相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2008年9月30日提交的美國臨時申請第61/101332的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容通過引用并入本文中。

政府權(quán)益聲明

本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)授予的批準(zhǔn)號為OD004309的美國政府支持下完成的。政府對本發(fā)明有一定權(quán)利。

背景技術(shù)：

本說明書通篇引用了多種出版物，包括專利、公開的申請、技術(shù)文章和學(xué)術(shù)文章。各引用的出版物通過引用的方式整體并入本文中。

心血管疾病是美國死亡的主要原因。心血管疾病最普遍的起因是發(fā)生于冠狀動脈堵塞時的心肌梗塞(MI)。MI導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)降解，繼而引發(fā)瘢痕組織沉積。最終心臟衰竭發(fā)作，接著心臟擴(kuò)張，導(dǎo)致泵血效率降低。由于心臟中只有極少量的心臟祖細(xì)胞，且這些祖細(xì)胞不易分裂，因此心臟組織的再生不會自然發(fā)生。目前對心臟衰竭的治療嚴(yán)重依賴于創(chuàng)傷性的外科手術(shù)，對受損心臟組織的修復(fù)幾乎無益。

最近研究的方法利用將健康細(xì)胞注射到左心室(LV)梗塞壁，試圖使心肌再生，然而研究顯示，僅有少量的注射細(xì)胞存活。通常在涂覆有一種或幾種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表面或支架上培養(yǎng)細(xì)胞，包括成體和胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞和如心肌細(xì)胞的分化細(xì)胞。但是，在體內(nèi)，這些細(xì)胞處在高度復(fù)雜的胞外環(huán)境中。

目前正對一些天然來源的材料進(jìn)行研究，以用于心肌注射，包括纖維蛋白、膠原、藻酸鹽、基質(zhì)膠和明膠。這些均不提供顯著量的心肌細(xì)胞外基質(zhì)的天然組分。對于心率不齊，非侵入性(non-ablative)治療類型包括注射纖維蛋白和細(xì)胞?，F(xiàn)有的用于心肌細(xì)胞、干細(xì)胞和其它心臟相關(guān)細(xì)胞的體外細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)包括膠原、層粘連蛋白、SURECOAT(CELUTRON，膠原和層粘連蛋白的混合物)以及明膠。

目前防止心肌梗塞繼發(fā)心力衰竭的工作集中于細(xì)胞移植以取代壞死的心肌細(xì)胞，防止負(fù)性左心室重構(gòu)，以及使心臟組織再生。然而由于沒有合適的基質(zhì)，心肌細(xì)胞的體外生長率和體內(nèi)存活率低。存在改進(jìn)的用于心臟修復(fù)、心率失調(diào)治療和心肌細(xì)胞培養(yǎng)的組合物的需求。同樣地，也存在改進(jìn)的用于骨骼肌修復(fù)、再生和細(xì)胞培養(yǎng)的組合物的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本發(fā)明提供一種組合物，其含有心臟組織來源的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)。在一些實(shí)例中該心臟組織為心肌組織，而在另一些實(shí)例中該心臟組織為心包組織。該組合物可以是可注射的。該組合物可在室溫中、典型地在20℃至25℃中形成液體形式，并可在高于室溫或高于35℃的溫度中形成凝膠形式。

一些實(shí)例中，上述心臟組織選自人類心臟、靈長類心臟、豬心臟、牛心臟、或任意其它哺乳動物或動物心臟，包括但不限于山羊心臟、小鼠心臟、大鼠心臟、兔心臟和雞心臟。

一些實(shí)例中，該組合物設(shè)置為在心肌梗塞后注射進(jìn)梗塞壁。一些實(shí)施例中，該組合物設(shè)置為通過小規(guī)格針(small gauge needle)(例如27規(guī)格(gauge)或更小)輸送到組織。一些實(shí)例中，上述組合物適合植入到患者中。

一些實(shí)例中，該組合物含有天然發(fā)生的將細(xì)胞募集到組合物中的趨化因子、生長因子和刺激因子。一些實(shí)例中，該組合物含有天然葡胺聚糖。一些實(shí)例中，該組合物還含有非天然發(fā)生將細(xì)胞募集到組合物中的因子。

一些實(shí)例中，該組合物還含有外源的治療性細(xì)胞。這些細(xì)胞可以是干細(xì)胞或其它心肌細(xì)胞的前體或其它心臟相關(guān)的細(xì)胞。

一些實(shí)施例中，該組合物還含有治療制劑，而其本身設(shè)置為給藥載體。一些實(shí)施例中，該組合物被設(shè)置成無損的傳導(dǎo)阻滯來治療例如心律不齊。一些實(shí)施例中，該組合物設(shè)置成涂覆例如組織培養(yǎng)板或支架的表面，以培養(yǎng)心肌細(xì)胞或其它心臟修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞類型。

一方面，本發(fā)明提供一種制備含有脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)的組合物的方法，其包括：獲取具有細(xì)胞外基質(zhì)組分和非細(xì)胞外基質(zhì)組分的心臟組織樣品；處理該心臟組織樣品以去除非細(xì)胞外基質(zhì)組分，從而得到脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)，包括細(xì)胞外蛋白和多糖；并對脫細(xì)胞化心臟外基質(zhì)進(jìn)行滅菌。一些實(shí)例中，上述方法還包括凍干和碾碎脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)的步驟。一些實(shí)例中，上述方法還包括對脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行酶處理、溶解或懸浮的步驟。一些實(shí)例中，上述脫細(xì)胞化心臟外基質(zhì)在低pH中以胃蛋白酶進(jìn)行消化。

一些實(shí)例中，上述方法還包括在溶液中懸浮和中和上述脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)的步驟。一些實(shí)例中，上述溶液為可通過高規(guī)格針注射到心肌層中的磷酸緩沖溶液(PBS)或鹽溶液。一些實(shí)例中，上述組合物在體溫形成凝膠。一些實(shí)例中，上述組合物還含有可在凝膠之前、之中或之后輸送到組合物中或附著其上的細(xì)胞、藥物、蛋白或其它治療制劑。

一些實(shí)例中，上述溶液被置于組織培養(yǎng)板或孔內(nèi)，在35℃以上或約37℃孵育，從而形成用于細(xì)胞培養(yǎng)的凝膠。一方面，本發(fā)明提供一種在吸收基質(zhì)上培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其步驟包括：在組織培養(yǎng)裝置內(nèi)提供含有心臟組織來源的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)的溶液；孵育上述組織培養(yǎng)板裝置；去除上述溶液；并在吸收基質(zhì)上培養(yǎng)細(xì)胞。一些實(shí)例中，上述細(xì)胞為心肌細(xì)胞或其它心臟修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞。

一方面，本發(fā)明提供用于受治療者內(nèi)心臟修復(fù)的治療方法，其包括將治療有效量的心臟組織來源的含有脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)的組合物注射或植入到有需要的受治療者中。

另一方面，文中的組合物含有骨骼肌組織來源的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)。該組合物可以是可注射的。該組合物在室溫中為液態(tài)，在高于室溫的溫度中為凝膠形式。一些實(shí)例中，該組合物被設(shè)置為在心肌梗塞后注射到梗塞壁中。一些實(shí)例中，該組合物被設(shè)置為通過27規(guī)格或更小的針輸送到組織。

一些實(shí)施方式中，文中含有骨骼肌組織來源的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)的組合物，其保留天然葡胺聚糖。一些實(shí)例中，該組合物含有天然發(fā)生的將細(xì)胞募集到該組合物中的因子。一些實(shí)例中，該組合物含有非天然發(fā)生的將細(xì)胞募集到該組合物中的因子。一些實(shí)例中，該組合物被設(shè)置為涂覆組織培養(yǎng)表面或支架以培養(yǎng)骨骼肌修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞。

一方面，文中公開了一種制備含有脫細(xì)胞化骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)的組合物的方法，其包括：從受治療者獲取具有細(xì)胞外基質(zhì)和非細(xì)胞外基質(zhì)組分的骨骼肌組織樣品；處理骨骼肌組織樣品以去除非細(xì)胞外基質(zhì)組分，從而得到脫細(xì)胞化骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞外蛋白和多糖；對脫細(xì)胞化骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行滅菌。一些實(shí)例中，上述方法還包括將骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)凍干和碾碎的步驟。一些實(shí)例中，上述方法還包括對脫細(xì)胞化骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行酶處理、溶解或懸浮。一些實(shí)例中，該脫細(xì)胞化骨骼肌細(xì)胞外基質(zhì)在低pH中以胃蛋白酶進(jìn)行消化。一些實(shí)例中，上述方法還包括在溶液中懸浮和中和或改變上述脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)的pH的步驟。一些實(shí)例中，上述溶液為PBS、鹽水或其它緩沖溶液，設(shè)置為通過小直徑針注射到心肌層。該溶液可在體溫中形成凝膠。該溶液可以還含有可輸送到內(nèi)部并在凝膠作用之前、之中或之后輸送附著于上述材料的細(xì)胞、藥物、蛋白質(zhì)或多糖。一些實(shí)例中，溶液被置于組織培養(yǎng)板或孔內(nèi)，在37℃或高于室溫的溫度中孵育，以形成用于細(xì)胞培養(yǎng)的凝膠。

一方面，本發(fā)明提供一種在吸收基質(zhì)上培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其包括下述步驟：在組織培養(yǎng)裝置內(nèi)含有骨骼肌組織來源的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)的溶液；孵育上述組織培養(yǎng)板裝置；去除上述溶液；并在吸收基質(zhì)上培養(yǎng)細(xì)胞。一些實(shí)例中，上述細(xì)胞為骨骼肌成肌細(xì)胞、干細(xì)胞或其它與骨骼肌修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞類型。

