本發(fā)明涉及用于細(xì)胞培養(yǎng)的支架及其制備方法，特別涉及一種靜電紡絲與3D打印技術(shù)相結(jié)合設(shè)計(jì)的用于模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的三維支架及制備方法。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞培養(yǎng)工作現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、毒理學(xué)、新藥研發(fā)、生物工程等各個(gè)領(lǐng)域，研究和觀察細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)的技術(shù)手段已成為生命研究的一種必要的篩選和預(yù)實(shí)驗(yàn)手段。目前，常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)模式包括二維細(xì)胞培養(yǎng)，是在細(xì)胞培養(yǎng)板如2、4、6、12、24、48、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板或細(xì)胞培養(yǎng)瓶、生物反應(yīng)器等中進(jìn)行，細(xì)胞在培養(yǎng)基中以一種二維方式單層貼壁生長。然而，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在體外二維培養(yǎng)的細(xì)胞的基因表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和形態(tài)學(xué)都可能與在生物體內(nèi)三維生長的細(xì)胞有差異。近年來，隨著技術(shù)發(fā)展，建立了多種三維方式的細(xì)胞培養(yǎng)方法，以便能夠充分模擬生物體內(nèi)環(huán)境，提供適宜細(xì)胞生長的環(huán)境。例如納米纖維支架和多孔支架三維培養(yǎng)(多孔磷酸鈣支架，聚乳酸支架，聚乳酸和乙交酯共聚物支架，膠原蛋白支架，海藻酸鈉支架等)，三維水凝膠支架培養(yǎng)(例如中國專利申請CN201110259019.4)，攪拌式、中空纖維、旋轉(zhuǎn)燒瓶培養(yǎng)等方法。其中，以靜電紡絲技術(shù)獲取的納米纖維支架因其具有極高的比表面積、高孔隙率和相互連通的三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu),能夠更好的模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),為種子細(xì)胞的生長和增殖提供良好的微環(huán)境,因此在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景(例如中國專利申請200480004293.5、CN200710134505.7、CN200910050507.7、CN201110397867.1)。然而，以靜電紡絲技術(shù)制備三維支架材料，由于其是在靜電作用下形成的紡絲膜，其厚度受到一定的限制，形成的紡絲膜較薄(通常為納米或微米級)，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，很難在不變形的情況下將其放到固定的培養(yǎng)容器中，也不利于后期對紡絲膜上的細(xì)胞進(jìn)行鑒定，同時(shí)操作不當(dāng)也會(huì)對紡絲膜造成一定程度上的損害。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的支架，能夠模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，且克服現(xiàn)有技術(shù)中三維支架不易操作、剛性差、易受損的缺陷。本發(fā)明的還一個(gè)目的是提供一種制作用于細(xì)胞培養(yǎng)的支架的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供了一種用于細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)合支架，包括支架結(jié)構(gòu)和支撐結(jié)構(gòu)，其中，所述支架結(jié)構(gòu)包括通過靜電紡絲方法制得的納米纖維膜，所述支撐結(jié)構(gòu)包括中部封閉、兩端分別具有端口一和端口二的空腔結(jié)構(gòu)，所述支架結(jié)構(gòu)貼合在所述支撐結(jié)構(gòu)端口一的端面上。