本發(fā)明涉及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種納米羥基磷灰石、絲素蛋白和殼聚糖復(fù)合，雙相多孔結(jié)構(gòu)的復(fù)合支架及其制備方法。

技術(shù)背景

隨著人類預(yù)期壽命的延長及人口學(xué)結(jié)構(gòu)變化，創(chuàng)傷骨軟骨已經(jīng)成為全球密切關(guān)注的公共健康問題。關(guān)節(jié)軟骨雖然有代謝活動，但由于缺乏血供及可遷移、增殖的未分化細胞，因而自身修復(fù)和再生能力極為有限，無論是生物化學(xué)還是生物力學(xué)因素引起的關(guān)節(jié)軟骨破壞均不能恢復(fù)到正常狀態(tài)。通常一旦發(fā)生病變，損害就會不斷累積，直至關(guān)節(jié)面完全喪失，暴露出下方的骨組織。伴隨著軟骨改變的是骨贅形成，嚴(yán)重地破壞關(guān)節(jié)的形態(tài)和一致性。

關(guān)節(jié)內(nèi)損傷引起的軟骨損傷或缺損，多表現(xiàn)為包括全層關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的復(fù)合型骨軟骨缺損。由于成人軟骨幾乎不能夠依賴自身修復(fù)，特別是大面積的骨軟骨缺損，從而造成骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生，甚至導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能障礙的嚴(yán)重后果，給病人及家庭造成了很大的負擔(dān)。因此，如何實現(xiàn)大面積骨軟骨修復(fù)成為21世紀(jì)臨床面臨的巨大挑戰(zhàn)。臨床上大量的骨不連和骨缺損的患者已使骨移植成為最常用的移植術(shù)之一，而骨移植術(shù)有其很難克服的缺點”。這就促使骨組織工程學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展。目前，臨床上的骨移植(包括人工骨移植)正在逐步地向骨組織工程過渡。

軟骨缺損的修復(fù)技術(shù)包括打磨成型術(shù)、軟骨下鉆孔術(shù)、微骨折術(shù)、自體軟骨細胞移植術(shù)及骨軟骨鑲嵌移植術(shù)(Mosaicplasty)，其治療目標(biāo)均是恢復(fù)平整、光滑的軟骨面、充分的力學(xué)強度以及足夠的關(guān)節(jié)無痛活動范圍，其中以Mosaicplasty術(shù)治療效果比較有優(yōu)勢，但在大面積骨軟骨缺損中由于骨軟骨柱供體來源有限，使其臨床應(yīng)用受到了較大限制。能否找到較理想的支架材料替代骨軟骨柱重建骨軟骨缺損是本發(fā)明中心所在。同時，將組織工程技術(shù)與Mosaicplasty技術(shù)相結(jié)合，使骨軟骨組織缺損的完全再生成為可能。

組織工程技術(shù)的基本思路是用高密度細胞接種在可降解的支架材料上，在體外預(yù)先構(gòu)建一個有生命的種植體，然后植入體內(nèi)修復(fù)缺損的骨軟骨組織。良好的種植體取決于理想的支架材料和優(yōu)秀的種子細胞，支架材料作為種子細胞的暫時細胞外基質(zhì)替代物，對細胞的黏附、增殖和分化等均有不可低估的影響。理想的支架材料應(yīng)具有下列特點：(1)良好的生物相容性。(2)降解速率的可調(diào)控性。(3)具有一定生物力學(xué)。(4)良好的可塑性。(5)誘導(dǎo)軟骨的再生性。(6)易于消毒和保存。盡管目前支架材料研究很多、發(fā)展很快，但至今尚未研制出一種理想的適合于修復(fù)骨軟骨缺損的支架材料；因此，支架材料的研究仍然是組織工程研究的一個重要方面。