一方面，本發(fā)明提供一種用于受治療者的骨骼肌修復(fù)的治療方法，其包括植入含有骨骼肌組織來源的脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)的組合物。

附圖說明

圖1圖示由輸送本發(fā)明組合物的方法(上)得到的示例性心臟或由標(biāo)準(zhǔn)治療方法(下)得到的示例性心臟。

圖2圖示生長在心臟ECM上的人類胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞的平均肌纖維區(qū)域。

圖3圖示生長在心肌ECM上的每肌纖維區(qū)域的人類胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞核的平均數(shù)量。

圖4圖示心肌ECM上的平均橋粒斑(desmosome plaque)尺寸。

圖5圖示培養(yǎng)于骨骼肌基質(zhì)上的骨骼肌成肌細(xì)胞。

圖6圖示骨骼肌成肌細(xì)胞特異性地向骨骼肌基質(zhì)遷移。

具體實(shí)施方式

在某些優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)組合物，其可用于例如，在心肌梗塞后輸送治療制劑，包括細(xì)胞，到心壁中。本發(fā)明的ECM可以來源于哺乳動物心臟組織原生或天然的基質(zhì)。本文所述的組合物包括可用于注射到需要治療處理的心臟組織的心臟細(xì)胞外基質(zhì)。ECM還可用于將細(xì)胞募集進(jìn)受損組織或用作給藥載體。組合物還可用于支持受損細(xì)胞或改變機(jī)械性能。本發(fā)明的另一個用處是作為無損的傳導(dǎo)阻斷來治療例如心律不齊。一些實(shí)例中，文中所述的心臟或心臟細(xì)胞外基質(zhì)來源于心肌組織。另一些實(shí)例中，文中所述的心臟或心臟細(xì)胞外基質(zhì)來源于心包組織。

文中所述的含有脫細(xì)胞化心臟ECM的組合物可以幫助缺陷或缺失的心肌再生并恢復(fù)心臟功能。該ECM組合物可以從動物或合成來源獲得。文中的細(xì)胞外基質(zhì)組合物可以還含有一種或多種添加組分，例如但不限于：外源細(xì)胞、肽、多肽或蛋白質(zhì)、表達(dá)生物活性分子的DNA的載體和其它治療制劑如藥物、細(xì)胞生長因子、養(yǎng)分、抗生素或其它生物活性分子。因此，在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，該ECM可以還含有外源的細(xì)胞群例如下文所述的心肌細(xì)胞前體。

一些實(shí)例中描述了輸送方法，使組合物接觸缺陷的、病態(tài)的或缺失的心肌，使心肌組織再生并使心肌恢復(fù)收縮性、傳導(dǎo)性或健康功能。一些實(shí)例中，該組合物可以在受體內(nèi)募集內(nèi)源細(xì)胞，并可協(xié)調(diào)新募集或添加的細(xì)胞的功能，允許細(xì)胞在組合物內(nèi)增殖或遷移。

目前，阻止心肌梗塞(MI)后心力衰竭的研究集中于細(xì)胞移植，以取代受體內(nèi)壞死的心肌，阻止負(fù)性左心室重構(gòu)，和再生心臟組織。已探究多種細(xì)胞類型作為細(xì)胞移植治療，包括心肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞、間葉細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞。不幸的是，由于沒有合適的基質(zhì)，體內(nèi)細(xì)胞存活量低。本領(lǐng)域中已用于嘗試在注射時幫助細(xì)胞停留和存活的一些天然來源的基質(zhì)包括纖維素、膠原、基質(zhì)膠、藻酸鹽和明膠。但是，這些材料均不能適當(dāng)?shù)啬M特別是發(fā)現(xiàn)于心臟細(xì)胞外基質(zhì)中的天然組分。

現(xiàn)有的治療心臟后MI(heart post-MI)的可注射支架不能提供細(xì)胞生長所需的細(xì)胞外基質(zhì)所有的需求組分。因此，在這些支架中細(xì)胞存活受到限制。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種天然心臟ECM脫細(xì)胞化和凝膠化方法以制造用于細(xì)胞移植的原位支架。文中提供了可以產(chǎn)生納米纖維凝膠的恰當(dāng)?shù)南椭苽浞椒?。該凝膠溶液能夠注射到心肌或梗塞中，從而顯示了其作為原位凝膠支架的可能性。由于脫細(xì)胞化心臟ECM最佳地模擬自然的心臟環(huán)境，它使注射時心肌梗塞部位的細(xì)胞存活量和停留量提高，從而促進(jìn)心肌組織再生。

圖1圖示了文中的組合物的示例性輸送方法。左邊表示健康心臟。在圖中部表示心肌梗塞后的心臟，如右側(cè)底部示意圖所示，沒有現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)治療，例如僅使用現(xiàn)成可用的藥物和醫(yī)用裝置，能夠有效避免心肌細(xì)胞死亡、負(fù)性LV重構(gòu)、LV肥大和心力衰竭。本發(fā)明通過輸送文中所述的可注射的組合物改善了這個問題。在右側(cè)上部示意圖表示向LV輸送文中的組合物而使重建增強(qiáng)、梗塞尺寸減小、LV重構(gòu)減弱和心臟功能改善的心臟。

本發(fā)明特征在于脫細(xì)胞化心臟外基質(zhì)以及生產(chǎn)和使用該基質(zhì)的方法。特別地，本發(fā)明設(shè)計一種生物相容性的組合物，其含有從心臟組織直接獲得的脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)，用于通過注射或植入生物相容性的含有脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)的組合物到受治療者中而治療受治療者的缺陷、病態(tài)、受損或缺血的組織或器官，優(yōu)選人類心臟。本發(fā)明的其它實(shí)施方式涉及脫細(xì)胞化骨骼肌、細(xì)胞外基質(zhì)組合物、使用方法和生產(chǎn)方法。

一些實(shí)例中，脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)來源于選自人類、豬、牛、羊、小鼠、大鼠、雞或任意其它的哺乳或動物心臟的天然心臟組織。一些實(shí)施方式中，含有脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)的生物相容性組合物為可注射的凝膠或溶液形式，并可通過在心肌梗塞后移植或輸送其含有的細(xì)胞到梗塞壁中或?qū)⒒颊咦泽w的細(xì)胞募集進(jìn)受損心臟組織而用于心臟修復(fù)。在其它實(shí)例中，含有脫細(xì)胞化心臟ECM的生物相容性材料為，例如碎片(patch)、乳狀液、粘性液體、片段(fragment)、顆粒、微珠或納米珠。

一些實(shí)例中，本發(fā)明提供生物相容性的材料用于在研究實(shí)驗(yàn)室中或在臨床環(huán)境中移植之前培養(yǎng)心肌細(xì)胞或其它心臟相關(guān)細(xì)胞，以及用于心臟修復(fù)。還提供了制造和以脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)涂覆例如組織培養(yǎng)板或孔的表面的方法。本發(fā)明的生物相容性材料還適用于植入患者，無論是人類還是動物。

本發(fā)明還提供高生產(chǎn)含有本發(fā)明的脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)的生物相容性材料。這樣的方法包括下列步驟：(a)獲取具有細(xì)胞外基質(zhì)組分和非細(xì)胞外基質(zhì)組分的心臟組織樣品；(b)處理心臟組織細(xì)胞以去除至少一部分或大致所有的非細(xì)胞外基質(zhì)組分，從而得到脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)；并(c)對脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行滅菌。某些實(shí)施方式中，心臟組織樣品從哺乳動物如非靈長類(如牛、豬、馬、貓、狗、大鼠等等)或靈長類(如猴和人類)，或鳥類來源(如雞、鴨等等)分離得到。心臟組織樣品的脫細(xì)胞過程使用本領(lǐng)域和文中所述的一種或多種物理、化學(xué)和/或生物技術(shù)進(jìn)行。

對于人類治療，已有許多用于心臟細(xì)胞外基質(zhì)材料的潛在來源：人類心臟(包括自體同源的、同種異體的或尸體的)、豬心臟、牛心臟、羊心臟、大鼠心臟、小鼠心臟、兔心臟、雞心臟和其它動物來源。與全心臟移植不同，一個供體心臟可用于治療許多人。非人類動物是一類不要求人類供體的心臟細(xì)胞外基質(zhì)的來源。非人類動物來源可以用作研究試劑。

一些實(shí)施方式中，處理心臟細(xì)胞外基質(zhì)的方法如下所述。首先對心臟組織脫細(xì)胞化，只保留細(xì)胞外基質(zhì)。例如，脫細(xì)胞化可通過十二烷酸硫酸鈉和磷酸緩沖溶液灌注法進(jìn)行。然后凍干心臟細(xì)胞外基質(zhì)，碾碎，并在低pH、約在pH1～6或pH1～4之間以胃蛋白酶、或以其它基質(zhì)降解酶如基質(zhì)金屬蛋白酶進(jìn)行消化。

為了生產(chǎn)凝膠狀的心臟細(xì)胞外基質(zhì)用于體內(nèi)治療，接著以PBS/鹽中和含有心臟細(xì)胞外基質(zhì)的溶液，并調(diào)至所需溫度、濃度和粘度。某些實(shí)施方式中，ECM的濃度可為1～20mg/ml，或2～8mg/ml。然后含有心臟細(xì)胞外基質(zhì)的溶液可通過高規(guī)格針，如27規(guī)格或更高規(guī)格，注射進(jìn)心肌。在體溫中，如36.8℃±0.7℃，該溶液形成凝膠。細(xì)胞、藥物、蛋白或其它治療制劑也可被輸送到心臟ECM凝膠中。

