一種骨膜生物支架與異體種子細胞復(fù)合的培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種骨膜生物支架與異體種子細胞復(fù)合的培養(yǎng)方法，通過制備無免疫源性骨膜生物支架和種子骨膜細胞，將無免疫源性骨膜生物支架低溫干燥后密封，使用γ射線消毒后，將種子骨膜細胞以濃度為1×106/ml，滴于消毒的支架表面，待骨膜細胞逐漸隨著懸液滲入無免疫源性骨膜生物支架內(nèi)部后添加培養(yǎng)基，每2～3天換液，培養(yǎng)1周，進行體外復(fù)合培養(yǎng)。該方法所獲取的骨膜生物支架中具有免疫源性的細胞去除徹底，細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)及主要成分保留完好，異體骨膜細胞可以與生物支架有效復(fù)合，為骨缺損、骨不愈的組織工程研究提供生物復(fù)合支架材料。
【專利說明】一種骨膜生物支架與異體種子細胞復(fù)合的培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種骨膜生物支架與異體種子細胞復(fù)合的培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]骨膜具有較強的成骨能力，在骨折愈合修復(fù)方面扮演著重要角色，骨膜也被認為是促進骨移植材料在移植區(qū)域發(fā)揮修復(fù)作用的始動因素。然而自體骨膜移植存在供體不足、供區(qū)結(jié)構(gòu)功能損害等問題，而異體骨膜移植則存在嚴重的免疫排斥反應(yīng)等問題。因此解決異體骨膜中的免疫排斥問題將是實現(xiàn)骨膜移植的重要環(huán)節(jié)。組織中具有主要免疫源性的成份為細胞，在去除細胞的同時也意味著免疫源性的去除。目前去除細胞的方法主要包括物理方法、化學(xué)方法和酶法。
[0003]骨膜組織通過物理、化學(xué)及相關(guān)酶的作用后雖然可以有效去除具有免疫源性的細胞成份，然而處理過程中勢必會對細胞外基質(zhì)的成份和結(jié)構(gòu)造成不可避免的破壞，進而影響該支架的生物相容性，令細胞難以與其復(fù)合。因此，通過優(yōu)化脫免疫源性的處理所獲取的理想的無免疫源性骨膜生物支架應(yīng)是在去除細胞成份的同時又盡可能完整地保留支架細胞外基質(zhì)的主要生物活性成份及結(jié)構(gòu)，為異體種子細胞地長入提供一個合適的、天然的生長空間。另一方面，支架材料和種子細胞是骨組織工程中必不可少的兩個核心環(huán)節(jié)，支架材料在體外復(fù)合種子細胞可以保證其植入靶位置后具有更強的修復(fù)重建能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種骨膜生物支架與異體種子細胞復(fù)合的培養(yǎng)方法，目的在于制備復(fù)合骨膜細胞的組織工程支架，為骨缺損、骨不愈的組織工程研宄提供生物復(fù)合支架材料。
[0005]本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0006]一種骨膜生物支架與異體種子細胞復(fù)合的培養(yǎng)方法，該方法包括以下步驟:
[0007]I)無免疫源性骨膜生物支架的制備和鑒定；
[0008]2)將保存的無免疫源性骨膜生物支架低溫干燥后密封，使用Y射線消毒；
[0009]3)取異體骨膜組織剪成碎塊，用膠原酶消化4h，取上清液離心后收集細胞，放于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，獲得種子骨膜細胞；
[0010]4)將種子骨膜細胞以濃度為lX106/ml，滴于消毒的支架表面，待骨膜細胞逐漸隨著懸液滲入無免疫源性骨膜生物支架內(nèi)部后添加培養(yǎng)基，每2?3天換液，培養(yǎng)I周。
[0011]進一步:
[0012]步驟(I)具體為包括以下步驟:
[0013]a.將骨膜組織沖洗，在_80°C條件下冷凍24?48h，取出后37°C條件下融化，重復(fù)3?5次；
[0014]b.在 3% 曲拉通-X100 (Triton-XlOO)和 3.5X l(T5mol/L 苯甲基黃酰氟(PMSF)的脫細胞液震蕩12h，PBS反復(fù)沖洗并放入I %十二烷基硫酸鈉(SDS)中繼續(xù)震蕩6h ；
