationNuclease-freewater1.453’CDSprimer(10μM)11μMdNTP(10mM)11mMRNaseinhibitor(40Uμl-1)0.052UTotalvolume3.45注：3’CDSprimer的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，具體為：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3’。其中3’端,‘N’代表任意堿基，‘V’為A,C或G的任意一個(gè)。(b)取3.45μl溶解buffer加到上面的沉淀中，用槍頭反復(fù)吹打使沉淀完全溶解。注意不要產(chǎn)生氣泡，然后將溶解的RNA全部轉(zhuǎn)移到0.2ml薄壁PCR管中。(c)于PCR儀中72℃加熱3分鐘使RNA變性，結(jié)束后立即轉(zhuǎn)移到冰上冷卻。(d)7000rpm4℃離心30秒。(3)反轉(zhuǎn)錄(a)按下表配制反轉(zhuǎn)錄體系ComponentVolume(μl)FinalconcentrationSuperScriptIIreversetranscriptase(200Uμl-1)0.5100URNAseinhibitor(40Uμl-1)0.2510USuperscriptIIfirst-strandbuffer(5×)21XDTT(100mM)0.55mMBetaine(5M)21MMgCl2(1M)0.099mMLNA-TSOprimer(10μM)11μMNulease-freewater0.21Totalvolume6.55注：LNA-TSOprimer的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示，具體為：5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3’。在其3’端有兩個(gè)核糖核酸堿基(rG)以及一個(gè)LNA修飾的鳥嘌呤(+G)。(b)取6.55μlRTmixture加到上述變性的RNA溶液中。(c)7000rpm4℃離心30秒。(d)按以下程序進(jìn)行RT反應(yīng)注：SuperScriptII反轉(zhuǎn)錄酶活性溫度為42℃，溫度較低，部分RNA高級(jí)結(jié)構(gòu)(如發(fā)卡結(jié)構(gòu)，RNA環(huán))等無(wú)法完全打開。因此有額外10個(gè)循環(huán)的變性-反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使RNA反轉(zhuǎn)錄完全。最后70℃15min使反轉(zhuǎn)錄酶失活。(e)7000rpm4℃離心30秒。(4)cDNA預(yù)擴(kuò)增(a)按下面表格配置PCR擴(kuò)增體系ComponentVolume(μl)FinalconcentrationKAPAHiFiHotStartReadyMix(2×)251XA-ISPCRprimers(10μM)10.1μMNuclease-freewater14Totalvolume40注：A-ISPCRprimer的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，具體為：5’-(NH2)AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’，在其5’端堿基的C6處有一個(gè)氨基(NH2)修飾。(b)向反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA中加入40μlPCRmix，混合均勻。7000rpm4℃離心30秒。(c)按照以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增注：PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行適當(dāng)修改。用于胚胎組織使用15個(gè)循環(huán)。(5)PCR質(zhì)量檢測(cè)(a)取2μlPCR產(chǎn)物，稀釋20倍。(d)Real-timeQ-PCR檢測(cè)內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)。若GAPDH的Ct值大于22，則表明擴(kuò)增結(jié)果不理想，樣品質(zhì)量無(wú)法滿足進(jìn)行測(cè)序要求。此外，還可以檢測(cè)一些樣品特異性表達(dá)的基因，檢測(cè)這些基因的表達(dá)是否正常。(e)其余樣品進(jìn)行下一步操作或-80℃保存。(6)cDNA樣品的磁珠純化(a)將AmpureXP磁珠由4℃拿出，使其達(dá)到室溫平衡，震蕩使其混合均勻。(b)每一個(gè)cDNA產(chǎn)物(約48μl)中加入38μl磁珠(磁珠：cDNA體積比約為0.8：1)。用槍吹打使其混合均勻。室溫孵育8分鐘使cDNA結(jié)合到磁珠上。(c)將裝有cDNA-磁珠混合液的PCR管放到磁力架上，靜置5分鐘以上，使液體澄清。