優(yōu)選的，所述支架結(jié)構(gòu)為具有三維多孔結(jié)構(gòu)的納米纖維膜。優(yōu)選的，所述納米纖維的直徑為100～1000nm；更優(yōu)選為200～600nm。本發(fā)明中，所述支架結(jié)構(gòu)的材料選自以下組中的一種或多種：聚己內(nèi)酯、聚乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚碳酸酯、聚氨酯、聚磷酸酯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚酯酰胺、聚氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、膠原蛋白、殼聚糖、改性殼聚糖、淀粉、纖維素、改性纖維素、明膠、纖維蛋白、絲素蛋白、透明質(zhì)酸、海藻酸、硫酸軟骨素、肝素、瓊脂、葡聚糖、褐藻酸；優(yōu)選為聚己內(nèi)酯、聚乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、膠原蛋白中的一種或多種；更優(yōu)選為聚己內(nèi)酯、聚己內(nèi)酯-膠原蛋白混合物。優(yōu)選的，所述支架結(jié)構(gòu)通過粘接的方式進(jìn)行貼合。更優(yōu)選的，通過醫(yī)用膠黏劑進(jìn)行貼合。本發(fā)明中，所述貼合也可通過超聲或熔融焊接的方式進(jìn)行貼合；所述醫(yī)用膠黏劑可為非細(xì)胞毒性的聚合物材料，如聚氨酯、天然橡膠、丙烯酸酯、膠原蛋白等，具體可為，α-氰基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、骨水泥、芳香族多甲基丙烯酸聚氨酯等本領(lǐng)域常規(guī)醫(yī)用膠黏劑，本發(fā)明對此不作限定。優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)通過3D打印制作。本發(fā)明中支撐結(jié)構(gòu)也可通過注塑等方式制作。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，3D打印技術(shù)(又稱3D快速成型技術(shù)或增材制造技術(shù))是指在計(jì) 算機(jī)控制下，根據(jù)物體的計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD)模型或計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)等數(shù)據(jù)，通過材料的精確3D堆積，快速制造任意復(fù)雜形狀3D物體的新型數(shù)字化成型技術(shù)。其中，熔融沉積成型(FDM)是采用熱熔噴頭，使得熔融狀態(tài)的材料按計(jì)算機(jī)控制的路徑擠出、沉積，并凝固成型，經(jīng)過逐層沉積、凝固，最后除去支撐材料，得到所需的三維產(chǎn)品。該技術(shù)具有成型產(chǎn)品精度高、表面質(zhì)量好、成型機(jī)結(jié)構(gòu)簡單、無環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，可快速、準(zhǔn)確、簡便的制作所需形狀和構(gòu)造的支撐結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)做成適合細(xì)胞培養(yǎng)平板孔、培養(yǎng)室、培養(yǎng)瓶和/或生物反應(yīng)器的尺寸。具體的，所述支撐結(jié)構(gòu)可做成適合細(xì)胞培養(yǎng)平板孔的尺寸，例如2孔板、4孔板、6孔板、12孔板、24孔板、48孔板和96孔板。優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)的橫截面為圓形，縱截面為正方形、矩形或梯形。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉，所述支撐結(jié)構(gòu)的橫截面不僅限于圓形，也可為橢圓形、三角形、方形、矩形、規(guī)則多邊形等，只要其能與培養(yǎng)結(jié)構(gòu)匹配即可。例如，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)室為長方體時(shí)，支撐結(jié)構(gòu)截面為矩形。更優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)的橫截面為圓形，縱截面為梯形，且所述端口一的直徑小于端口二的直徑。本發(fā)明在設(shè)計(jì)支撐結(jié)構(gòu)的形狀和尺寸時(shí)，可參考細(xì)胞培養(yǎng)平板孔尺寸。