[0015]c.沖洗后將骨膜組織放于混有0.001U/L RNA酶和0.1U/L DNA酶的混合消化酶液中 30 ?40min ；
[0016]d.在體積分數(shù)1%的過氧乙酸溶液浸泡消毒4h，既得無免疫源性骨膜生物支架，置于含0.1U/L的青鏈霉素的PBS液中4°C環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> [0017]步驟(2)中使用γ射線消毒，照射總劑量為15KGray。
[0018]步驟(3)所述的膠原酶為2g/L的I型膠原酶，所述的培養(yǎng)瓶內(nèi)含10%胎牛血清和I %青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0019]步驟⑷所述的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和I %青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0020]本發(fā)明的有益效果為運用物理凍融、去污劑洗脫和酶消化等方法所獲取的骨膜生物支架中含免疫源性的細胞結(jié)構(gòu)去除徹底，細胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)及成分保留完好，所用的異體骨膜細胞可以與該骨膜生物支架有效復(fù)合。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是正常骨膜組織學(xué)染色觀察圖；a為DAPI染色；b為HE染色；c為Masson染色；
[0022]圖2是無免疫源性骨膜組織學(xué)染色觀察圖；a為DAPI染色；b為HE染色；c為Masson 染色；
[0023]圖3是骨膜掃描電鏡觀察圖；a為正常骨膜掃描電鏡觀察圖；b為無免疫源性骨膜掃描電鏡觀察圖；
[0024]圖4是復(fù)合支架組織學(xué)檢查圖；&為HE染色觀察細胞與支架復(fù)合培養(yǎng)情況；b為熒光下觀察細胞在支架上的復(fù)合情況。

【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發(fā)明的較佳實施例而已，并非對本發(fā)明做其他形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發(fā)明方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0026]實施例1兔脛骨無免疫源性骨膜生物支架與種子細胞復(fù)合的培養(yǎng)方法
[0027]1、材料
[0028]實驗動物:為健康新西蘭大白兔，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，3?4月齡，體質(zhì)量約為2.0?2.5kg，雌雄不限，常規(guī)飲食飲水，分籠飼養(yǎng)。
[0029]主要試劑及儀器設(shè)備:曲拉通-X100 (Triton-XlOO，Sigma公司)，十二烷基硫酸鈉(SDS，美國Sigma公司)，苯甲基黃酰氟(PMSF，美國Sigma公司)，RNA酶、DNA酶(美國Sigma公司)，I型膠原酶(美國GIBCO公司)，DNA提取試劑盒(大連TAKARA公司)，羥脯氨酸(Hyp)測試盒(南京凱基生物)，DAPI染液(美國Sigma公司)，CCK-8 (日本同仁)，胎牛血清(美國GIBCO公司)，青霉素、鏈霉素(上海博蘊生物有限公司)，DMEM/F-12培養(yǎng)基(美國GIBCO公司)，恒溫震蕩機(德國Heidolph公司)、微量紫外分光光度儀(美國NanoDrop公司)、CX31_32RFL熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、S_3000N型掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)、MRX-HD全自動酶標分析儀(美國B1tek公司)、C02培養(yǎng)箱(德國 Hera-cell 公司)。
[0030]2、無免疫源性骨膜生物支架材料的制備
[0031]2.1兔脛骨骨膜的分離取材
