一種用于骨軟骨界面修復(fù)的具有梯度活性的支架材料及其制備方法和應(yīng)用
【專利說明】一種用于骨軟骨界面修復(fù)的具有梯度活性的支架材料及其制備方法和應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及生物材料技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種用于骨軟骨界面修復(fù)的具有梯度活性的支架材料及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]關(guān)節(jié)軟骨由含膠原纖維的致密結(jié)締組織形成基本框架，這種框架呈半環(huán)形，其底端緊緊附著在骨質(zhì)上，上端朝向關(guān)節(jié)面，該結(jié)構(gòu)使軟骨與骨緊密結(jié)合從而難以脫落，同時當受到壓力時，還允許有少量變形，起到緩沖壓力的作用。在膠原纖維之間，分布著形態(tài)漸變的軟骨細胞。由淺層向深層，軟骨細胞逐漸由扁平樣過渡至橢圓或圓形，維持軟骨的正常代謝。軟骨可分為四層，各層中細胞的形狀與大小、膠原纖維的粗細與走向、蛋白多糖的濃度、水的含量，均不相同。淺表層，膠原纖維密集排列，形成膜樣結(jié)構(gòu)，蛋白多糖的濃度相對較低，水分含量最多；中間層，膠原纖維隨機排列，相互交織。軟骨細胞呈隨機分布；放射排列層，含蛋白多糖最多，膠原纖維最粗，且自下而上呈放射狀排列，垂直于軟骨表面，而軟骨細胞成串定位于此層中；鈣化軟骨層，鄰接軟骨下骨。
[0004]關(guān)節(jié)軟骨沒有神經(jīng)和血管，其營養(yǎng)供給是通過關(guān)節(jié)活動產(chǎn)生的壓力變化，使滑液在關(guān)節(jié)腔與軟骨基質(zhì)之間流通來完成，故損傷后的關(guān)節(jié)軟骨難以自行修復(fù)與再生，且易導(dǎo)致明顯的功能障礙。關(guān)節(jié)軟骨缺損在臨床上十分常見，常常導(dǎo)致患者出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛、活動受限，誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎，甚至導(dǎo)致肢體功能障礙和殘缺，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，已成為目前肢體殘障的主要原因之一。
[0005]現(xiàn)階段，臨床應(yīng)用的治療軟骨損傷的方法主要是:(1) 口服藥物、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射透明質(zhì)酸、關(guān)節(jié)灌洗術(shù)和清理術(shù)等，但只能起到緩解癥狀，延緩病情進展的作用，不能修復(fù)已損傷的軟骨及軟骨下骨；(2)鉆孔術(shù)、微骨折術(shù)等手術(shù)可利用經(jīng)髓腔自然滲透到鉆孔區(qū)的、未經(jīng)過特殊處理的少量間充值干細胞(MSCs)修復(fù)缺損，但其刺激所新生成的是疤痕組織和以I型膠原為主的纖維軟骨，不具備正常關(guān)節(jié)軟骨的生物力學(xué)性能，遠達不到關(guān)節(jié)軟骨力學(xué)的需要；(3)自體軟骨細胞移植或自體骨軟骨塊嵌合移植，獲得了一定的治療效果，但取材來源有限，軟骨細胞擴增能力欠佳及對供區(qū)造成傷害等原因大大限制了其應(yīng)用；(4)同種異體軟骨移植，雖然可提供相應(yīng)位置的供體材料，但存在免疫排斥反應(yīng)、供體受體融合不完全、軟骨分離等弊端，且面臨疾病傳播的風(fēng)險。
[0006]
目前最新發(fā)展的組織工程，是將分離的自體細胞種植于細胞支架(scaffold)或細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)上，使細胞在預(yù)制形態(tài)的三維支架上增殖分化，然后將這種細胞雜化材料(hybrid material)植入軟骨缺損部位。在生物材料逐步降解的同時，種植的骨細胞不斷增殖，從而達到修復(fù)組織缺損的目的。