通過將端口一的直徑設(shè)計(jì)為小于端口二的直徑，一方面，便于 在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對常規(guī)的二維培養(yǎng)和本發(fā)明三維培養(yǎng)進(jìn)行平行對比實(shí)驗(yàn)，支撐結(jié)構(gòu)在細(xì)胞培養(yǎng)平板孔中更穩(wěn)定、不易滑落；另一方面，采用該設(shè)計(jì)可以使納米纖維膜與培養(yǎng)器皿之間有一段距離，使細(xì)胞更好的形成三維結(jié)構(gòu)，也可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的共培養(yǎng)。例如，當(dāng)將復(fù)合支架置于6孔板進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，支撐結(jié)構(gòu)端口二的直徑可按照6孔板尺寸，端口一的直徑按照12孔板尺寸設(shè)計(jì)，此時(shí)復(fù)合支架中用于細(xì)胞培養(yǎng)的納米纖維膜的尺寸也與12孔板尺寸匹配，在進(jìn)行平行對比試驗(yàn)時(shí)，二維對比組采用12孔板即可。同理，置于12孔板時(shí)，端口二的直徑按照12孔板尺寸，端口一的直徑按照24孔板尺寸設(shè)計(jì)；置于24孔板時(shí)，端口二的直徑按照24孔板尺寸，端口一的直徑按照48孔板尺寸；依次類推。以上具體尺寸的說明不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，僅用于說明本發(fā)明技術(shù)方案的設(shè)計(jì)思路以舉例說明一些優(yōu)選的具體實(shí)施方式。優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)還包括一固定環(huán)，所述固定環(huán)套接在所述端口一外側(cè)。更優(yōu)選的，所述固定環(huán)為圓環(huán)，所述圓環(huán)內(nèi)壁設(shè)置有柱狀凸起，優(yōu)選的，所述柱狀凸起沿圓環(huán)內(nèi)壁周向均勻分布。本發(fā)明中，在支撐結(jié)構(gòu)上設(shè)置固定環(huán)，該固定環(huán)一方面可用于將納米纖維膜更好的固定在端面上，使其不脫落；另一方面，可以使納米纖維膜與培養(yǎng)器皿之間有一段距離，使細(xì)胞更好的形成三維結(jié)構(gòu)，也可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的共培養(yǎng)。優(yōu)選的，所述支撐結(jié)構(gòu)端口二包括向外延伸的邊緣，所述邊緣上設(shè)置有凸起，該凸起的作用是便于抓持和/或移動(dòng)所述支撐結(jié)構(gòu)，在 一個(gè)具體的實(shí)施方式凸起可為便于抓持的把手，可為條狀、柱狀、板狀，可為平整的或凹凸不平的，本發(fā)明對其形狀和結(jié)構(gòu)不作具體限定。本發(fā)明中，可將支撐結(jié)構(gòu)端口二的邊緣放置在細(xì)胞培養(yǎng)平板孔上，采用設(shè)置在其上的把手方便的移動(dòng)復(fù)合支架。本發(fā)明中，所述支撐結(jié)構(gòu)的材料包括非細(xì)胞毒性和不易降解的熱縮性高分子如：聚乳酸、聚左旋乳酸、ABS、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚磷酸酯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚酯酰胺、聚氧乙烷等。本發(fā)明中，所述復(fù)合支架可單獨(dú)使用，也可放入細(xì)胞培養(yǎng)器皿中配合使用。本發(fā)明中，對所述復(fù)合支架的使用形式不作限制，例如，當(dāng)將復(fù)合支架置于細(xì)胞培養(yǎng)平板孔中時(shí)，可獨(dú)立的將其置于任一培養(yǎng)孔中，也可將多個(gè)復(fù)合支架連接成一體式結(jié)構(gòu)，每個(gè)支撐結(jié)構(gòu)的端口二邊緣相互連接，形成一體式結(jié)構(gòu)，每個(gè)端口一分別與細(xì)胞培養(yǎng)孔位置相對應(yīng)。