為了生產(chǎn)凝膠狀的心臟細(xì)胞外基質(zhì)用于體外用途，以PBS/鹽中和含有心臟細(xì)胞外基質(zhì)的溶液并調(diào)至所需濃度。一些實(shí)施方式中，ECM濃度可為1～20mg/ml，或2～8mg/ml。接著，該溶液可被放置于任何固體表面上從而進(jìn)入組織培養(yǎng)板/孔。一旦置于37℃或室溫以上的培養(yǎng)箱，該溶液形成可用于細(xì)胞培養(yǎng)的凝膠。

本發(fā)明還提供一種用于受治療者的心臟修復(fù)的治療方法，其包括注射或植入部分或整體本發(fā)明的生物相容性心臟細(xì)胞外基質(zhì)到患者中。本發(fā)明還提供一種用于治療受治療者的心律不齊或其它缺陷、病態(tài)、受損或缺血的組織或器官的治療方法，包括原位注射或植入本發(fā)明的生物相容性材料。

文中的組合物可含有心臟組織來源的脫細(xì)胞化ECM和另一種或多種組分。一些實(shí)例中，全部組合物中ECM的量以重量計高于組合物的90％或95％或99％。一些實(shí)施方式中，全部組合物中的ECM以重量計高于組合物的1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％。

這樣制備脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)以保持大部分用于心肌組織再生的生物活性。文中組合物示例性的生物活性包括但不限于：控制或啟動細(xì)胞粘附、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞成熟、細(xì)胞組織化(cell organization)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞死亡(凋亡)、血管生成刺激、蛋白水解活性、酶活性、細(xì)胞運(yùn)動、蛋白和細(xì)胞調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄激活、供應(yīng)轉(zhuǎn)錄、一些生物活性的抑制例如抑制凝結(jié)、干細(xì)胞誘導(dǎo)(attraction)、趨化性以及MMP或其它酶活性。

該組合物含有實(shí)質(zhì)上脫細(xì)胞化細(xì)胞外基質(zhì)。一些實(shí)例中，脫細(xì)胞化基質(zhì)不含有可使ECM自然形成的非活天然細(xì)胞。一些實(shí)例中，實(shí)質(zhì)上脫細(xì)胞化基質(zhì)含有以重量計少于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的天然細(xì)胞。

如文中所述，組合物可含有脫細(xì)胞化心臟ECM和不同組織脫細(xì)胞化ECM或合成或天然形成的聚合物。文中示例性聚合物包括但不限于：聚對苯二甲酸二乙醇酯纖維(DACRON)、聚四氟乙烯(PTFE)、戊二醛交聯(lián)的心包膜、聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PGA)、透明質(zhì)酸(HA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯、鎳鈦諾(nitinol)和來自動物和非動物來源的膠原(如植物或合成膠原)。一些實(shí)例中，組合物的聚合物為生物相容性的和生物可降解的和/或生物可吸收的。示例性的生物降解或生物可吸收的聚合物包括但不限于：聚丙交酯(polylactide)、聚乙交酯、聚己內(nèi)酯、聚二噁烷和它們的無規(guī)和嵌段共聚物。生物可降解和/或生物可吸收的聚合物可包括選自乙交酯、丙交酯(lactide)、二噁烷、己內(nèi)酯、三亞甲基碳酸酯、乙二醇和賴氨酸的單體。

聚合物材料可以是無規(guī)共聚物、嵌段共聚物或單體混合物、含有這些單體的均聚物、共聚物和/或雜聚物。生物可降解和/或生物可吸收的聚合物可包含生物可吸收和生物可降解的線性脂肪族聚酯如聚乙交酯(PGA)和其無規(guī)共聚物聚(乙交酯-丙交酯)(PGA-co-PLA)。其它適合的生物相容性聚合物的實(shí)例為包括甲基丙烯酸乙酯的聚羥基烷基甲基丙烯酸酯和如聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯酰胺的水凝膠。其它合適的生物可吸收性材料為生物聚合物，其包括膠原、明膠、海藻酸、殼多糖、殼聚糖、纖維蛋白、透明質(zhì)酸、葡聚糖、聚氨基酸、聚賴氨酸和這些材料的共聚物。根據(jù)本發(fā)明考慮了以上實(shí)例的任意組合、共聚物、聚合物或其混合物以供使用。這些生物可吸收材料可根據(jù)已知方法制備。

因此，文中描述了制備含有心肌組織來源的脫細(xì)胞化ECM的組合物的方法。本發(fā)明還提供了以相似的工序得到的骨骼肌組織來源的ECM組合物和方法。還提供了相關(guān)組合物、生產(chǎn)裝置和方法。

一些實(shí)施方式中，當(dāng)在室溫以上包括生理溫度接近37℃受熱時，組合物的粘性增加。根據(jù)一個非限制性的實(shí)施方式，ECM來源的組合物在室溫和35℃以下的其它溫度下為可注射溶液。在另一個非限制性的實(shí)施方式中，該凝膠可在體溫以上約37℃或接近體溫時注射，但在升高的溫度中凝膠化更迅速。凝膠在37℃生理溫度中約15～20分鐘后形成。提供了制備ECM來源的凝膠的原理的總體設(shè)定以及以下實(shí)例中的制備凝膠的優(yōu)選特定方案，實(shí)施例可應(yīng)用于且適用于多種組織包括但不限于心臟和骨骼肌。

可含有細(xì)胞或其它治療制劑的組合物可通過許多方法植入到患者、人類或動物中。一些實(shí)例中，該組合物以液體注射到患者需要的部位。

市售的ECM制劑也可結(jié)合到文中所述的方法、裝置和組合物中。其中一個實(shí)施方式中，ECM從小腸粘膜下層(SIS)獲得。市售制劑包括但不限于SURGISIS^TM、SURGISIS-ES^TM、STRATASIS^TM和STRATASIS-ES^TM(Cook Urological Inc.；Indianapolis,Ind.)及GRAFTPATCH^TM(Organogenesis Inc.；Canton,Mass.)。另一個實(shí)例中，ECM從真皮獲得。市售制劑包括但不限于PELVICOL^TM(為在歐洲以PERMACOL^TM銷售；Bard,Covington,GA.)、REPLIFORM^TM(Microvasive；Boston,Mass.)和ALLODERM^TM(LifeCell；Branchburg,N.J.)。

一些實(shí)例中，本發(fā)明的心臟細(xì)胞外基質(zhì)的溶液、凝膠形式和吸收形式提供與體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的呈相近比例的所有組分。對于心律不齊治療，可輸送本發(fā)明的細(xì)胞外基質(zhì)，其允許解決心律不齊后的心臟組織再生。對于體外心肌細(xì)胞和其它心臟相關(guān)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)，與通常使用的膠原、層粘連蛋白、SURECOAT(CELLUTRON，膠原和層粘連蛋白的混合物)和明膠，本發(fā)明的心臟細(xì)胞外基質(zhì)的凝膠和吸收形式含有所有或許多細(xì)胞體內(nèi)識別的相同的細(xì)胞外基質(zhì)信號。

文中的組合物提供心臟細(xì)胞外基質(zhì)的凝膠或溶液形式，以及心臟細(xì)胞外基質(zhì)的這些形式用于例如如心臟修復(fù)、心律不齊治療和細(xì)胞培養(yǎng)的使用。一個實(shí)施方式中，首先將心臟組織脫細(xì)胞化，只保留細(xì)胞外基質(zhì)。然后將基質(zhì)凍干、碾碎或研磨成細(xì)粉，并以胃蛋白酶或其它酶、例如但不限于基質(zhì)金屬蛋白酶、膠原酶和胰蛋白酶使之溶解。

對于凝膠治療，接著使用PBS/鹽將溶液中和并調(diào)至適合的濃度。一個實(shí)施方式中，該溶液可通過針注射到心肌層(或通過導(dǎo)管經(jīng)由肋骨，或在開胸過程中)。針的規(guī)格可以是但不限于22g、23g、24g、25g、26g、27g、28g、29g、30g或更小。一個實(shí)施方式中，注射溶液所用的針的規(guī)格為27g。也可通過氣囊導(dǎo)管或其它無針導(dǎo)管進(jìn)行輸送?？苫趥麚p組織和患者個人的不同情況而常規(guī)地決定劑量和頻率。體溫中，該溶液可接著形成凝膠。在又一實(shí)施方式中，凝膠可與戊二醛、甲醛、雙-NHS分子或其它交聯(lián)劑交聯(lián)。

在又一實(shí)施方式中，ECM可與其它治療制劑，如細(xì)胞、肽、蛋白質(zhì)、藥物、養(yǎng)分、抗生素、促存活添加劑、蛋白多糖和/或糖胺聚糖結(jié)合。在又一個實(shí)施方式中，ECM可與合成的聚合物結(jié)合和/或交聯(lián)。合成聚合物的實(shí)例包括但不限于：聚對苯二甲酸乙二醇酯纖維(DACRON^TM)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚乳酸(PLA)、聚乙二醇(PGA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙二醇二丙烯酸酯(P′EGDA)、聚乙烯、聚苯乙烯和鎳鈦諾(nitinol)。

在又一實(shí)施方式中，可將ECM溶液或凝膠單獨(dú)或與上述組分組合而注射到梗塞部位、邊緣區(qū)或心肌層，以使內(nèi)源細(xì)胞向內(nèi)生長、血管生成和再生。在又一實(shí)施方式中，組合物可單獨(dú)或與上述組分組合而使用，作為基質(zhì)，以改變心臟的機(jī)械性能和/或阻止負(fù)性左心室重構(gòu)。在又一實(shí)施方式中，該組合物可單獨(dú)或與上述組分組合，與細(xì)胞輸送，用于再生心肌層。在又一實(shí)施方式中，該組合物可單獨(dú)或與上述組分組合而使用，以產(chǎn)生傳導(dǎo)阻斷從而治療心律不齊。