[0007]現(xiàn)在使用的軟骨修復(fù)支架材料可分為天然支架材料和人工支架材料兩大類。天然支架材料是來源于動、植物或者人體內(nèi)天然存在的大分子材料，具有良好的生物相容性、組織親合性。人工支架材料是目前研究較多的材料，主要有高分子聚合物，無機物等，可根據(jù)需要調(diào)整其物理、化學(xué)、生物力學(xué)和降解性能，容易加工成形，生產(chǎn)重復(fù)性好。無機物以碳酸鈣、磷酸三鈣、羥基磷灰石為主。近年來，羥基磷灰石(HA)因其與骨礦物質(zhì)相似而成為骨骼修復(fù)材料。它可以作為骨替代物而進行軟骨修復(fù)，或涂于接骨材料表面使其植入體內(nèi)后有更好的修復(fù)效果，但簡單的涂抹或者混合不能夠非常準確地將HA涂層涂于受損傷表面，并且對基材要求高，涂層組成結(jié)構(gòu)不均一等缺點，同時傳統(tǒng)煅燒法制備羥基磷灰石對實驗要求較高，因此需要發(fā)展新的醫(yī)療HA應(yīng)用技術(shù)。模擬人體骨磷灰的生物礦化過程引起關(guān)注，它是指在有機基質(zhì)調(diào)控和參與下生物礦物在生物體內(nèi)的形成過程。這種方法能夠在與基質(zhì)水溶液接觸的表面上形成均一的磷灰石涂層，并由仿生礦化過程在人體溫度下進行，且用該種方法形成的HA在組成結(jié)構(gòu)性能與天然骨基質(zhì)更為相近，是很好的生物相容性骨修復(fù)材料。因此模擬生物礦化成為等離子噴涂法制備經(jīng)基磷灰石涂層最有前景的替代技術(shù)。
[0008]于此同時，研究發(fā)現(xiàn)近年來在所構(gòu)建的支架材料只側(cè)重于修復(fù)軟骨，且往往是各向均一的。在體內(nèi)，軟骨并非是單一結(jié)構(gòu)的組織，且軟骨與骨緊密結(jié)合在一起，才能行使其傳遞應(yīng)力的功能。因此，需要制備模擬體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的復(fù)合生物材料，特別是骨軟骨界面結(jié)構(gòu)，才能提供類似體內(nèi)的細胞微環(huán)境，從而使得軟骨組織缺損的修復(fù)更牢固、成功。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有組織工程支架材料結(jié)構(gòu)單一，機械性能不足，以及操作過于繁瑣，無法量化生產(chǎn)等不足，提供了一種用于骨軟骨界面修復(fù)的具有梯度活性的支架材料及其制備方法和應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
本發(fā)明提供了一種用于骨軟骨界面修復(fù)的具有梯度活性的支架材料，所述支架材料由以下制備方法制成:S1.將鈣鹽溶液和含有酪蛋白的碳酸鹽溶液混合，攪拌，清洗，過濾、干燥后得到含有酪蛋白的復(fù)合碳酸鈣微球；
52.將SI中含有酪蛋白的復(fù)合碳酸鈣微球分散于N，N-二甲基甲酰胺中，得到懸浮液A ;將生物醫(yī)用可降解聚合物溶解于二氯甲烷中，得到溶液B ;將A加入B中，攪拌，制備成膜，干燥后將成膜材料在堿性溶液下浸泡，待用；
53.將S2中所得物質(zhì)加入無菌SBF溶液，進行礦化，清洗，干燥后即得所述支架材料。
[0011]本發(fā)明通過將含有酪蛋白碳酸鈣復(fù)合微球與生物醫(yī)用可降解聚合物在一定條件下進行復(fù)合，并原位進行礦化，得到了具有層狀結(jié)構(gòu)的含納米羥基磷灰石的有機無機復(fù)合材料。
[0012]該層狀結(jié)構(gòu)為沿著復(fù)合材料厚度方向上，各組分的相對含量不同且底層與表層結(jié)構(gòu)也不同。
[0013]優(yōu)選地，所述SI中鈣鹽溶液和含有酪蛋白的碳酸鹽溶液混合體積比為1:1，所述含有酪蛋白的碳酸鹽溶液中酪蛋白的質(zhì)量體積濃度為8mg/ml ；
所述含有酪蛋白的復(fù)合碳酸鈣微球直徑為1~2μπι。
[0014]優(yōu)選地，所述S2中N，N- 二甲基甲酰胺與二氯甲烷的混合體積比為1:3。
[0015]優(yōu)選地，所述生物醫(yī)用可降解聚合物包括聚己內(nèi)酯、聚乳酸-羥基乙酸共聚物或聚乳酸。
[0016]優(yōu)選地，當所述S2中加入聚已內(nèi)酯制備成溶液B時，聚己內(nèi)酯的分子量為70000-90000 Da，所述S2中成膜材料，按質(zhì)量體積百分數(shù)計，聚已內(nèi)酯濃度為8%~20 w/v%,CaCO3濃度為 4%~10 w/v %。
[0017]優(yōu)選地，當所述S2中加入聚乳酸-羥基乙酸共聚物時，按質(zhì)量體積百分數(shù)計，聚乳酸-羥基乙酸共聚物濃度為5 %~20 w/v % ;所述成膜材料中聚乳酸-羥基乙酸共聚物與CaCO3的質(zhì)量比為2~3:1。