本發(fā)明還一方面提供了一種制作用于細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)合支架的方法，包括如下步驟：(1)制備電紡液，在一定的電壓、接收距離、流速、收集時(shí)間下進(jìn)行靜電紡絲，采用接收器接收靜電紡絲，得到納米纖維膜支架結(jié)構(gòu)；(2)通過3D打印或注塑制作支撐結(jié)構(gòu)，所述支撐結(jié)構(gòu)包括中部封閉、兩端分別具有端口一和端口二的空腔結(jié)構(gòu)；(3)將步驟(1)得到的支架結(jié)構(gòu)貼合在步驟(2)得到的支撐結(jié)構(gòu)的端口一的端面上，形成復(fù)合支架。本發(fā)明中，所述電紡液通過如下方法制備：將支架材料溶于一定的溶劑中，得到電紡液；其中，所述支架材料選自以下組中的一種或多種：聚己內(nèi)酯、聚乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚碳酸酯、聚氨酯、聚磷酸酯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚酯酰胺、聚氧乙烷、聚乙烯吡咯烷酮、膠原蛋白、殼聚糖、改性殼聚糖、淀粉、纖維素、改性纖維素、明膠、纖維蛋白、絲素蛋白、透明質(zhì)酸、海藻酸、硫酸軟骨素、肝素、瓊脂、葡聚糖、褐藻酸；優(yōu)選為聚己內(nèi)酯、聚乳酸、左旋聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、膠原蛋白中的一種或多種；更優(yōu)選為聚己內(nèi)酯、聚己內(nèi)酯-膠原蛋白混合物。所述溶劑可以為甲酸、乙酸、乙醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、二甲基亞砜、六氟異丙醇、三氟乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇、乙醇、氯仿、二噁烷、三氟乙烷、三氟乙酸、水或它們?nèi)我獗壤幕旌衔?。上述的支架材料和溶劑的重量和比例等可參照現(xiàn)有技術(shù)。優(yōu)選的，步驟(1)中所述電紡液為聚己內(nèi)酯或聚己內(nèi)酯-膠原蛋白混合物的六氟異丙醇溶液。所述聚己內(nèi)酯和膠原蛋白按重量比為1～3:1，優(yōu)選為1.5～2.5:1，溶液的濃度為5～10％，優(yōu)選為6～8％。優(yōu)選的，步驟(1)中所述靜電紡絲的參數(shù)為：電壓5～40KV、接收距離5～25cm、流速0.2～2.0mL/h、收集時(shí)間0.2～2h。更優(yōu)選的， 電壓10～20KV、接收距離10～20cm、流速0.5～1mL/h、收集時(shí)間0.5～1h。優(yōu)選的，步驟(1)中接收器為PBS緩沖液或蓋玻片。優(yōu)選的，步驟(2)通過3D打印制作支撐結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的，通過計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)出3D支撐結(jié)構(gòu)，采用熱熔噴頭，使得熔融狀態(tài)的材料按計(jì)算機(jī)控制的路徑擠出、沉積，并凝固成型，得到支撐結(jié)構(gòu)。具體3D打印方法可參照本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明對此不作贅述。優(yōu)選的，本發(fā)明支撐結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為適合細(xì)胞培養(yǎng)平板孔、培養(yǎng)室、培養(yǎng)瓶和/或生物反應(yīng)器的尺寸，具體可為本發(fā)明如前所述的支撐結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述支撐結(jié)構(gòu)的材料包括非細(xì)胞毒性和不易降解的熱縮性高分子如：聚乳酸、聚左旋乳酸、ABS、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚己內(nèi)酯、聚碳酸酯、聚氨酯、聚磷酸酯、聚對苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚羥基丁酸戊酸酯、聚羥基丁酸己酸酯、聚酯酰胺、聚氧乙烷等。優(yōu)選為聚乳酸。優(yōu)選的，步驟(3)中通過粘接的方式進(jìn)行貼合。更優(yōu)選的，通過醫(yī)用膠黏劑進(jìn)行貼合。本發(fā)明中，所述貼合也可通過超聲或熔融焊接的方式進(jìn)行貼合；所述醫(yī)用膠黏劑可為非細(xì)胞毒性的聚合物材料，如聚氨酯、天然橡膠、丙烯酸酯、膠原蛋白等，具體可為，α-氰基丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、骨水泥、芳香族多甲基丙烯酸聚氨酯等本領(lǐng)域常規(guī)醫(yī)用膠黏劑，本發(fā)明對此不作限定。