技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于材料學(xué)領(lǐng)域，涉及一種骨組織工程支架，具體來說是一種復(fù)合骨水泥支架的制備方法。

背景技術(shù)：

骨缺損，尤其是由感染、切除手術(shù)以及遺傳畸形等問題導(dǎo)致的大段骨缺損的修復(fù)治療在臨床上仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。目前，用骨組織工程支架對缺損部位進(jìn)行修復(fù)治療被認(rèn)為是解決相關(guān)問題的有效方法之一。然而，骨組織工程支架需要具備三維連通的多孔結(jié)構(gòu)、良好的力學(xué)支撐性能、可降解性以及生物活性。如何制備滿足上述要求的骨組織工程支架是研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)。硫酸鈣（半水硫酸鈣，CSH）是臨床使用的骨水泥材料，具有水硬性和良好的生物相容性。介孔生物活性玻璃(MBG)具有較大的比表面積和高度有序的介孔孔道，使其比普通生物玻璃的生物活性更高。大量研究表明，MBG能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化，誘導(dǎo)新骨再生。結(jié)合CSH的水硬性和MBG優(yōu)異的生物活性，制備出兼顧結(jié)構(gòu)力學(xué)和生物活性的多孔復(fù)合支架，有望用于大段骨缺損的修復(fù)治療應(yīng)用。

低溫3D打印技術(shù)作為新興的快速成型技術(shù)手段，可以精確的控制支架的外部形狀、內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及孔的連通性。相比其它3D打印技術(shù)，低溫3D打印操作便捷，不需要高溫，對材料的損壞較小，可有效用于CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架的制備。

在現(xiàn)有技術(shù)背景下，運(yùn)用低溫3D打印技術(shù)制備CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架，有望為臨床上大段骨缺損的治療提供新技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種復(fù)合骨水泥支架的制備方法，所述的這種復(fù)合骨水泥支架的制備方法要解決現(xiàn)有技術(shù)中制備的骨組織工程支架不能精確調(diào)控支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和孔的連通性，力學(xué)支撐性能、可降解性以及生物活性不是很理想的技術(shù)問題。

本發(fā)明提供了一種復(fù)合骨水泥支架的制備方法，包括以下步驟：

1)一個配制硫酸鈣/介孔生物活性玻璃復(fù)合墨水的步驟，將硫酸鈣和介孔生物活性玻璃粉體按不同質(zhì)量比混合均勻，過200~800目的篩網(wǎng)，然后取一定質(zhì)量的混合粉體加入到聚己內(nèi)酯（PCL）/二氯甲烷（或三氯甲烷）溶液中，快速攪拌均勻得到打印墨水，然后密封保存；

2)一個設(shè)計硫酸鈣/介孔生物活性玻璃復(fù)合骨水泥支架的外觀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的步驟，運(yùn)用CAD/CAM計算機(jī)輔助軟件設(shè)計支架的外觀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，支架模型的尺寸為10×10×10 cm及以內(nèi)任何尺寸和形狀，內(nèi)部孔徑為50~1200μm，相鄰兩層墨水走向夾角為0°~180°；

3)一個低溫3D打印技術(shù)制備硫酸鈣/介孔生物活性玻璃復(fù)合骨水泥支架的步驟，將配制好的打印墨水裝進(jìn)3D打印機(jī)的料筒中，然后裝上直徑為200~1000μm的針頭，4~8℃預(yù)冷15分鐘；運(yùn)行3D打印程序，打印機(jī)氣壓調(diào)為1.2~5.0bar，打印速度為2.0~8.0mm/s；將墨水線打印到載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，按照層層堆積的方式精確成型得到所需的CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架；

4)一個通過養(yǎng)護(hù)方式提高CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架的強(qiáng)度的步驟，將步驟3）所得多孔支架于37℃干燥24小時后，放在濕度為100%的條件下，37℃養(yǎng)護(hù)3~21天；將養(yǎng)護(hù)不同時間所得的支架放在無水乙醇中浸泡2小時后，于37℃干燥12小時后備用。

進(jìn)一步的，硫酸鈣和介孔生物活性玻璃粉體的質(zhì)量比范圍為80：20至10:90之間任意比例。

進(jìn)一步的，聚己內(nèi)酯和二氯甲烷或三氯甲烷之間的質(zhì)量體積比為0.1g/ml，生物玻璃和和聚己內(nèi)酯溶液之間的質(zhì)量體積比為0.1g/ml至1g/ml。