[0018]優(yōu)選地，當所述S2中加入聚已內(nèi)酯制備成膜材料時，成膜方法為將A加入B中，攪拌，靜電紡絲成膜；
所述S2紡絲中推動速度為1.0 ml/h，流量為0.6-1.2 ml/h，施加電壓值為10~20 kV，接收距離為10~20 cm ；
所述靜電紡絲成膜的纖維直徑為600~1000 nm。
[0019]優(yōu)選地，當所述S2中加入制備聚乳酸-羥基乙酸共聚物成膜材料時，成膜方法為將A與B的混合溶液溶于二氧六環(huán)溶液中，澆注成膜于培養(yǎng)皿中，真空干燥24 h~72h ;
所述澆注成膜厚度為300~600 nm。
[0020]優(yōu)選地，所述S2中成膜材料在0~4°C條件下浸泡0.1~1 h ;
更具體地，所述成膜材料在1.5 M的NaOH溶液下浸泡，浸泡的目的是為了提高CaCO^j球的暴露程度并增加復(fù)合膜的表面親水性。
[0021]所述S3中將S2中所得物質(zhì)經(jīng)75%酒精滅菌，風(fēng)干12~24 h，加入無菌SBF溶液，于37°C浸泡14天；14天后移去礦化液，去離子水清洗三遍，冷凍干燥后，即得所述支架材料。
[0022]本發(fā)明通過將無機的含有酪蛋白的碳酸鈣復(fù)合微球和有機的生物醫(yī)用可降解材料進行復(fù)合，并在一定條件下原位礦化，形成了具有生物活性的梯度分布的納米羥基磷灰石。而直接采用納米羥基磷灰石作為原料復(fù)合有機聚合物形成的支架材料，其表征結(jié)果顯示材料組成結(jié)構(gòu)不均一且羥基磷灰石容易發(fā)生團聚，并不能獲得本發(fā)明原位礦化后形成的羥基磷灰石層狀仿生結(jié)構(gòu)。
[0023]進一步地，通過對本發(fā)明制備得到的支架材料進行細胞培養(yǎng)實驗后發(fā)現(xiàn)，其細胞生長情況良好，7天后細胞增殖率達到了 160%和90%，顯示了其良好的細胞培養(yǎng)活性。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明制備了具有梯度活性的生物支架材料，其中含具有骨誘導(dǎo)活性的酪蛋白CaCO3復(fù)合微球，分布于復(fù)合支架中，并結(jié)合體外礦化，使具有生物活性的納米HAP在復(fù)合材料沿厚度方向呈梯度分布，很好的模擬了骨軟骨界面結(jié)構(gòu)。該材料不僅具有促進骨細胞鈣吸收、成骨活性的作用。同時，該骨軟骨界面修復(fù)支架材料，在多層結(jié)構(gòu)中沿用了同一種聚合物，黏合牢固，還可有效解決軟骨與骨的整合問題。且本發(fā)明所述的軟骨修復(fù)膜，制備工藝中不接觸有毒物質(zhì)，未使用變性劑、促凝劑和交聯(lián)劑等添加劑，并且制備工藝簡單，成本低，無需大型設(shè)備，在醫(yī)學(xué)組織工程修復(fù)上有很高的應(yīng)用前景和實用價值。
【附圖說明】
[0025]圖1為酪蛋白碳酸鈣復(fù)合微球的掃描電鏡圖； 圖2為實施例2具有梯度活性的支架材料復(fù)合靜電紡絲膜表面、背面、截面的掃描電鏡圖；
圖3為實施例3具有梯度活性的支架材料復(fù)合澆注膜表面、背面、截面的掃描電鏡圖。
[0026]圖4為對比例I制備得到的材料形貌圖。其中圖4A為直接采用羥基磷灰石原料復(fù)合得到的材料的形貌圖，圖4B為本發(fā)明實施例2得到的支架材料表面礦化形成的羥基磷灰石放大后的形貌圖。
[0027]圖5為實施例2和實施例3的梯度活性的支架材料細胞培養(yǎng)實驗圖，其中5A為細胞在實施例2靜電紡絲支架上生長狀況，圖5B為細胞在實施例3PLGA澆注支架上生長狀況。
【具體實施方式】
[0028]下面通過實施例對本發(fā)明進行具體描述，有必要在此指出的是本實施例只用于對本發(fā)明進行進一步說明，但不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。
[0029]除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0030]實施例1酪蛋白/碳酸鈣微球的制備
配制濃度為50 mM|丐鹽(氯化|丐)溶液和50 mM的碳酸鹽(碳酸鈉和8 mg/ml酪蛋白)，兩溶液等體積混合，在600 rpm攪拌20 min，反復(fù)清洗三遍并冷凍干燥。將材料固定于樣品臺上，噴金處理，置于熱場發(fā)射掃描電鏡的真空室內(nèi)，15 kV電壓下觀察，得到SEM觀察圖。產(chǎn)品如圖1所示，微球分散均勻，并且大小約I ym，為均勻球形。