本發(fā)明有益效果：1.本發(fā)明復(fù)合支架包括通過靜電紡絲得到具有多孔結(jié)構(gòu)的三維納米纖維膜支架結(jié)構(gòu)，能夠很好的模擬天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。2.本發(fā)明復(fù)合支架中設(shè)計(jì)支撐結(jié)構(gòu)，將支架結(jié)構(gòu)貼合在支撐結(jié)構(gòu)上，克服現(xiàn)有技術(shù)中三維支架不易操作、剛性差、易受損的缺陷；使支架結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)移和細(xì)胞培養(yǎng)中能承受正常的機(jī)械操作，保證支架的多孔的結(jié)構(gòu)不發(fā)生變形和受損。3.本發(fā)明復(fù)合支架可獨(dú)立使用或與常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)裝置配合使用，且通過合理設(shè)計(jì)支撐結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)和尺寸，使其能夠更好的與二維培養(yǎng)作比對，此外，還可以實(shí)現(xiàn)二維、三維共培養(yǎng)的目的。附圖說明圖1本發(fā)明復(fù)合支架的結(jié)構(gòu)示意圖圖2本發(fā)明支撐結(jié)構(gòu)示意圖圖3本發(fā)明支撐結(jié)構(gòu)三視圖圖4本發(fā)明固定環(huán)結(jié)構(gòu)示意圖圖5本發(fā)明PCL納米纖維膜支架電鏡圖圖6本發(fā)明PCL-膠原蛋白納米纖維膜支架電鏡圖圖7神經(jīng)瘤母細(xì)胞SY5Y的CCK-8檢測結(jié)果圖8神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的CCK-8檢測結(jié)果圖9神經(jīng)瘤母細(xì)胞SY5Y和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞染色結(jié)果圖，其中，左側(cè)為神經(jīng)瘤母細(xì)胞SY5Y細(xì)胞染色結(jié)果圖，右側(cè)為神經(jīng)質(zhì)細(xì)胞染色結(jié)果圖具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)實(shí)施例所作出等效變換或等效替代均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。參見附圖1-2，本發(fā)明用于細(xì)胞培養(yǎng)的復(fù)合支架1包括支架結(jié)構(gòu)2和支撐結(jié)構(gòu)3，其中，支架結(jié)構(gòu)2包括通過靜電紡絲方法制得的納米纖維膜，支撐結(jié)構(gòu)3包括中部封閉、兩端分別具有端口一4和端口二5的空腔結(jié)構(gòu)6，支架結(jié)構(gòu)2貼合在支撐結(jié)構(gòu)3端口一4的端面上。本發(fā)明中，支撐結(jié)構(gòu)做成適合細(xì)胞培養(yǎng)平板孔、培養(yǎng)室、培養(yǎng)瓶和/或生物反應(yīng)器的尺寸。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，支撐結(jié)構(gòu)可做成適合細(xì)胞培養(yǎng)平板孔的尺寸，例如6孔板、12孔板、24孔板、48孔板和96孔板。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，支撐結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為筒形，其橫截面為圓形、縱截面為矩形。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，參見附圖3，支撐結(jié)構(gòu)的橫截面為圓形，縱截面為梯形，且端口一4的直徑小于端口二5的直徑。采用該設(shè)計(jì)，通過將端口一的直徑設(shè)計(jì)為小于端口二的直徑，一方面，便于在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中對常規(guī)的二維培養(yǎng)和本發(fā)明三維培養(yǎng)進(jìn)行平行對比實(shí)驗(yàn)，支撐結(jié)構(gòu)在細(xì)胞培養(yǎng)平板孔中更穩(wěn)定、不易滑落；另一方面，采用該設(shè)計(jì)可以使納米纖維膜與培養(yǎng)器皿之間有一段距離，使細(xì)胞更好的形成三維結(jié)構(gòu)，也可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的共培養(yǎng)。