(d)用槍小心吸盡上清液，避免磁珠被吸走。(e)加入200μl新鮮配制的80％乙醇，磁力架上靜置40秒后吸掉乙醇。(f)重復(fù)步驟(e)一次。(g)1000rpm離心10秒，使殘留的液體聚集到PCR管底部。(h)將PCR管重新放回磁力架，用小槍頭吸盡殘余液體。(i)打開PCR管蓋，室溫放置約3-5分鐘，使乙醇揮發(fā)干凈。(j)向PCR管中加入16μl0.1XTE，用槍吹使磁珠在TE溶液中混勻。室溫孵育2分鐘， 使磁珠上的cDNA溶解。(k)將PCR管重新放回磁力架上，靜置2分鐘使液體澄清。(l)用小槍頭小心吸出液體，轉(zhuǎn)移到新的EP管中，注意不要吸走磁珠。(7)純化后樣品質(zhì)量檢測(cè)(a)取1μl樣品，用QuibitdsDNAHSAssayKit測(cè)定純化后樣品濃度。一般樣品濃度要達(dá)到0.2ng/μl以上。(b)取1μl樣品，用Agilent2100high-sensitivityDNA芯片檢測(cè)cDNA樣品片段大小分布。cDNA樣品片段分布應(yīng)集中在1.5-2kb左右，且沒(méi)有500bp以下片段出現(xiàn)。(8)樣品建庫(kù)及測(cè)序建庫(kù)及測(cè)序部分由測(cè)序公司(北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司)完成。皮爾森相關(guān)系數(shù)分析(a)使用R分析軟件對(duì)早期胚胎切割的10個(gè)樣品2個(gè)細(xì)胞系(EpiSCs和EctSCs)的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，計(jì)算出差異表達(dá)基因。(b)計(jì)算每個(gè)細(xì)胞系與胚胎所有不同區(qū)域之間差異表達(dá)基因的皮爾森相關(guān)系數(shù)(PearsonCorrelationCoefficients,PCC)。(c)根據(jù)皮爾森相關(guān)系數(shù)繪制出相關(guān)系數(shù)熱圖。實(shí)施例3外胚層干細(xì)胞系能夠在體外分化系統(tǒng)中特異地向神經(jīng)和表皮分化為了考察外胚層干細(xì)胞是否具有外胚層的分化潛能，我們將上胚層干細(xì)胞和外胚層干細(xì)胞分別在不加BMP4的培養(yǎng)液(G-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加8％KSR,2mMglutamine,1mMpyruvate,0.1mMnonessentialaminoacids,and0.1mMβ-mercaptoethanol)里懸浮培養(yǎng)成細(xì)胞團(tuán)(EB)做神經(jīng)分化，或在添加BMP4的培養(yǎng)液里懸浮培養(yǎng)成細(xì)胞團(tuán)做表皮分化。我們發(fā)現(xiàn)，上胚層干細(xì)胞具有多能性，在不加BMP4的條件下可以很快分化到神經(jīng)命運(yùn)。而在添加BMP4的條件下則可以向表皮和中內(nèi)胚層分化。外胚層干細(xì)胞在不加BMP4的條件下也同樣可以很快分化到神經(jīng)命運(yùn)，神經(jīng)標(biāo)記基因的表達(dá)比上胚層干細(xì)胞分化得到的神經(jīng)前體細(xì)胞略高。在添加BMP4的條件下，外胚層干細(xì)胞能夠向表皮分化，并且表皮標(biāo)記基因的表達(dá)水平比上胚層干細(xì)胞分化得到的表皮前體細(xì)胞高很多。有意思的是，外胚層干細(xì)胞在添加BMP4的條件下，不能向中內(nèi)胚層分化，中內(nèi)胚層的標(biāo)記基因的表達(dá)不能上調(diào)，始終保持很低的表達(dá)水平(如圖4所示)。具體實(shí)驗(yàn)方法為：RNA的抽提收取相應(yīng)天數(shù)的細(xì)胞樣品。加入1mlTrizol，冰上放置10min。轉(zhuǎn)移到1.5mlRNase-free的離心管中，Vortex混勻，加入200μlRNase-free氯仿，用力混勻，放置3min。12,000g，4℃離心15min。吸取上清，加入等體積異丙醇，室溫放置10min。12,000g，4℃離心10min。棄上清，加入1ml70％的無(wú)水乙醇洗鹽。7500g，4℃離心5min，棄上清，晾干。加的DEPC水溶解RNA，取1μl通過(guò)Nanotrop分光光度計(jì)進(jìn)行定量。反轉(zhuǎn)錄RNA并擴(kuò)增(RT-PCR)：取2.5μgRNA，加1μlrandomprimer(Takara)，補(bǔ)RNase-free水至12.5μl，置于PCR儀中65℃，10min，然后取出冰浴5min。加入4μl5×firststrandbuffer，2μlDTT，1μl10mMdNTP，0.5μlSuperScriptIIIRNaseH-逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen)，按下列程序繼續(xù)反應(yīng)：25℃，10min；50℃，60min；70℃，10min。