在一制造可溶試劑的實(shí)施方式中，在包括但不限于0.5M、0.1M或0.01M的乙酸或0.1M HCl的低pH溶液中將溶液調(diào)至所需濃度，然后置于組織培養(yǎng)板/孔、蓋玻片、支架或其它用于組織培養(yǎng)的表面。在培養(yǎng)箱中37℃放置1小時后，或在室溫中過夜后，去除過量溶液。以PBS漂洗表面后，可在吸收基質(zhì)上培養(yǎng)細(xì)胞。該溶液可在注射/植入之前、之中或之后，預(yù)先與肽、蛋白質(zhì)、DNA、藥物、養(yǎng)分、促存活添加劑、蛋白多糖和/或糖胺聚糖結(jié)合。

本發(fā)明基于治療組合物和吸收細(xì)胞培養(yǎng)組合物形式的體外心臟細(xì)胞外基質(zhì)，提供增強(qiáng)的細(xì)胞粘附和存活。與標(biāo)準(zhǔn)平板涂層相比，可溶的細(xì)胞培養(yǎng)試劑形式的心臟細(xì)胞外基質(zhì)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞更迅速地擴(kuò)散、更快成熟和/或存活改進(jìn)。

之前的研究顯示，難以將從心肌細(xì)胞獲得的人類胚胎干細(xì)胞(hESC)用于心肌梗塞的治療。一些實(shí)例中，有效分化和體內(nèi)成熟心室心肌細(xì)胞的產(chǎn)率阻礙了治療的有效性。以前，分化調(diào)控主要在體外實(shí)行，例如在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加可溶性因子。該處理過程受胎兒表型以外的分化難度所限。

除了可溶性因子，細(xì)胞外基質(zhì)也可在細(xì)胞分化中起重要作用。對于成體細(xì)胞，包括成體祖細(xì)胞，已研究了一些含有化學(xué)信號的基質(zhì)，但僅進(jìn)行了少量關(guān)于ECM對ESCs的效果、特別是對hESCs的效果的研究。許多實(shí)例中，由hESC得到的心肌細(xì)胞是在含有可溶性因子和明膠的促存活培養(yǎng)基中輸送的。

在文中的一個實(shí)施方式中，公開了從天然心臟中獲得的仿生基質(zhì)。一些實(shí)例中，基質(zhì)與體內(nèi)心臟環(huán)境相似，其含有許多或所有在自然心臟ECM中發(fā)現(xiàn)的天然化學(xué)信號。一些實(shí)例中，通過交聯(lián)或添加或其它材料，也可模仿健康成體或胚胎的心肌層的機(jī)械性能。如文中所述，可用簡單經(jīng)濟(jì)的方法將心臟ECM分離并加工到凝膠中，其適合按比例擴(kuò)大用于臨床轉(zhuǎn)化。

一些實(shí)例中，文中提供的組合物可含有基質(zhì)和外源添加的或募集的細(xì)胞。該細(xì)胞可以是任意各種細(xì)胞。一些實(shí)例中，該細(xì)胞為各種心臟或心臟血管細(xì)胞，包括但不限于：干細(xì)胞、祖細(xì)胞、心肌細(xì)胞、血管細(xì)胞和自體或同種異體來源的成纖維細(xì)胞。

本發(fā)明由此提供由天然脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)制得的凝膠的使用，以支持分離的新生心肌細(xì)胞或體內(nèi)的心肌細(xì)胞來源的干細(xì)胞祖細(xì)胞并起作原位凝膠支架的作用，提供了基質(zhì)以改進(jìn)細(xì)胞在左心室壁的停留和存活。由于從心臟ECM產(chǎn)生的支架比目前可用的材料更準(zhǔn)確接近于體內(nèi)環(huán)境，其適于在心肌層中用于細(xì)胞移植。

文中含有心臟ECM和外源添加的細(xì)胞的組合物可通過在ECM中培養(yǎng)而制得。此外，可在細(xì)胞外基中添加如生長因子的蛋白質(zhì)，也可在組合物中添加蛋白質(zhì)，或蛋白質(zhì)分子可與基質(zhì)中的分子共價或非共價地連接。蛋白質(zhì)與基質(zhì)分子的共價連接可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)共價蛋白質(zhì)連接方法完成。蛋白質(zhì)可與一種或多種基質(zhì)分子共價連接。

在一個實(shí)施方式中，當(dāng)輸送含有脫細(xì)胞化心臟ECM和外源細(xì)胞的組合物時，這些細(xì)胞可以是用于治療心肌層的細(xì)胞來源，包括同種來源、異種來源、自體來源。因此，可通過文中的組合物輸送成體來源的干細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、間葉細(xì)胞、實(shí)質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、造血細(xì)胞、骨髓來源祖細(xì)胞、骨骼細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和自移植的擴(kuò)張的心肌細(xì)胞。一些實(shí)例中，文中的細(xì)胞可在體外培養(yǎng)且可在培養(yǎng)皿環(huán)境中直接向心肌細(xì)胞或可成為心肌細(xì)胞的骨髓細(xì)胞分化。然后將培養(yǎng)的細(xì)胞與組合物或接觸支架和其它組分而移植到哺乳動物中。

成體干細(xì)胞也是另一種可成為文中組合物一部分的細(xì)胞。據(jù)認(rèn)為成體干細(xì)胞通過在新部位產(chǎn)生其它干細(xì)胞(如適于心肌層的細(xì)胞)而起作用，或在體內(nèi)直接分化為心肌細(xì)胞。引導(dǎo)至器官如心臟后它們還可分化成其它類型細(xì)胞。成體哺乳動物由循環(huán)內(nèi)皮前體細(xì)胞、骨髓來源細(xì)胞、脂肪組織、或特殊器官的細(xì)胞為成體干細(xì)胞提供來源。已知從骨髓抽取液分離的單核細(xì)胞在體外分化成內(nèi)皮細(xì)胞，并可在肌肉注射后在新形成的血管中檢測到。因此，采用來自骨髓抽取液的細(xì)胞可在體內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞作為組合物的組分。其它可用于本發(fā)明的細(xì)胞為受激活的細(xì)胞因子調(diào)控的間葉干細(xì)胞。已知間葉細(xì)胞的亞群當(dāng)在體外暴露于細(xì)胞因子時分化為生肌細(xì)胞系。

人類胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞可在文中含有心臟基質(zhì)的組合物上生長。一些實(shí)例中，存在文中的組合物時生長的hESC來源的心肌細(xì)胞表現(xiàn)出與體內(nèi)更相似的形態(tài)學(xué)。一些實(shí)例中，存在文中組合物時生長的hESC來源的心肌細(xì)胞表現(xiàn)出增加的成熟標(biāo)記物。

本發(fā)明還著目于藥物輸送系統(tǒng)，其包括用于輸送細(xì)胞、藥物、分子或蛋白質(zhì)到受治療者中以治療缺陷、病態(tài)、受損或缺血組織或器官的脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)。一個實(shí)施方式中，單獨(dú)或與其它組分結(jié)合的本發(fā)明的含有脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)的生物相容性材料用作無損的傳導(dǎo)阻斷以治療心律不齊。因此，本發(fā)明的生物相容性材料可用來移植細(xì)胞、或單獨(dú)注射以募集天然細(xì)胞或其它細(xì)胞因子內(nèi)源治療制劑、或充當(dāng)外源治療制劑輸送載體。

本發(fā)明的組合物可還含有細(xì)胞、藥物、蛋白質(zhì)或其它生物材料，例如但不限于：促紅細(xì)胞生成素(EPO)、干細(xì)胞因子(SCF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、軟骨生長因子(CGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、角質(zhì)細(xì)胞生長因子(KGF)、骨骼生長因子(SGF)、造血細(xì)胞生長因子(BDGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)、胰島素樣生長因子(IGF)、細(xì)胞因子生長因子(cytokine growth factor,CGF)、干細(xì)胞因子(SCG)、血小板源生長因子(PDGF)、內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(EGGS)、集落刺激因子(CSF)、生長分化因子(GDF)、整合素調(diào)節(jié)因子(IMF)、鈣調(diào)蛋白(CaM)、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)、腫瘤壞死因子(TNF)、生長激素(GH)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)、干擾素、白介素、細(xì)胞因子、整合素、膠原、彈性蛋白、微纖維蛋白、纖粘蛋白、層粘連蛋白、糖胺聚糖、血結(jié)素、血小板反應(yīng)蛋白、硫酸乙酰肝素、皮膚素(dermantan)、硫酸軟骨素(CS)、透明質(zhì)酸(HA)、玻連蛋白、蛋白多糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、腱生蛋白(cytotactin)、生腱蛋白(tenascin)和淋巴因子。

組織培養(yǎng)板可以用本發(fā)明細(xì)胞外基質(zhì)的可溶性配體或凝膠形式、或本發(fā)明的細(xì)胞外基質(zhì)的吸收形式涂覆，以培養(yǎng)心肌細(xì)胞或其它與心臟修復(fù)相關(guān)的細(xì)胞。其可用作培養(yǎng)這些細(xì)胞的研究試劑或移植之前用于培養(yǎng)細(xì)胞的臨床試劑。細(xì)胞外基質(zhì)試劑可與其它組織基質(zhì)和細(xì)胞組合。