本發(fā)明的CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架，采用低溫3D打印技術(shù)，將硫酸鈣的水硬特性和介孔生物活性玻璃優(yōu)異的生物活性相結(jié)合，制備出生物活性骨水泥支架。對所述支架理化性能和生物學(xué)性能檢測表明，支架具有三維連通且可控的大孔結(jié)構(gòu)，力學(xué)強(qiáng)度高，并且能夠促進(jìn)人體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化和成骨。

本發(fā)明和已有技術(shù)相比，其技術(shù)進(jìn)步是顯著的。本發(fā)明提供了一種硫酸鈣/介孔生物活性玻璃復(fù)合骨水泥支架的三維打印制備方法。通過本發(fā)明的方法獲得的CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架有望為臨床上大段骨缺損的修復(fù)治療帶來新的契機(jī)。

附圖說明

圖1是實施例1所制備的CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架的光學(xué)照片.

圖2是實施例1所制備的CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架的掃描電鏡（SEM）圖。

圖3是實施例1所制備的CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架的抗壓強(qiáng)度和養(yǎng)護(hù)時間之間的關(guān)系曲線圖。

圖4是人體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在實施例1所制備的CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架上接種3天后的掃描電鏡（SEM）圖。

具體實施方式

為了使相關(guān)領(lǐng)域研究人員更好的理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實施例1

一種復(fù)合骨水泥支架的制備方法，包括以下步驟：

步驟一，配制CSH/MBG復(fù)合打印墨水。將CSH和MBG粉體按質(zhì)量比為80:20混合均勻，過400目的篩網(wǎng)，然后取1.8克混合粉條加入到2毫升聚己內(nèi)酯（PCL）/二氯甲烷溶液(0.1g/ml)中，快速攪拌均勻，然后密封保存。

步驟二，設(shè)計CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架的外觀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。運(yùn)用CAD/CAM等計算機(jī)輔助軟件設(shè)計支架的外觀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，支架模型為圓柱體（φ=8mm，h=2mm），內(nèi)部孔徑為400μm，相鄰兩層墨水走向夾角為60°。

步驟三，低溫3D打印技術(shù)制備CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架。將配制好的打印墨水裝進(jìn)3D打印機(jī)的料筒中，然后裝上直徑為400微米的針頭，8℃預(yù)冷15分鐘；運(yùn)行3D打印程序，打印機(jī)氣壓調(diào)為1.6~1.8bar，打印速度為4.0~4.2mm/s；將墨水線打印到載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，按照層層堆積的方式精確成型得到所需的CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架。

步驟四，通過養(yǎng)護(hù)方式提高CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架的強(qiáng)度。將步驟三所得多孔支架于37℃干燥24小時后，在100%濕度條件下于37℃養(yǎng)護(hù)14天；將養(yǎng)護(hù)所得支架放在無水乙醇中浸泡2小時后于37℃干燥12小時后備用。

實施例2

一種復(fù)合骨水泥支架的制備方法，包括以下步驟：

步驟一，配制CSH/MBG復(fù)合打印墨水。將CSH和MBG粉體按質(zhì)量比為70:30混合均勻，過600目的篩網(wǎng)，然后取1.8克加入到2.5毫升的聚己內(nèi)酯（PCL）/三氯甲烷溶液(0.1g/ml)中，快速攪拌均勻，然后密封保存。

步驟二，設(shè)計CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架的外觀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。運(yùn)用CAD/CAM等計算機(jī)輔助軟件設(shè)計支架的外觀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，支架模型為圓柱體（φ=8mm，h=8mm），內(nèi)部孔徑為200μm，相鄰兩層墨水走向夾角為60°。

步驟三，低溫3D打印技術(shù)制備CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架。將配制好的打印墨水裝進(jìn)3D打印機(jī)的料筒中，然后裝上直徑為200微米的針頭，8℃預(yù)冷15分鐘；運(yùn)行3D打印程序，打印機(jī)氣壓調(diào)為1.8~2.0bar，打印速度為4.0mm/s；將墨水線打印到載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，按照層層堆積的方式精確成型得到所需的CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架。

步驟四，通過養(yǎng)護(hù)方式提高CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架的強(qiáng)度。將步驟三所得多孔支架于37℃干燥24小時后，放在100%濕度條件下于37℃養(yǎng)護(hù)7天；將養(yǎng)護(hù)后得到的支架置于無水乙醇中浸泡2小時，然后于37℃干燥12小時后備用。