目前已有的動物實驗可知，絲素蛋白(silk fibroin，SF)和殼聚糖(Chitosan，CS)均是天然高分子材料，有良好的生物活性和理化特性，且價廉易得，作為人體組織工程材料的應(yīng)用研究已取得了一定的成果。研究發(fā)現(xiàn)將兩者混合可以制備成SF-CS復(fù)合三維支架材料，有良好的生物相容性和理化特性。然而，我們發(fā)現(xiàn)軟骨缺損往往存在部分軟骨下骨缺損，且缺損面積較大時，單純應(yīng)用SF-CS三維支架于修復(fù)骨軟骨缺損，存在軟骨與骨交界處出現(xiàn)分層、整合欠佳等不足。

納米羥基磷灰石(Nano HydroxyaPatite，nHA)是人體和動物骨骼、牙齒的重要無機成分，在骨質(zhì)中，HA大約占60％。人工合成的nHA與人體正骨的磷灰石結(jié)晶相似，具有良好的生物活性和生物相容性，植入人后能在短時間內(nèi)與人體的軟硬組織形成緊密結(jié)合，為新骨的沉積與再生提供優(yōu)良的生理支架，因此，nHA作為一種生物性能優(yōu)越的骨替代料被廣泛應(yīng)用于臨床。目前研究發(fā)現(xiàn)：將SF、CS及nHA三者混合可以制備成SF-CS-nHA復(fù)合三維支架材料，有良好的生物相容性和理化特性。

于是我們構(gòu)想：制備骨軟骨雙相支架，以SF-CS作為軟骨細胞的細胞外基質(zhì)，用于構(gòu)建雙相支架的軟骨相；以SF-CS-nHA作為成骨細胞的細胞外基質(zhì)，構(gòu)建雙相支架的成骨相，增強組織工程骨種植體修復(fù)骨軟骨缺損。

我們制作新型雙相復(fù)合支架材料(雙相支架)，再將其與單純雙相支架分別植入膝關(guān)節(jié)骨軟骨缺損動物模型，觀察在骨軟骨修復(fù)過程中的差異，通過體內(nèi)外組織工程有效地引導(dǎo)軟骨和骨的形成和實現(xiàn)骨軟骨的重建為制備與骨軟骨的重建更匹配，更接近生理代謝特征，為骨軟骨修復(fù)材料提供一定的理論依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種修復(fù)骨軟骨雙相多孔復(fù)合支架及其制備方法。該復(fù)合支架由上下兩層架構(gòu)構(gòu)成，下層支架為成骨相，是納米羥基磷灰石、絲素蛋白和基殼聚糖復(fù)合制成，上層支架為成軟骨相，是絲素蛋白和殼聚糖復(fù)合制成。在骨軟骨新西蘭大白兔模型中實驗驗證，和單相支架(單純修復(fù)骨或軟骨)相比較，本發(fā)明支架能夠同時很好的修復(fù)骨與軟骨組織，在組織工程研究中具有重要的意義。

本發(fā)明公開的修復(fù)骨軟骨雙相多孔復(fù)合支架，其特征在于，該雙相多孔復(fù)合支架由下層成骨相和上層軟骨相組成，下層成骨相和上層軟骨相一體鑄成。

上述的修復(fù)骨軟骨雙相多孔復(fù)合支架，其特征在于該支架是按照以下步驟制備的：

1)分別配置2％(m/M)的納米羥基磷灰石、絲素蛋白和殼聚糖溶液。

2)配制下層成骨相：其中納米羥基磷灰石、絲素蛋白和殼聚糖溶液比例為(15％-45％)∶(15％-45％)∶(15％-45％)；配制上層成軟骨相：其中絲素蛋白和殼聚糖溶液比例為(40-60％)∶(40-60％)。

3)將步驟2)配制的下層成骨相溶液混勻加入模具中，隨后放入-80℃冰箱中放置30min，徹底冷凍。

4)取出步驟3)的冷凍模具放置干冰上，再加入步驟2)配制的上層成軟骨相溶液，放置-80℃中冷凍1小時。

5)將步驟4)冷凍好的支架用封口膜迅速密封，在封口膜上制作細孔后放入真空干燥機抽吸36h。

6)將步驟5)干燥后的支架浸入75％的甲醇和1mol/L氫氧化鈉混合液中預(yù)處理15h，超純水反復(fù)洗凈后再次真空干燥。

7))將步驟6)干燥后的支架在碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺混合的交聯(lián)劑中浸泡10h后洗凈。