對于凝膠試劑組合物，接著使用PBS/鹽或其它緩沖液將溶液中和并調(diào)至合適的濃度，然后置于組織培養(yǎng)板和/或孔中。當(dāng)置于37℃培養(yǎng)箱時，溶液形成可用于細(xì)胞培養(yǎng)用的任何2D或3D培養(yǎng)基材的凝膠。在一個實(shí)施方式中，凝膠組合物可與戊二醛、甲醛、雙-NHS分子或其它交聯(lián)物交聯(lián)，或與細(xì)胞、肽、蛋白質(zhì)、DNA、藥物、養(yǎng)分、促存活添加劑、蛋白多糖和/或糖胺聚糖結(jié)合，或與合成的聚合物結(jié)合和/或交聯(lián)以備將來使用。

本發(fā)明還提供一種在吸收脫細(xì)胞化心臟細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)細(xì)胞的示例性方法，其包括以下步驟：(a)在包括但不限于0.5M或0.01M的乙酸或0.1M HCl的低pH溶液中提供含有脫細(xì)胞化ECM的生物相容性材料的溶液，達(dá)到所需濃度，(b)將上述溶液置于組織培養(yǎng)板或孔中，(c)在室溫以上溫度如37℃中孵育上述培養(yǎng)板或孔1小時并過夜(或在室溫到40℃中)，(d)除去過量溶液，(e)以PBS漂洗組織培養(yǎng)板或孔，并(f)在吸收基質(zhì)上培養(yǎng)細(xì)胞?？稍诤斜景l(fā)明的心臟細(xì)胞外基質(zhì)的吸收基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞包括心肌細(xì)胞或與心臟修復(fù)相關(guān)的其它細(xì)胞類型，包括干細(xì)胞和心臟祖細(xì)胞。

一些實(shí)例中，組合物包括交聯(lián)劑，包括但不限于普通的膠原交聯(lián)劑、透明質(zhì)酸交聯(lián)劑或其它具有改變的降解與機(jī)械性能的蛋白交聯(lián)劑。

一個實(shí)例中，制造文中的組合物的方法包括靜電紡絲法。一些實(shí)例中，設(shè)置本文的方法以控制納米纖維的尺寸、形狀或厚度。

一些實(shí)例中，可使用例如細(xì)胞或體外起搏術(shù)向組合物引入收縮性。收縮性可產(chǎn)生周期應(yīng)力從而促進(jìn)更天然的心肌層。

一些實(shí)例中，當(dāng)組合物含有交聯(lián)基團(tuán)或嵌入因子，如血管生成因子時，可向組合物引入細(xì)胞浸潤和血管生成。

一些實(shí)例中，本文的組合物可含有微珠。微珠可以是組合物的一部分或輸送到組合物中。示例性微珠可以是任意種類的材料，例如天然的或合成的。一些實(shí)例中，微珠可具有不同降解性能或含有例如MMP抑制劑、生長因子或小分子。

一些實(shí)例中，本文的組合物可包括可在輸送組合物中作為粘合劑或錨定物的生物基團(tuán)(biological group)。

一個實(shí)例中，組合物可以是生物粘合劑，例如用于創(chuàng)傷修復(fù)。一些實(shí)例中，本文的組合物可設(shè)置為細(xì)胞粘附劑。例如，本文組合物可在醫(yī)用裝置上涂覆或與含有或不含有細(xì)胞的生物混合。例如，本文組合物可以是合成聚合物血管移植用的涂層。一些實(shí)例中，該組合物含有抗菌劑或抗菌劑包含于其中。

文中的方法包括輸送組合物作為創(chuàng)傷修復(fù)裝置。例如心臟損傷(cardiac ablation)后可輸送組合物以促進(jìn)愈合。

一個實(shí)例中，組合物含有以本文所述的ECM組合物涂覆的藻酸鹽珠。

一些實(shí)例中，該組合物是可注射的?？勺⑸涞慕M合物可以是但不限于粉末、液體、顆粒、碎片、凝膠或乳液。該可注射的組合物可注射到心臟中，或許多實(shí)例中，注射到左心室、右心室、左心房、右心房或心臟瓣膜。本文的組合物可募集例如但不限于內(nèi)皮、平滑肌、心臟祖細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞、干細(xì)胞和心肌細(xì)胞。

制造本文組合物的方法可包括根據(jù)領(lǐng)域內(nèi)我們已知的方法對任意年齡的動物或人類組織進(jìn)行脫細(xì)胞化。

一些實(shí)例中，本文的組合物含有ECM和天然或合成的聚合物。例如，本文的組合物含有天然聚合物如膠原、殼聚糖、藻酸鹽、纖維蛋白或透明質(zhì)酸。另一個實(shí)例中，本文的組合物含有合成的聚合物、例如但不限于聚乙二醇、聚乙醇酸、聚乳酸、聚羥基酸、聚二噁烷酮、聚己內(nèi)酯、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈、聚氨基酸、擬聚氨基酸、導(dǎo)電聚合物(如聚乙炔、聚吡咯、聚苯胺)或聚氨基甲酸酯或它們可能的共聚物。一些實(shí)例中，這里的組合物含有ECM和天然的以及合成的兩類聚合物。文中的組合物可以是通過ECM和另一種聚合物材料連接的多物料，例如通過與胺類、游離硫醇或短肽反應(yīng)，與ECM自組裝。

文中的方法包括含有ECM的組合物的輸送。示例性方法包括但不限于：外科手術(shù)中直接注射；通過胸壁直接注射；通過導(dǎo)管穿過心內(nèi)膜輸送到心肌層；通過冠狀血管輸送；以及通過灌注氣囊導(dǎo)管輸送。組合物還可以固態(tài)輸送，如移植物(graft)、碎片(patch)或與細(xì)胞支架聯(lián)結(jié)。劑量和頻率將根據(jù)患者需求和內(nèi)科醫(yī)生的判斷而不同。

一些實(shí)例中，本文的組合物為涂層。該涂層可含有來自任意組織如心肌、骨骼肌、心包膜、肝、脂肪組織和腦的ECM。涂層可用于組織培養(yǎng)用途，研究和臨床。涂層可用來涂覆例如但不限于合成或其它生物學(xué)的支架/材料或植入物。一些實(shí)例中，使涂層具有某種紋理或圖案。一些實(shí)例中，制造涂層的方法包括吸收或化學(xué)交聯(lián)。薄凝膠或吸收涂層可使用組合物的ECM溶液形式形成。一些實(shí)例中，設(shè)置文中的組合物以封閉心臟如隔膜缺損中的洞。

本文的組合物還可從其它組織如骨骼肌、心包膜、肝、脂肪組織和腦形成。該組合物可用作生物制劑、醫(yī)用裝置或給藥裝置的涂層。

缺少功能性替代物限制了經(jīng)傷損、腫瘤切除、各種肌病而失去的骨骼肌的重建。外科手術(shù)治療如肌肉移植和移位技術(shù)已有一些成功；然而，依然存在替代療法的需求。組織工程方法提供了潛在的新解決方案；然而，當(dāng)前可選方案提供不完全再生。已經(jīng)研究了許多天然來源的和合成的材料作骨骼組織工程的支架，但均不能綜合模擬具有用于細(xì)胞生存、分化和遷移的重要信號的天然骨細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)。

細(xì)胞外基質(zhì)由復(fù)雜的組織特異性的蛋白質(zhì)和多糖網(wǎng)絡(luò)組成，其幫助調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、生存和分化。盡管天然ECM特性復(fù)雜，體外細(xì)胞研究傳統(tǒng)上評價單個ECM組分涂層上的細(xì)胞行為，因此對從體外細(xì)胞研究到體內(nèi)環(huán)境的轉(zhuǎn)化研究結(jié)果產(chǎn)生限制。通常，來自各種動物來源的純化的基質(zhì)蛋白被細(xì)胞培養(yǎng)基材吸收，為細(xì)胞粘附提供蛋白底物并修飾細(xì)胞行為。但是，這些方法不能提供準(zhǔn)確的復(fù)雜微環(huán)境表征。曾用過更復(fù)雜的涂層，如單蛋白結(jié)合，顯示這些結(jié)合的信號影響細(xì)胞行為，但是不像體內(nèi)那樣完整。對于更天然的基質(zhì)，使用了細(xì)胞來源的基質(zhì)。基質(zhì)膠是一個復(fù)雜的系統(tǒng)；但它來源于小鼠肉瘤，不能模擬任何天然組織。許多ECM組分是相似的，但是各組織或器官具有獨(dú)特的組合物，天然獲得的組織特異性來源可能是更好的細(xì)胞微環(huán)境模仿者。

骨骼肌包括高度取向的致密肌纖維束，各復(fù)核細(xì)胞由成肌細(xì)胞得到。天然骨骼肌中的肌纖維在細(xì)胞外三維基質(zhì)中密集在一起，形成具有高細(xì)胞密度和細(xì)胞取向的有序組織，產(chǎn)生縱向收縮。骨骼肌受損后可產(chǎn)生瘢痕組織而導(dǎo)致功能喪失。體外肌肉組織工程作為備選方案對受體進(jìn)行肌肉移植，為治療骨骼肌缺損帶來希望。組織工程組合物必須是生物相容性的，并可被血管化和神經(jīng)支配。

細(xì)胞外基質(zhì)由復(fù)雜的組織特異性的蛋白質(zhì)和多糖網(wǎng)絡(luò)組成，其幫助調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、生存和分化。盡管天然ECM特性復(fù)雜，體外細(xì)胞研究傳統(tǒng)上評價單個ECM組分涂層上的肌肉細(xì)胞行為，因此對從體外細(xì)胞研究到體內(nèi)環(huán)境的轉(zhuǎn)化研究結(jié)果產(chǎn)生限制?？朔讼拗茖?xì)胞介導(dǎo)的治療很重要，其依賴于隨著時間推移培養(yǎng)和擴(kuò)增的細(xì)胞保持天然細(xì)胞行為。