實施例3

一種復(fù)合骨水泥支架的制備方法，包括以下步驟：

步驟一，配制CSH/MBG復(fù)合打印墨水。將CSH和MBG粉體按質(zhì)量比為60:40混合均勻，過300目的篩網(wǎng)，然后取1.8克加入到2毫升的聚己內(nèi)酯（PCL）/二氯甲烷溶液(0.1g/ml)中，快速攪拌均勻，然后密封保存。

步驟二，設(shè)計CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架的外觀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。運(yùn)用CAD/CAM等計算機(jī)輔助軟件設(shè)計支架的外觀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，支架模型為圓柱體（φ=8mm，h=2mm），內(nèi)部孔徑為600μm，相鄰兩層墨水走向夾角為90°。

步驟三，低溫3D打印技術(shù)制備CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架。將配制好的打印墨水裝進(jìn)3D打印機(jī)的料筒中，然后裝上直徑為600微米的針頭，4℃預(yù)冷15分鐘；運(yùn)行3D打印程序，打印機(jī)氣壓調(diào)為1.9~2.2bar，打印速度為4.4~4.6mm/s；將墨水絲打印到載物平臺的玻璃培養(yǎng)皿中，按照層層堆積的方式精確成型得到所需的CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架。

步驟四，通過養(yǎng)護(hù)方式提高CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架的強(qiáng)度。將步驟三所得支架于37℃干燥24小時后，放在100%濕度條件下于37℃養(yǎng)護(hù)21天；將養(yǎng)護(hù)后所得支架置于無水乙醇中浸泡2小時，然后于37℃干燥12小時后備用。

實施例4 細(xì)胞粘附測試?yán)?/p>

人體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在實施例1所制備的CSH/MBG支架上粘附情況研究，包括以下步驟：

步驟一，根據(jù)文獻(xiàn)報道提取人體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞[ Matsubara T， Suardita K， Ishii M， et al. Alveolar bone marrow as a cell source for regenerative medicine: differences between alveolar and iliac bone marrow stromal cells[J]. Journal of Bone and Mineral Research， 2005， 20(3): 399-409.]，后續(xù)實驗所用細(xì)胞都是傳代培養(yǎng)至第五代的細(xì)胞。

步驟二，將實施例1所制備的CSH/MBG支架放在紫外燈下照射24小時滅菌，同時在24孔培養(yǎng)板中加入lml含10％胎牛血清(InVitro Technology， Australia)的細(xì)胞培養(yǎng)基(GIBCO，InvitrogenPty Ltd.，Australia)預(yù)先潤濕24h，更換培養(yǎng)基，接著將滅菌支架材料移入24孔板內(nèi)。然后，將含有1×10⁵ 人體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的200μ1的培養(yǎng)液滴加到每個支架上，并在37℃、5％CO2氣氛的CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

步驟三，細(xì)胞在支架上培養(yǎng)3天后，先在37℃下用PBS緩沖液洗滌三次，接著所有樣品用含有2.5％戊二醛的PBS固定1h，固定劑通過含有4%蔗糖的緩沖溶液PBS除去，之后通過含有1%的四氧化鋨的PBS緩沖溶液進(jìn)行固定，再通過梯度乙醇溶液(50%， 70%， 90%， 95%， 100%)和六甲基二硅胺烷溶液(HMDS)脫水處理。

步驟四，用掃描電鏡(FEI Quanta 450)觀察細(xì)胞在支架表面的粘附情況，所有支架樣品用導(dǎo)電膠粘在金屬基座上，觀察前進(jìn)行噴金60秒處理。

結(jié)果如圖4所示，人體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞在CSH/MBG支架上粘附良好并且完全鋪展開，表明CSH/MBG支架有利于細(xì)胞粘附，具有良好的生物活性。

上述制備過程，可以通過改變CSH和MBG的質(zhì)量比，有機(jī)溶劑的種類，調(diào)節(jié)打印參數(shù)，制備出不同成分含量，不同內(nèi)部結(jié)構(gòu)的CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架。

對所述支架進(jìn)行理化性能和生物學(xué)性能分析表明，本發(fā)明所制備的復(fù)合骨水泥支架具有三維連通且可控的大孔結(jié)構(gòu)，力學(xué)強(qiáng)度滿足松質(zhì)骨強(qiáng)度，并且能夠促進(jìn)人體骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化和成骨。因此，本發(fā)明所制備的CSH/MBG復(fù)合骨水泥支架有望為臨床上大段骨缺損的治療帶來新技術(shù)。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明所做的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明只局限于這些實施例。因此，在不脫離本發(fā)明總體構(gòu)思下的修改和替換，應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。