本發(fā)明支撐結(jié)構(gòu)的尺寸和形狀的設(shè)計(jì)以細(xì)胞培養(yǎng)平板孔為例進(jìn)行說明，當(dāng)將復(fù)合支架置于6孔板進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，支撐結(jié)構(gòu)端口二的直徑可按照6孔板尺寸，端口一的直徑按照12孔板尺寸設(shè)計(jì)，此時(shí)復(fù)合支架中用于細(xì)胞培養(yǎng)的納米纖維膜的尺寸也與12孔板尺寸匹配，在進(jìn)行平行對比試驗(yàn)時(shí)，二維對比組采用12孔板即可。同理，置于12孔板時(shí)，端口二的直徑按照12孔板尺寸，端口一的直徑按照24孔板尺寸設(shè)計(jì)；置于24孔板時(shí)，端口二的直徑按照24孔板尺寸，端口一的直徑按照48孔板尺寸；依次類推。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，參見附圖4，支撐結(jié)構(gòu)還包括一固定環(huán)7，固定環(huán)7套接在端口一4外側(cè)。具體的，固定環(huán)7可為圓環(huán)，圓環(huán)內(nèi)壁設(shè)置有柱狀凸起8，柱狀凸起8沿圓環(huán)內(nèi)壁周向均勻分布。本發(fā)明在支撐結(jié)構(gòu)上設(shè)置固定環(huán)，該固定環(huán)一方面可用于將納米纖維膜更好的固定在端面上，使其不脫落；另一方面，可以使納米纖維膜與培養(yǎng)器皿之間有一段距離，使細(xì)胞更好的形成三維結(jié)構(gòu)，也可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的共培養(yǎng)。在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，參見附圖1-3，支撐結(jié)構(gòu)端口二5包括向外延伸的邊緣9，邊緣9上設(shè)置有便于抓持的把手10。在使用中，可將支撐結(jié)構(gòu)端口二的邊緣放置在細(xì)胞培養(yǎng)平板孔上，采用設(shè)置在其上的把手方便的移動(dòng)復(fù)合支架。實(shí)施例1：PCL納米纖維膜支架結(jié)構(gòu)的制作利用靜電紡絲技術(shù)進(jìn)行靜電紡絲。靜電紡絲試驗(yàn)條件如下：以六氟異丙醇(HFIP)為溶劑，配制6％聚己內(nèi)酯(PCL)溶液，接收距離 為20.5cm，流速為1.0mL/h，電壓為9.5kv-10.0kv，收集時(shí)間為0.5h，氮?dú)鈮毫?.1Mpa，以PBS緩沖液為接收器得到納米纖維膜，晾干后得到支架結(jié)構(gòu)。電鏡結(jié)果如圖5所示，得到納米纖維膜為直徑為300nm+/-20nm。實(shí)施例2：PCL-膠原蛋白納米纖維膜支架結(jié)構(gòu)的制作利用靜電紡絲技術(shù)進(jìn)行靜電紡絲。靜電紡絲試驗(yàn)條件如下：以HFIP為溶劑，配制8％PCL-膠原蛋白溶液，PCL與膠原蛋白比例為11：5，接收距離為20.5cm，流速為0.5mL/h，電壓為9.5kv-10.0kv，收集時(shí)間為0.5h，氮?dú)鈮毫?.1Mpa，以PBS緩沖液為接收器。電鏡結(jié)果如圖6所示，得到紡絲膜為直徑為560nm+/-20nm。由圖可知，靜電紡絲PCL-膠原得到的紡絲膜直徑較粗，同時(shí)由于膠原具有一定的親水性，利于細(xì)胞的生長。實(shí)施例3：筒形結(jié)構(gòu)PLA支撐結(jié)構(gòu)的制作通過3D打印以聚乳酸(PLA)為原料，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)平板孔6、24、96孔板的尺寸和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)支撐結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)尺寸如下表1所示：其中柱形結(jié)構(gòu)同樣需要把靜電紡絲膜用醫(yī)學(xué)黏膠粘到不帶把手的柱形底部，其中柱形尺寸如表所示：表1：與6、24、96孔板匹配的筒形支撐結(jié)構(gòu)尺寸參數(shù)(單位mm)6孔板24孔板96孔板端口一直徑34.014.05.6厚度1.01.