[0032]予體積分數(shù)為3%的戊巴比妥鈉lml/kg耳緣靜脈麻醉后，于雙側(cè)脛骨近端內(nèi)側(cè)分離骨膜。術(shù)中仔細剔除骨膜表面肌肉等軟組織，用無菌手術(shù)刀片切取1.5cmXl.5cm范圍的骨膜全層后使用骨膜剝離器緊貼骨皮質(zhì)表面緩慢剝下骨膜。整個分離取材過程盡量保持術(shù)野清潔，骨膜組織保持形態(tài)完整。
[0033]2.2骨膜免疫源性成份去除過程
[0034]將取出的游離骨膜用PBS反復(fù)沖洗3-4次，去除組織上殘留的血液及其他雜質(zhì)，放入-80°C冰箱內(nèi)冷凍24-48小時后取出后37°C條件下融化(反復(fù)5個循環(huán))后，放入含3%Triton-XlOO和3.5 X 10_5mol/LPMSF的脫細胞液中置于37°C恒溫震蕩機上震蕩12小時，后予PBS反復(fù)沖洗并放入1% SDS中繼續(xù)震蕩6小時。沖洗后將骨膜放于混有0.001U/L RNA酶和0.1U/L DNA酶的混合消化酶液中30?40分鐘后，予體積分數(shù)I %過氧乙酸溶液浸泡消毒4小時，PBS充分沖洗3遍后置于含0.1U/L的青鏈霉素的PBS液中4°C環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> [0035]3、無免疫源性骨膜生物支架的鑒定
[0036]3.1大體觀察
[0037]觀察新鮮骨膜組織及經(jīng)物理凍融，Triton-XlOO, SDS震蕩作用及RNA酶、DNA酶等混合消化酶液處理后，骨膜組織呈現(xiàn)白色疏松海綿狀結(jié)構(gòu)。
[0038]3.2組織學(xué)檢查
[0039]正常組及脫免疫源性處理后的骨膜，經(jīng)4%多聚甲醛固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋、切片，常規(guī)行組織學(xué)HE染色、DAPI染色和Masson染色后觀察，如圖1和圖2所示，經(jīng)處理后骨膜組織中具有免疫源性的細胞已完全去除，而細胞外基質(zhì)中的主要成份(膠原)則有效保留。
[0040]3.3膠原定量檢測
[0041]采用羥脯氨酸測量法，根據(jù)羥脯氨酸在膠原蛋白中含量占13.4%以推算脫免疫源性處理前后膠原含量的變化。具體采用羥脯氨酸測試盒(凱基生物)里說明書所提供的步驟操作:精確稱取正常骨膜組織(η = 6)和處理后骨膜組織(η = 6)濕重30?10mg放入試管中并加入水解液，沸水浴20分鐘后，調(diào)節(jié)PH值至6.0?6.8左右，經(jīng)反復(fù)離心、純化后和標準液一同予550nm的酶標儀檢測吸光度并計算每毫克組織Hyp含量以進一步得出骨膜組織的膠原含量。結(jié)果顯示無免疫源性骨膜生物支架(34.72±1.29yg/mg)與正常骨膜組織(35.95 ± 1.65 μ g/mg)膠原含量差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0.05)。
[0042]3.4DNA定性定量分析
[0043]去正常骨膜及脫免疫源性處理后的骨膜質(zhì)量約為2?25mg，在56°C水浴中經(jīng)蛋白酶K和RNA酶水解后，提取基因組DNA (按照TakaraDNA試劑盒說明操作)，微量紫外分光光度儀測定其濃度，并計算每毫克組織DNA含量。結(jié)果顯示無免疫源性骨膜生物支架DNA含量(32.4±8.5ng/mg)較正常骨膜組織(1281.6±631.6ng/mg)明顯減低。
[0044]3.5掃描電鏡觀察
[0045]正常組及脫免疫源性處理后的骨膜組織用3%戊二醛固定24小時后，PBS沖洗，乙醇梯度(體積分數(shù)為50%、70%、80%、90%、95%、100%)脫水，每個脫水15min以上，真空干燥，表面噴金處理后在掃描電子顯微鏡下觀察，如圖3所示，見無免疫源性骨膜生物支架表面呈疏松多孔結(jié)構(gòu)，更有利于細胞復(fù)合。
[0046]4、骨膜細胞的分離和培養(yǎng)
[0047]無菌條件下取出游離骨膜，反復(fù)予PBS沖洗后在超凈臺上用眼科剪將骨膜剪成Imm3左右碎塊，用2g/L的膠原酶放于37°C、含5% C02的培養(yǎng)箱中消化4h，取上清液，1200r/min離心5min離心收集細胞，放于含10%胎牛血清和1%的DMEM/F12培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，當細胞鋪滿瓶底時進行傳代，收集第二代骨膜細胞進行后續(xù)復(fù)合。