一方面，文中的組合物包括從豬的骨骼肌和心肌獲得的ECM?？砂l(fā)展該組合物形成基材涂層用于不同用途。一些實(shí)例中，組合物的ECM可溶化后保留肌肉特異性的ECM組分的復(fù)雜混合物。一些實(shí)例中，文中的涂層可在體外更恰當(dāng)?shù)匦Х绿烊患∪釫CM。

與接種于涂覆傳統(tǒng)的I型膠原的基材上的細(xì)胞相比時，接種于骨骼肌基質(zhì)上的成肌細(xì)胞在i)肌球蛋白重鏈正極肌管的數(shù)量、ii)每肌管的核數(shù)和iii)肌管寬度呈現(xiàn)明顯的增長。當(dāng)接種于涂覆傳統(tǒng)明膠的基材上的細(xì)胞相比，接種于心肌基質(zhì)上的人類胚胎干細(xì)胞(HES2)來源的心肌細(xì)胞在以下方面呈現(xiàn)明顯的增長：i)肌原纖維區(qū)域、ii)每肌原纖維區(qū)域的心肌細(xì)胞核數(shù)量和iii)橋粒斑尺寸，其凸顯出橋粒細(xì)胞－細(xì)胞連接蛋白、橋粒斑蛋白更大更成熟的閏盤定位。一些實(shí)例中，設(shè)置組合物以提供體內(nèi)重建肌肉ECM的能力。該組合物可提供評價和保持體內(nèi)肌肉和干細(xì)胞的行為與自然狀態(tài)相似的工具，并可提供用于體內(nèi)細(xì)胞介導(dǎo)的治療的工具。

圖2顯示與標(biāo)準(zhǔn)明膠涂層相比，生長在心臟ECM的心肌細(xì)胞的平均肌原纖維區(qū)域顯著增大。圖3顯示與標(biāo)準(zhǔn)明膠涂層相比，心肌細(xì)胞的平均數(shù)量明顯高于心臟ECM。如圖4所示，在心臟ECM上培養(yǎng)時，橋粒斑蛋白、一細(xì)胞內(nèi)的連接蛋白，在112天時特異地定位于心肌細(xì)胞之間和形成有序的橋粒，而在明膠上培養(yǎng)時不出現(xiàn)上述現(xiàn)象。

文中所述的骨骼肌基質(zhì)可以采用與心臟ECM同樣或相似的方式制備?？蓪⒃摴趋兰』|(zhì)注射到骨骼肌中而用于骨骼肌組織工程。圖5顯示培養(yǎng)于骨骼肌基質(zhì)上的骨骼肌成肌細(xì)胞，如文中所述，其顯示增加的肌管大小、增強(qiáng)的分化，且每肌管具有比膠原上培養(yǎng)的成肌細(xì)胞更高的平均核仁數(shù)。采用體外Transwell遷移檢測，如圖6所示，骨骼肌成肌細(xì)胞特異向骨骼肌基質(zhì)遷移。

通過以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，其不應(yīng)以任意方式理解為對本發(fā)明的領(lǐng)域產(chǎn)生限制。顯而易見，對于技術(shù)人員而言，能夠并且考慮在本發(fā)明的領(lǐng)域內(nèi)進(jìn)行各種修改和變動。

實(shí)施例1

對直接注射細(xì)胞到梗塞壁以治療MI已經(jīng)進(jìn)行了各種研究，盡管許多研究顯示較低的存活率。本研究的目的在于測試采用凝膠作生長平臺，用于細(xì)胞粘附、生長、成熟和體內(nèi)運(yùn)輸。提供了由天然心臟細(xì)胞外基質(zhì)組織構(gòu)成的凝膠，可通過促進(jìn)細(xì)胞存活而幫助心臟組織再生。

使Sprague Dawley雌鼠安樂死，采用由Ott等(Nature Medicine,14(2),213,2008)改進(jìn)的方案對它們的心臟進(jìn)行脫細(xì)胞化。接著將脫細(xì)胞化的心臟凍干、再水化、研磨成粉并再次凍干，以形成干粉。根據(jù)Freytes等(Biomaterials 29:1630,2008)所改進(jìn)的方案，接著以胃蛋白酶最低限度消化該ECM并中和。

更特別地，對成年Sprague Dawley雌鼠進(jìn)行肝素化并用戊巴比妥腹腔內(nèi)麻醉。橫切主動脈和肺動脈并去除心臟。將導(dǎo)管插入主動脈并系到改裝的Langendorff裝置上。

用改良的、之前已公開的技術(shù)對心臟進(jìn)行脫細(xì)胞化。簡而言之，以1％十二烷基硫酸鈉(SDS)和PBS溶液對心臟的冠狀血管逆向灌流24小時，然后以1％的triton PBS溶液逆向灌流30分鐘。一旦脫細(xì)胞化完成，則用去洗離子水清洗心臟并在凍干機(jī)中凍干。

用水將冰凍的心臟再水化，然后將其浸沒到液氮中。一旦凍結(jié)，則將心臟在杯球裝置中以70psi系統(tǒng)碾壓10秒。然后將研磨的心臟顆粒凍干。一旦干燥，則將凍干的心臟組織與1％的胃蛋白酶結(jié)合，并與0.01M的HCl混合至濃度為10mg/ml。室溫下攪拌溶液48小時，以使細(xì)胞外基質(zhì)增溶溶解。48小時后，在冰上將該HCl溶液等分到Eppendorf管中，并以0.1N的NaOH中和至pH7.4。

通過上述方法，形成天然大鼠心臟ECM凝膠。如增強(qiáng)的材料粘性所證實(shí)地，2.5～8mg/mL凝膠的成功凝膠化在15分鐘內(nèi)發(fā)生。隨著更高密度的凝膠可觀察到增加的剛度。

以1×PBS稀釋中和的溶液，以每孔50μL接種于96孔板，然后轉(zhuǎn)移到37℃和5％CO₂的培養(yǎng)箱中。凝膠形成后，使用移液器將100μL分離的2d新生心肌細(xì)胞移到凝膠上部，每孔60000細(xì)胞。幾天后，檢測細(xì)胞對凝膠的粘附性。

細(xì)胞外基質(zhì)組織脫細(xì)胞化、磨碎和消化后，一旦溶液處于生理?xiàng)l件(pH＝7.4，37℃)時，凝膠形成。溶液中的ECM組織以較高濃度形成的凝膠與以較低濃度ECM形成的凝膠相比，更硬更不透明。接種于凝膠上的細(xì)胞能夠粘附到凝膠上并且在其上存活。

在心臟ECM凝膠上以1×10⁴接種的心肌細(xì)胞表現(xiàn)出對ECM的成功的粘附和細(xì)胞存活。在ECM上培養(yǎng)這些細(xì)胞至四天。

通過30G針將100mL的心臟ECM溶液(7mg/mL)注射到麻醉鼠的LV游離壁中。本研究顯示，當(dāng)處于生理pH和溫度時，天然心臟細(xì)胞外基質(zhì)可被分離、溶解并自組裝進(jìn)入凝膠。由于凝膠含有所有的天然細(xì)胞外基質(zhì)組分，盡管有些雜亂，但其使該基質(zhì)允許心肌細(xì)胞在體外以及一旦注入體內(nèi)的成功粘附和生長。并且相信，由于由最初來源于心室的基質(zhì)組成的凝膠更準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)心臟環(huán)境，它能更成功地支持心肌細(xì)胞生長，而不是其它基質(zhì)如膠原或纖維蛋白凝膠。

可注射的凝膠可潛在地適應(yīng)任意三維形狀并促進(jìn)心臟內(nèi)的細(xì)胞移植存活。注射的心肌細(xì)胞或可分化為心肌細(xì)胞的細(xì)胞可幫助心臟組織再生，促進(jìn)心輸出量。該方法發(fā)展為產(chǎn)生不同濃度和硬度的天然心臟ECM凝膠平臺，還為細(xì)胞生長提供體外平臺，并作為原位工程支架用于再生。注射到體內(nèi)時，天然ECM為心肌組織工程提供合適的復(fù)雜環(huán)境以增加細(xì)胞停留并促進(jìn)組織再生。

實(shí)施例2

心肌細(xì)胞通常培養(yǎng)于涂覆有一個或可能多種細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白質(zhì)的表面上。但是，在體內(nèi)，心肌細(xì)胞處于高度復(fù)雜的胞外環(huán)境；更準(zhǔn)確模擬該天然環(huán)境的ECM可利于培養(yǎng)的心肌細(xì)胞的存活。這里，報導(dǎo)了已增溶溶解而形成涂層、用于新生心肌細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)的天然心臟ECM。

將心臟從Sprague-Dawley大鼠除去并使用修改的Langendorff方案(由Ott等人改進(jìn)，2008)對心臟進(jìn)行脫細(xì)胞化。將脫細(xì)胞化的心臟凍干、再水化，并在液態(tài)N₂中冷凍后碾碎成粉。以胃蛋白酶的0.01M HCl最低限度消化ECM。48小時后，加入0.01M的乙酸使終濃度為1mg/ml。

使用分離試劑盒(Cellutron,Highland Park,NJ)從新解剖的1至2天大的Sprague-Dawley大鼠的心室獲取心臟心肌細(xì)胞。棄掉最初的上清液，但隨后20分鐘的消化物用含17％M199、10％馬血清、5％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素的DMEM終止并懸浮。分離后，將上清預(yù)接種于苯乙烯組織培養(yǎng)皿上，通過成纖維細(xì)胞的選擇性粘附提高心肌細(xì)胞的純度。