反應(yīng)后將RT-PCR產(chǎn)物稀釋至200μl，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)考察看家基因GPADH或β-actin的表達(dá)驗(yàn)證RT效果。反應(yīng)體系(10μl)PCRbuffer1μl2mMdNTP1μl20μMprimer(5’+3’)1μlcDNAtemplate2μlTaqenzyme0.1μld2H2O4.9μl反應(yīng)條件：定量PCR(Q-PCR)(參考相關(guān)試劑說(shuō)明書)反應(yīng)體系(20ul)：2×TaqMixture10μlEvagreen1μl20μMprimer(5’+3’)1μlcDNAtemplate3μld2H2O5μl所用引物的序列序列如下表所示：反應(yīng)條件：免疫染色的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，體外分化4天之后，在不添加BMP4，向神經(jīng)分化的條件下，上胚層干細(xì)胞和外胚層干細(xì)胞都能夠向神經(jīng)命運(yùn)特化，能夠高效地分化成為神經(jīng)標(biāo)記基因Tuj1和Nestin陽(yáng)性的神經(jīng)前體細(xì)胞，外胚層干細(xì)胞的神經(jīng)分化效率略高于上胚層。在添加BMP4的分化體系中，外胚層干細(xì)胞能夠高效地分化為Ck18陽(yáng)性的表皮細(xì)胞，其分化效率顯著高于上胚層干細(xì)胞。上胚層干細(xì)胞能夠在添加BMP4的分化體系中高效地分化為Flk1和Nkx2.5陽(yáng)性的中內(nèi)胚層細(xì)胞，而外胚層干細(xì)胞則不能分化成為Flk1和Nkx2.5陽(yáng)性的中內(nèi)胚層細(xì)胞(如圖5所示)。上述結(jié)果提示外胚層干細(xì)胞在分化能力上更類似于外胚層，缺乏分化成為中內(nèi)胚層的能力，但是向表皮分化的能力與上胚層干細(xì)胞相比更強(qiáng)。相比于多能性的上胚層干細(xì)胞，其分化潛能更加特化。免疫染色的具體實(shí)驗(yàn)方法如下：(1)細(xì)胞團(tuán)的固定用巴斯德吸管吸取懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)，轉(zhuǎn)移到離心管中，使其自然沉降。小心吸去上清，1×PBS洗細(xì)胞團(tuán)2次，盡量通過(guò)自然沉降，不要離心。4℃，4％PFA固定細(xì)胞團(tuán)1hr，1×PBS洗細(xì)胞團(tuán)1次。棄PBS，加入20％蔗糖4℃平衡細(xì)胞團(tuán)，2-3hr后細(xì)胞沉到管底，即可切片。若不及時(shí)切片，則包埋后轉(zhuǎn)移至-80℃保存。(2)細(xì)胞團(tuán)的冰凍切片用OCT包埋細(xì)胞團(tuán)，注意包埋時(shí)蔗糖溶液盡量少。冰凍切片，厚度為10μm。切片在室溫放置1-2hr，使切片晾干后轉(zhuǎn)移到-20℃或者-80℃保存。(3)細(xì)胞團(tuán)的免疫染色從冰箱中取出切片，在室溫放置10min,使切片上的水汽晾干。在1×PBS中浸泡10min，使OCT溶解在1×PBS中。在玻片上均勻滴加含0.1％TritonX-100，0.5％NGS,1％BSA的 封閉液，在玻片上蓋一片parafilm膜，使封閉液分布均勻，室溫封閉1hr。棄去封閉液，加1st抗體，4℃反應(yīng)過(guò)夜。1×PBS洗去未吸附的1st抗體，10min×3次。再加2nd抗體，室溫避光反應(yīng)2-3hr。1×PBS洗去未吸附的2nd抗體，10min×3次。而后DAPI染色，室溫3-5min，PBS洗一次。封片，室溫干燥過(guò)夜后4℃保存。以上的實(shí)施例是為了說(shuō)明本發(fā)明公開的實(shí)施方案，并不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。此外，本文所列出的各種修改以及發(fā)明中方法、組合物的變化，在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的前提下對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。雖然已結(jié)合本發(fā)明的多種具體優(yōu)選實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了具體的描述，但應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不應(yīng)僅限于這些具體實(shí)施例。事實(shí)上，各種如上所述的對(duì)本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的修改來(lái)獲取發(fā)明都應(yīng)包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3