[0048]5、骨膜細胞與支架復(fù)合
[0049]取無免疫源性骨膜生物支架低溫干燥后密封包裝，使用γ射線(15KGray)消毒。消毒后置于干燥培養(yǎng)皿中，將分離的第二代骨膜細胞以濃度為I X 106/ml，滴于支架表面，待骨膜細胞逐漸隨著懸液滲入無免疫源性骨膜生物支架內(nèi)部(3小時)后添加培養(yǎng)基，每2-3天換液，培養(yǎng)I周。
[0050]6、復(fù)合支架的組織學(xué)檢查
[0051]取培養(yǎng)7天后的復(fù)合支架予PBS清洗后添加Live-dead染液，熒光下觀察細胞在支架上的復(fù)合情況；經(jīng)4%多聚甲醛固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟、包埋、切片，常規(guī)行組織學(xué)HE染色觀察細胞與支架復(fù)合培養(yǎng)情況，如圖4所示，結(jié)果均顯示異體骨膜細胞可在該支架上有效復(fù)合并增殖。
【權(quán)利要求】
1.一種骨膜生物支架與異體種子細胞復(fù)合的培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟: 1)無免疫源性骨膜生物支架的制備和鑒定； 2)將保存的無免疫源性骨膜生物支架低溫干燥后密封，使用γ射線消毒； 3)取異體骨膜組織剪成碎塊，用膠原酶消化4h，取上清液離心后收集細胞，放于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，獲得種子骨膜細胞； 4)將種子骨膜細胞以濃度為lX106/ml，滴于消毒的支架表面，待骨膜細胞逐漸隨著懸液滲入無免疫源性骨膜生物支架內(nèi)部后添加培養(yǎng)基，每2?3天換液，培養(yǎng)I周。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種骨膜生物支架與異體種子細胞復(fù)合的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(I)具體為包括以下步驟: a.將骨膜組織沖洗，在_80°C條件下冷凍24?48h，取出后37°C條件下融化，重復(fù)3?5次； b.在3%Triton-XlOO和3.5X10-5mol/L PMSF的脫細胞液震蕩12h，PBS反復(fù)沖洗并放入1% SDS中繼續(xù)震蕩6h; c.沖洗后將骨膜組織放于混有0.001U/L RNA酶和0.1U/L DNA酶的混合消化酶液中30 ?40min ； d.在體積分數(shù)I%的過氧乙酸溶液浸泡消毒4h，制得無免疫源性骨膜生物支架，置于含0.1U/L的青鏈霉素的PBS液中4°C環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種骨膜生物支架與異體種子細胞復(fù)合的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟⑵中使用γ射線消毒，照射總劑量為15KGray。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種骨膜生物支架與異體種子細胞復(fù)合的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(3)所述的膠原酶為2g/L的I型膠原酶，所述的培養(yǎng)瓶內(nèi)含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種骨膜生物支架與異體種子細胞復(fù)合的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(4)所述的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基。
【文檔編號】A61L27/36GK104511052SQ201410781495
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2014年12月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月16日
【發(fā)明者】陳雷, 陳凱, 林賢豐 申請人:溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院