在37℃中以1小時使1mg/ml天然心臟ECM或膠原I(Sigma,St.Louis,MO)吸收至蓋玻片上。以200000/cm³的密度接種分離后的新生心肌細(xì)胞，且在24小時后將培養(yǎng)基更換成低血清培養(yǎng)液(DMEM，18.5％M199，5％HS，1％FBS及抗生素)。細(xì)胞培養(yǎng)維持在37℃和5％CO₂，每日監(jiān)測，并每2～3天更換新鮮的培養(yǎng)液。

心肌細(xì)胞粘附到吸收的天然ECM上，并形成局部融合層。起初，心肌細(xì)胞以相似的密度粘附到膠原涂層上。

細(xì)胞培養(yǎng)物均在接種后第3天開始自發(fā)搏動。培養(yǎng)于膠原上的心肌細(xì)胞在第12天開始分離，并在第14天停止搏動。但培養(yǎng)于天然心臟ECM的心肌細(xì)胞形成了清晰界定的纖維，其以同樣的頻率搏動直至第28天。

本研究證明，由于天然心臟ECM更準(zhǔn)確的模擬體內(nèi)條件，其用于心肌細(xì)胞培養(yǎng)是有益的。本研究還證明，新生心肌細(xì)胞粘附到天然心臟ECM上并且比在典型的膠原涂層上作用更持久。該新的涂層對培養(yǎng)干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞以及心臟祖細(xì)胞是有用的。

實(shí)施例3

這里，研究了已脫細(xì)胞化和增溶溶解的成年心室的天然心臟細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞涂覆用途。該優(yōu)勢在于，天然心臟ECM比傳統(tǒng)的細(xì)胞表層具有更多組分，并且比預(yù)處理其它細(xì)胞型更易于使用。

將心臟從Sprague-Dawley大鼠除去并使用修改的Langendorff方案(由Ott等人改進(jìn)，2008)對心臟進(jìn)行脫細(xì)胞化。將脫細(xì)胞化的心臟凍干、再水化，并在液態(tài)N₂中冷凍后碾碎成粉。以胃蛋白酶的0.01M HCl最低限度消化ECM。48小時后，加入0.01M的乙酸使終濃度為1mg/ml。

對天然心臟ECM的胃蛋白消化物在使用DTT的還原性條件進(jìn)行心室凝膠電泳，并與層粘連蛋白(BD biosciences)和牛皮膠原(calf skin collagen)(Sigma)比較。使用Imperial Protein Stain(Pierce)對凝膠染色。與膠原和層粘連蛋白相比，天然心臟ECM可顯示更復(fù)雜的ECM組分的混合物。

使用分離試劑盒(Cellutron,Highland Park,NJ)從1至2天大的Sprague-Dawley大鼠的心室獲取心臟心肌細(xì)胞。棄掉最初的上清液，但隨后20分鐘的消化物用含17％M199、10％馬血清、5％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素的DMEM終止并懸浮。分離后，將上清預(yù)接種于苯乙烯組織培養(yǎng)皿上，通過成纖維細(xì)胞的選擇性粘附提高心肌細(xì)胞的純度。

在37℃中以1小時使1mg/ml天然心臟ECM或膠原I(Sigma,St.Louis,MO)吸收至48孔板上。以200000/cm²的密度接種分離后的新生心肌細(xì)胞，且在24小時后將培養(yǎng)基更換成低血清培養(yǎng)液(DMEM，18.5％M199，5％HS，1％FBS及抗生素)。細(xì)胞培養(yǎng)維持在37℃和5％CO₂，每日監(jiān)測，并每2～3天更換新鮮的培養(yǎng)液。在第2天、第4天和第7天對細(xì)胞進(jìn)行固定，并對α輔肌動蛋白、連接蛋白43(connexin43)、pan-cadherin、肌動蛋白和細(xì)胞核染色。第2天心肌細(xì)胞在培養(yǎng)基中開始自發(fā)搏動。培養(yǎng)于膠原上的細(xì)胞在第8天開始從平板分離。培養(yǎng)于天然心臟ECM的一組細(xì)胞持續(xù)搏動直至第45天。培養(yǎng)于膠原上的所有細(xì)胞均在第14天停止搏動。

現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)涂層通常是吸收到組織培養(yǎng)板或支架上的簡單蛋白。采用更復(fù)雜的環(huán)境有利于細(xì)胞存活和成熟。本研究顯示，天然心臟ECM比其它標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)涂層含有更多的復(fù)雜組分。新生鼠心肌細(xì)胞粘附到作為細(xì)胞培養(yǎng)用的涂層的天然心臟ECM上，并自發(fā)地開始搏動。隨時間推移，培養(yǎng)于天然心臟ECM上的心肌細(xì)胞顯示增強(qiáng)的輔肌動蛋白、連接蛋白43(connexin 43)、pan-cadherin染色。并且，與膠原相比，新生的心肌細(xì)胞在天然心臟ECM上具有提高的存活能力和粘附能力。

實(shí)施例4

這里，研究了文中所述的凝膠的使用，其中凝膠由天然脫細(xì)胞心臟ECM制得。該凝膠可作為原位凝膠支架，提供天然心臟基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞LV壁中細(xì)胞停留和存活。

對Sprague Dawley雌鼠心臟和豬心臟進(jìn)行脫細(xì)胞化。將心臟組織切至～2mm厚并以去離子水漂洗，然后在1％十二烷基硫酸鈉(SDS)中攪拌4～5天直至脫細(xì)胞化。在1％Triton X-100中30分鐘的附加的攪拌步驟確保完全脫細(xì)胞化，隨后在去離子水中過夜攪拌并在去離子水中最后漂洗。

然后將脫細(xì)胞化的心臟凍干、碾碎成粉或研磨，并再次凍干以形成干粉。然后在胃蛋白酶中消化該ECM并中和。

然后通過添加氫氧化鈉和10X PBS將溶解的心臟ECM調(diào)至生理pH或pH 8。然后以PBS稀釋中和后的心臟細(xì)胞外基質(zhì)溶液至所需濃度并使其在37℃中在96孔板中凝膠化。目測該材料證實(shí)了2.5～8mg/ml凝膠的成功凝膠化。隨著更高密度的凝膠可觀察到增加的剛度。

測試了不同實(shí)驗(yàn)條件從而為心臟ECM支架凝膠化確定不同的消化。進(jìn)行心室凝膠電泳以比較消化條件的內(nèi)容物，并比較ECM內(nèi)容物與鼠尾膠原。確定初始pH在心臟ECM的消化和凝膠化中起重要作用。消化進(jìn)行48～72小時。

凝膠電泳顯示0.01M HCl對天然心臟ECM的不完全消化。在0.1M HCl中消化心臟ECM顯示增強(qiáng)的降解。由此顯示更強(qiáng)的酸性條件促進(jìn)心臟ECM溶液的消化和凝膠化。對比心臟ECM和鼠尾膠原說明心臟ECM中存在各種額外的胃蛋白酶。

采用掃描電鏡觀察心臟細(xì)胞外基質(zhì)凝膠形式的結(jié)構(gòu)。以2.5％戊二醛固定凝膠2小時，接著進(jìn)行一系列乙醇漂洗(30～100％)，并在臨界點(diǎn)干燥。樣品在成像前用鉻進(jìn)行濺射鍍膜(sputter coated)。

通過30G針將濃度為6mg/ml心臟ECM的溶解的天然ECM成功注射到鼠LV游離壁這，產(chǎn)生原位凝膠支架，心肌細(xì)胞粘附并在其上增殖。

實(shí)施例5

使用市售的遷移測定試劑盒進(jìn)行測定心臟脫細(xì)胞化ECM溶液的體外化學(xué)趨化特性(chemoattractive properties)。簡單地說，將人類冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAECs)和鼠主動脈平滑肌細(xì)胞(RASMCs)血清饑餓，并評價向基質(zhì)、膠原、胃蛋白酶和胎牛血清的遷移。RASMCs顯示向基質(zhì)顯著的遷移，而HCAECs顯示趨勢。因此，基質(zhì)的生化信號具有能夠在體內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞浸潤的化學(xué)趨化特性。

在體內(nèi)，在注射區(qū)域內(nèi)定量微動脈的形成以評價新生血管的形成。與注射后4h相比，微動脈的密度在注射后11天顯著更大。

實(shí)施例6

當(dāng)在MI后注射到心肌壁中時，數(shù)個細(xì)胞類型已經(jīng)顯示保護(hù)心臟功能。然而，無細(xì)胞處理能夠消除用細(xì)胞療法時普遍的低細(xì)胞存活率和免疫反應(yīng)的并發(fā)癥。

心肌梗塞是在大鼠中使用25min缺血－再罐注模型通過閉合左前降動脈誘導(dǎo)的。在MI后一周，從MRI圖計算基線函數(shù)。

將豬心肌ECM以小塊在1％SDS中脫細(xì)胞數(shù)天，隨后通過DI漂洗過夜、凍干并研磨以產(chǎn)生粉末。消化在0.1M HCl中以胃蛋白酶進(jìn)行，從而生成可溶形式的材料。

注射前，使用1M NaOH將溶解性的ECM調(diào)至PH 7.4并以PBS稀釋至為6mg/ml。MI手術(shù)后，將動物隨機(jī)分為2組，梗塞手術(shù)后兩周，將ECM或鹽水通過30G針注射到Sprague Dawley雌鼠的LV游離壁中。

注射手術(shù)后4周(MI后6周)，使用MRI再次評價心臟功能。

以ECM注射的動物在6周顯示保持的功能(基于注射部分進(jìn)行的評價)，而鹽水注射的動物沒有維持心臟功能。心臟舒張末期和心臟收縮末期體積在ECM注射的動物中也得到了保持。