8)將步驟7)的復(fù)合支架-80℃冷凍24h，真空干燥后即得到修復(fù)骨軟骨雙相多孔復(fù)合支架。

上述述的修復(fù)骨軟骨雙相多孔復(fù)合支架，其特征在于，該雙相多孔復(fù)合支架能很好的修復(fù)骨軟骨缺損模型。

本發(fā)明公開的修復(fù)骨軟骨雙相多孔復(fù)合支架具有以下特點：

該復(fù)合支架由上下兩層架構(gòu)構(gòu)成，下層支架為成骨相，是納米羥基磷灰石、絲素蛋白和基殼聚糖復(fù)合制成，上層支架為成軟骨相，是絲素蛋白和殼聚糖復(fù)合制成。在骨軟骨新西蘭大白兔模型中實驗驗證，和單相支架(單純修復(fù)骨或軟骨)相比較，本發(fā)明支架能夠同時很好的修復(fù)骨與軟骨組織，在組織工程研究中具有重要的意義。

附圖說明

附圖1為雙相多孔復(fù)合支架掃描電鏡觀察結(jié)果；

附圖2為CT檢測新西蘭大白兔骨軟骨的修復(fù)情況。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。

實施例1 制備雙相多孔復(fù)合支架

一種修復(fù)骨軟骨雙相多孔復(fù)合支架，由上下兩層架構(gòu)構(gòu)成，下層為成骨相，納米羥基磷灰石-絲素蛋白-基殼聚糖復(fù)合支架，上層為成軟骨相，絲素蛋白-殼聚糖復(fù)合支架構(gòu)成。其中，下層成骨相為納米羥基磷灰石、絲素蛋白和殼聚糖溶液混合，各組分比例為(15％-45％)∶(15％-45％)∶(15％-45％)，上層成軟骨相為絲素蛋白和殼聚糖溶液混合各組分為(40-60％)∶(40-60％)。

上述復(fù)合支架的制備方法，包括以下步驟：

將絲素蛋白、殼聚糖、納米羥基磷灰石分別配制成為2％(m/M)溶液。

然后分別以體積比(15％-45％)∶(15％-45％)∶(15％-45％)三種比例混合，在磁力加熱攪拌器中以55℃恒溫攪拌直到3種液體中沒有汽包，充分混合均勻，迅速吸取50ul加入96孔板中，迅速放入-80℃冰箱中靜止1h，然后取出冷凍的96孔板。

將絲素蛋白、殼聚糖分別以體積比(40-60％)∶(40-60％)比例混合，在磁力加熱攪拌器中以55℃恒溫攪拌直到液體中沒有汽包，充分混合均勻。

取出冷凍好的96孔板，放在冰袋上面，吸取50ul迅速加入冷凍的上層，再將96孔板放置-80℃冰箱中充分冷凍。

將冷凍好的支架用封口膜迅速密封，在支架相應(yīng)區(qū)域制作細孔后放入真空干燥機抽吸36h。將干燥后的支架浸入含有體積分?jǐn)?shù)75％甲醇和1mol/L氫氧化鈉的混合液中預(yù)處理15h，超純水反復(fù)洗凈后再次真空干燥。然后將所得支架在以碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺混合的交聯(lián)劑中浸泡10h后洗凈。

再將染濕的復(fù)合支架-80℃冷凍24h后真空干燥，即得到修復(fù)骨軟骨雙相多孔復(fù)合支架，掃描電鏡觀察結(jié)果如附圖1所示。

實施例2 制備單相多孔復(fù)合支架

制備單相支架絲素蛋白、殼聚糖復(fù)合支架(具體方法參照佘榮峰，探討絲素蛋白/殼聚糖三維支架材料制備方法[J]，中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(47)：8821-8824)。

將實施例1中配制好的溶液，分別以體積比絲素蛋白、殼聚糖，1∶1混合，在磁力加熱攪拌器中以55℃恒溫攪拌直到3種液體中沒有汽包，充分混合均勻，迅速吸取50ul加入96孔板中，迅速放入-80℃冰箱中靜止1h，然后取出冷凍的96孔板。