00.5端口二邊緣長度2.02.01.0端口二邊緣厚度1.01.00.5把手長度4.03.03.0高度13.0513.0513.05實(shí)施例4：梯形截面PLA支撐結(jié)構(gòu)的制作通過3D打印以聚乳酸(PLA)為原料，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)平板孔6、12、24孔板的尺寸和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)支撐結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)尺寸如下表2所示：表2：與6、12、24孔板匹配的支撐結(jié)構(gòu)尺寸參數(shù)(單位mm)6孔板12孔板24孔板端口二直徑31.0719.0913.55端口一直徑23.7916.6111.21厚度0.800.500.50端口二邊緣長度3.342.002.00端口二邊緣厚度1.001.001.00把手長度2.662.043.00高度13.0513.0513.05實(shí)施例5：含固定環(huán)的PLA支撐結(jié)構(gòu)的制作通過3D打印以聚乳酸(PLA)為原料，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)平板孔6、24孔板的尺寸和結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)支撐結(jié)構(gòu)，在本實(shí)施例中，固定環(huán)為圓環(huán)，記為外環(huán)，支撐結(jié)構(gòu)的主體為內(nèi)環(huán)。設(shè)計(jì)尺寸如下表3所示：表3：與6、24孔板匹配的支撐結(jié)構(gòu)尺寸實(shí)施例6：神經(jīng)瘤母細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)采用本發(fā)明實(shí)施例1所述支架結(jié)構(gòu)作為細(xì)胞三維培養(yǎng)的支架，以本發(fā)明設(shè)計(jì)的6孔板匹配的支撐結(jié)構(gòu)為例進(jìn)行試驗(yàn)，將PCL納米纖維膜支架結(jié)構(gòu)采用醫(yī)用膠黏劑貼合在支撐結(jié)構(gòu)上制備得到復(fù)合支架，對神經(jīng)瘤母細(xì)胞核神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)，并對其分別進(jìn)行CCK8檢測和死活染色檢測。如圖7和表4所示，為神經(jīng)瘤母細(xì)胞SY5Y的CCK-8檢測結(jié)果，對照組為二維培養(yǎng)及本公司另一產(chǎn)品(將靜電紡絲膜采用膠黏劑黏貼在硬質(zhì)塑料上，記為PCL-塑料)；如圖8和表5所示，為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的CCK-8檢測結(jié)果，對照組為二維培養(yǎng)及三維支架離心培養(yǎng)；圖9為兩種細(xì)胞的染色結(jié)果。表4：神經(jīng)瘤母細(xì)胞SY5Y的CCK-8檢測結(jié)果表5：神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的CCK-8檢測結(jié)果由上述結(jié)果可知，對于神經(jīng)瘤母細(xì)胞，其中采用PCL三維支架的兩種處理方式下的細(xì)胞生長狀態(tài)良好，與2D培養(yǎng)相比第三天到第六天細(xì)胞在PCL上生長速率要明顯高一些，死活染色結(jié)果也表明在該材料中培養(yǎng)細(xì)胞并沒有對細(xì)胞有毒性；此外，采用本發(fā)明PCL復(fù)合支架產(chǎn)品與直接將PCL黏貼在硬質(zhì)塑料上相比，采用本發(fā)明結(jié)構(gòu)PCL外觀更加均勻且結(jié)構(gòu)不易被破壞。對于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，比較了靜止和離心接種方式下，細(xì)胞生長狀態(tài)。膠質(zhì)細(xì)胞屬于原代細(xì)胞株，所以增值能力不強(qiáng)，PCL材料對細(xì)胞無毒性，但增值能力有限。從結(jié)果來看離心方法下，細(xì)胞在第3天到第5天有一個(gè)比較好的增殖率，但整體來看離心接種方式下各孔之間差異較大，平行性不好。因此，在試驗(yàn)中可采用點(diǎn)種靜置方法接種細(xì)胞。該材料可以作為原代細(xì)胞三維培養(yǎng)的一種很好的選擇。當(dāng)前第1頁1 2 3