實(shí)施例7

當(dāng)前，干細(xì)胞和其它細(xì)胞類型正在用于治療心力衰竭的臨床試驗(yàn)，其通過穿過27G的導(dǎo)管輸送到心肌壁中。將豬心室組織使用SDS洗滌劑進(jìn)行脫細(xì)胞化，并加工以形成可溶形式的基質(zhì)，中和至生理PH并稀釋至6mg/ml用于注射。

2只Yorkshire豬接受線圈誘導(dǎo)的心肌梗塞(coil-induced myocardial infarction)，并在梗塞后2個月用單獨(dú)的心肌基質(zhì)或與細(xì)胞一起進(jìn)行注射。

將胎牛心臟外植物來源的物質(zhì)用DiI、一種cyotoplasmic染料進(jìn)行預(yù)先標(biāo)記用于組織學(xué)鑒定。使用顯示在嚙齒動物模型中增強(qiáng)hESC存活的促存活的雞尾酒(cocktail)。

通過NOGA定位引導(dǎo)，將單獨(dú)的基質(zhì)或與細(xì)胞一起以臨床相關(guān)速率0.2mL每30s通過導(dǎo)管進(jìn)行注射。5次每次0.1mL的注射由單獨(dú)的基質(zhì)或與細(xì)胞一起進(jìn)行，注射到梗塞的緣帶區(qū)域。

單獨(dú)的基質(zhì)或與細(xì)胞一起的基質(zhì)能夠成功地注射到豬的心臟內(nèi)，最低限度侵襲地且不阻塞細(xì)導(dǎo)管。

實(shí)施例8

這里，將脫細(xì)胞化的心包組織來源的凝膠的研究和使用描述為具有通過促進(jìn)體內(nèi)新生血管形成以改進(jìn)在LV壁的細(xì)胞保留和存活的自體療法的潛能。

豬和人的心包均進(jìn)行過脫細(xì)胞。使Juvenile農(nóng)場雄豬安樂死，通過由Ott等(Nature Medicine,14(2),213,2008)改良的步驟將它們的心包脫細(xì)胞。具體而言，將心包簡單地在DI水中漂洗，在1％十二烷基硫酸鈉(SDS)中攪拌24h，然后在DI中攪拌近5h。人心包組織樣品從接受心胸手術(shù)的患者中收集。這些樣品以相似的方式進(jìn)行脫細(xì)胞：簡短的DI漂洗，隨后在1％SDS中3天，隨后DI漂洗過夜。在這兩種情況下，完整的脫細(xì)胞化均用組織學(xué)染色進(jìn)行驗(yàn)證。

下述的步驟對于人和豬的心包ECM樣品均是有效的。

接著將脫細(xì)胞心包或心包ECM冷凍、凍干，并研磨以形成精細(xì)干燥粉末。然后通過由Freytes等(Biomaterials 29:1630,2008)改良的方法，將ECM粉末以溶解于HCl的胃蛋白酶消化并中和。

凝膠電泳(SDS-PAGE)表明與胃蛋白酶消化的膠原相比的更大的復(fù)雜性，其顯示心包樣品中較小的帶的寬度范圍。

復(fù)雜性通過用質(zhì)譜法分析樣品進(jìn)行確認(rèn)以確定蛋白質(zhì)碎片。確定的ECM蛋白質(zhì)的碎片包括膠原、彈性蛋白、纖維蛋白和各種蛋白聚糖。

當(dāng)將150μl的中和溶液加載到96孔板內(nèi)并使其位于培養(yǎng)箱中，在2～3h后觀察凝膠作用。

體內(nèi)凝膠作用通過注射60μl的中和ECM溶液到Sprague Dawley雄鼠的左心室(LV)壁進(jìn)行觀察。來自注射后45min處死的動物的切片心臟的組織學(xué)染色顯示在LV壁可見的凝膠的ECM區(qū)域。

在相同的實(shí)驗(yàn)中，將動物培養(yǎng)2周，之后將它們處死，收集它們的心臟用于切片。在這個時間點(diǎn)，ECM注射劑仍然可見，但已經(jīng)被細(xì)胞浸潤。

免疫組化在組織切片上進(jìn)行，以確定平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，指示血管。在ECM注射劑區(qū)域內(nèi)大量血管的存在顯示該材料促進(jìn)新生血管形成。

實(shí)施例9

用于體外細(xì)胞培養(yǎng)的表面涂層通常由一種或幾種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)形成。其提供細(xì)胞粘著表面，但它并不能模仿體內(nèi)細(xì)胞外微環(huán)境。文中提出了制備各種組織來源的細(xì)胞外基質(zhì)的吸收涂層的方法，這些組織包括心臟、骨骼肌、肝臟、心包、脂肪組織和大腦。

取出來自豬和鼠源的組織并進(jìn)行脫細(xì)胞化。使用各種洗滌劑對豬和鼠源的心臟組織、骨骼肌和肝臟以及豬源的大腦、脂肪和心包進(jìn)行脫細(xì)胞化。將心臟、骨骼肌和肝臟組織切片至為～2mm厚，以去離子水漂洗，然后在PBS的1％十二烷基硫酸鈉(SDS)中攪拌直至脫細(xì)胞化。用于脫細(xì)胞化的時間取決于組織類型。將大腦切成兩半，并在PBS的0.001％SDS中緩慢攪拌。將心包組織在PBS的1％SDS中進(jìn)行脫細(xì)胞化，將脂肪組織在2.5mM脫氧膽酸鈉中進(jìn)行脫細(xì)胞化，然后以脂肪酶進(jìn)一步處理。液測試了其它脫細(xì)胞劑。然后將脫細(xì)胞化組織在去離子水中漂洗以保證洗滌劑的去除，然后凍干。

除了脫細(xì)胞化的大腦和脂肪ECM，對脫細(xì)胞化ECM進(jìn)行研磨以形成干燥粉末。然后將ECM使用胃蛋白酶在低酸性條件下進(jìn)行消化以形成用作涂層的可溶形式，然后使用0.1M乙酸稀釋至希望的濃度1mg/ml。使用垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳證實(shí)在各個組織類型里肽碎片的復(fù)雜的混合物，其在不同組織各不相同。這證實(shí)了在脫細(xì)胞化ECM中存在組織特異性組分。

這些涂層可以以如通常的單蛋白質(zhì)涂層相同的方式應(yīng)用于表面。通過在模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境的組織特異性涂層上培養(yǎng)細(xì)胞，具有對存活和細(xì)胞形態(tài)更好的控制，且能增強(qiáng)分化。

將鼠皮質(zhì)神經(jīng)元在大腦基質(zhì)上培養(yǎng)并與聚-1-賴氨酸的標(biāo)準(zhǔn)涂層比較。鼠皮質(zhì)神經(jīng)元在大腦基質(zhì)涂層上存活，且與標(biāo)準(zhǔn)涂層相比，保持它們的分枝狀形態(tài)更為持久。當(dāng)骨骼成肌細(xì)胞在骨骼肌基質(zhì)涂層上培養(yǎng)時，與標(biāo)準(zhǔn)的膠原涂層相比，還觀察到增加的分化百分率和增加的肌管寬度。最后，當(dāng)接種于心臟基質(zhì)涂層時，與通常的凝膠涂層相比，心肌來源的人胚胎干細(xì)胞顯示增加的組織形成和成熟，包括細(xì)胞間連接的形成。

實(shí)施例10

這里，研究文中所述的凝膠的使用，其中，所述凝膠是由天然脫細(xì)胞的骨骼肌ECM形成。凝膠可以作為原位凝膠支架起作用，提供天然骨骼肌基質(zhì)以提高在腿部損傷模型中的組織再生。其優(yōu)勢在于，骨骼肌ECM具有與體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的基質(zhì)相似的組分，且可以提供合適的用于組織工程和再生、細(xì)胞募集和細(xì)胞輸送的平臺。

對豬骨骼肌進(jìn)行脫細(xì)胞化。將組織切片為～2mm厚并以去離子水漂洗，然后在PBS的1％十二烷基硫酸鈉(SDS)中攪拌直至脫細(xì)胞化。然后將脫細(xì)胞組織在去離子水中漂洗以保證洗滌劑的去除。將多塊脫細(xì)胞化組織切片并使用蘇木精和伊紅染色以保證細(xì)胞的去除。然后將脫細(xì)胞組織凍干并研磨形成精細(xì)粉末。

然后將骨骼肌ECM在蛋白酶在低酸性條件下消化，然后通過加入氫氧化鈉和10X PBS中和至生理或近生理PH。然后將中和的骨骼肌ECM溶液以PBS稀釋至希望的濃度6mg/ml，并使其在37℃在96孔板內(nèi)凝膠化。目視檢查材料確定了成功的凝膠化。

將濃度6mg/ml溶解的天然骨骼肌ECM通過25G針成功注射到大鼠大腿股肌中，形成凝膠支架。凝膠作用在10～15min內(nèi)發(fā)生。將肌肉和ECM切除，切片并使用蘇木精和伊紅染色以確認(rèn)骨骼肌ECM在骨肌肉中成功的凝膠作用。

骨骼肌ECM也可以用于輸送細(xì)胞，比如在ECM中的骨骼成肌細(xì)胞或其它肌肉相關(guān)細(xì)胞類型。

文中展示和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但這些實(shí)施方式只是以例子的方式提供，這對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠在不脫離本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行多種的變動、改變和替換。應(yīng)當(dāng)理解的是可以在實(shí)踐中采用文中描述的本發(fā)明的實(shí)施方式的各種替代對象。因此其包括所述權(quán)利要求所限定本發(fā)明的范圍，以及這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及它們的等價形式。