將冷凍好的支架用封口膜迅速密封，在支架相應(yīng)區(qū)域制作細孔后放入真空干燥機抽吸36h。將干燥后的支架浸入含有體積分?jǐn)?shù)75％甲醇和1mol/L氫氧化鈉的混合液中預(yù)處理15h，超純水反復(fù)洗凈后再次真空干燥。

然后將所得支架在以碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺混合的交聯(lián)劑中浸泡10h后洗凈。再將染濕的復(fù)合支架-80℃冷凍24h，然后真空干燥。

脫模即可得到支架絲素蛋白、殼聚糖復(fù)合支架。

實施例3 單相多孔復(fù)合支架的其制備

制備單相支架絲素蛋白、殼聚糖、納米羥基磷灰石復(fù)合支架(具體方法參照葉鵬，絲素/殼聚糖/納米羥基磷灰石構(gòu)建的骨組織工程支架[J]，中國組織工程研究，2013(29)：5269-5274)。

將實施例1中配制好的溶液，然后分別以絲素蛋白、殼聚糖、納米羥基磷灰石體積比1∶1∶1三種比例混合，在磁力加熱攪拌器中以55℃恒溫攪拌直到3種液體中沒有汽包，充分混合均勻，迅速吸取50ul加入96孔板中，迅速放入-80℃冰箱中靜止1h，然后取出冷凍的96孔板。

將冷凍好的支架用封口膜迅速密封，在支架相應(yīng)區(qū)域制作細孔后放入真空干燥機抽吸36h。將干燥后的支架浸入含有體積分?jǐn)?shù)75％甲醇和1mol/L氫氧化鈉的混合液中預(yù)處理15h，超純水反復(fù)洗凈后再次真空干燥，

然后將所得支架在以碳化二亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺混合的交聯(lián)劑中浸泡10h后洗凈，再將染濕的復(fù)合支架-80℃冷凍24h，然后真空干燥。脫模即可得到支架將絲素蛋白、殼聚糖、納米羥基磷灰石復(fù)合支架。將制備的三維復(fù)合支架密封后備用。

實施例4 新西蘭大白兔骨軟骨缺損模型修復(fù)實驗

動物模型的建立：取新西蘭大白兔40只，手術(shù)前6h禁食禁飲。以2.5％戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉。麻醉妥當(dāng)后，妥善固定其四肢，以免術(shù)中掙扎損傷血管或神經(jīng)，并注意充分暴露其右后肢。備皮，常規(guī)碘伏、乙醇消毒后用電鉆在股骨髁上打孔，形成直徑為6mm深度為4mm的小孔。

按照實驗設(shè)計實驗組，分為4組每組10只。A組植入預(yù)先制備好的雙相絲素蛋白/殼聚糖/納米羥基磷灰石復(fù)合支架，B組植入預(yù)先制備好的絲素蛋白/殼聚糖/納米羥基磷灰石復(fù)合支架，C組植入預(yù)先制備好的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合支架，D組為空白對照組未植入任何材料。逐層縫合傷口，術(shù)后碘伏消毒傷口，紗布包扎后不用外固定，肌注青鏈霉素雙抗預(yù)防感染。術(shù)后單籠喂養(yǎng)，術(shù)后8、12、16周各組分別進行CT檢查，觀察骨軟骨的修復(fù)情況。

經(jīng)CT觀察鑒定，發(fā)現(xiàn)A組新西蘭大白兔缺損的骨軟骨修復(fù)均得到了修復(fù)，B組骨缺損修復(fù)較快，C組軟骨組織修復(fù)較快，D組中缺損的骨軟骨均得到了較少的修復(fù)。而且，A組中骨軟骨的修復(fù)效果均超過了B組與C組修復(fù)效果。實驗證明，雙相復(fù)合支架可以同時促進修復(fù)骨軟骨缺損大白兔模型，促進修復(fù)能力遠遠超過單純修復(fù)骨缺損或者軟骨缺損的單相支架。