本發(fā)明涉及植物病理學(xué)技術(shù)。具體是一種香蕉枯萎病菌實(shí)驗(yàn)室材料的常備形態(tài)及其制備與應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
香蕉枯萎病是香蕉上的重大病害，可給香蕉生產(chǎn)造成毀滅性的重大損失，該病害由香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum)侵染造成。香蕉枯萎病菌在普通培養(yǎng)基上容易生長，菌絲體發(fā)達(dá)；在實(shí)驗(yàn)室工作中，通常用試管斜面培養(yǎng)基將香蕉枯萎病菌培養(yǎng)成斜面菌落，并以菌落的菌絲體材料作為日常工作的常備材料。有關(guān)研究工作的出發(fā)點(diǎn)均以菌絲體材料為起始，通過移植常備材料菌絲體，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)或進(jìn)入具體項目的研究工作。這種以菌絲體作為日常工作材料的常備形態(tài)，通常較簡單方便，不過也存在某些不足，如下：
在與生長速率(或生長量)測定有關(guān)的研究工作(如生長發(fā)育的影響因素測定，藥物的抑制作用測定等)中，往往需要菌絲體的定量移植，而移植培養(yǎng)基中的菌絲體卻很難做到準(zhǔn)確定量，至今的常規(guī)方法是需要先移植菌絲體到培養(yǎng)平板上擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用打孔器在擴(kuò)大培養(yǎng)的平板菌落上打取等同直徑的菌絲塊，以此菌絲塊進(jìn)行定量移植；這種定量方式不僅要增加一段擴(kuò)大培養(yǎng)的程序環(huán)節(jié)，而且由于培養(yǎng)平板的厚薄不一致，以及菌落不同部位菌絲體的密集程度、生理狀態(tài)等也有差異，造成不同菌絲塊之間難以達(dá)到較高的一致性。
許多研究工作(如孢子萌發(fā)的影響因素，病害接種等)，使用的直接材料通常是分生孢子，同樣要將常備材料(菌絲體)移植到合適的培養(yǎng)基，先行孢子制備培養(yǎng)工作，獲得孢子后才能實(shí)施相關(guān)工作。這相當(dāng)于相關(guān)工作進(jìn)程需要延后，不能及時開展。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種香蕉枯萎病菌實(shí)驗(yàn)室材料的常備形態(tài)及其制備與應(yīng)用方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：
香蕉枯萎病菌實(shí)驗(yàn)室材料的常備形態(tài)，是用香蕉枯萎病菌的分生孢子作日常工作的常備形態(tài)；分生孢子純凈無污染；分生孢子存放于無菌水中；分生孢子暫停生長發(fā)育，但轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上能馬上恢復(fù)正常生長發(fā)育。
香蕉枯萎病菌實(shí)驗(yàn)室材料的常備形態(tài)的制備與應(yīng)用方法，制備與應(yīng)用方法步驟如下：
1.分生孢子的制備培養(yǎng)
用三角瓶作培養(yǎng)器具，裝盛馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基作產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組分配比為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL；將香蕉枯萎病菌的菌絲體移植入三角瓶內(nèi)的產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)，直到培養(yǎng)基面上形成菌落和分生孢子。
2.香蕉枯萎病菌材料常備形態(tài)的制備
取無菌水注入步驟1培養(yǎng)獲得的產(chǎn)孢菌落上，輕輕洗脫菌落上的孢子，獲得含有菌絲碎段的孢子液；用滅菌紗布過濾去除該孢子液中的菌絲碎段；將該孢子液進(jìn)行離心沉淀，倒掉上清液，除去孢子液中混雜的菌體代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基組分；剩下的沉淀為純凈的分生孢子；以該純凈分生孢子作為香蕉枯萎病菌材料的常備形態(tài)；用無菌水將沉淀孢子懸浮，攪動使孢子充分分散，獲得香蕉枯萎病菌材料的常備孢子液。
3.香蕉枯萎病菌材料常備形態(tài)的孢子含量標(biāo)定
用無菌水將步驟2獲得的常備孢子液的孢子濃度，調(diào)配為106孢子/mL。
4.香蕉枯萎病菌材料常備形態(tài)的日常存放
在無菌條件下，將步驟3標(biāo)定的常備孢子液分裝到有蓋密閉的滅菌容器內(nèi)，并轉(zhuǎn)移到25℃的暗環(huán)境中存放備用。
5.香蕉枯萎病菌材料常備形態(tài)的應(yīng)用
將步驟4存放的香蕉枯萎病菌材料常備孢子液轉(zhuǎn)到超凈工作臺，振蕩裝存常備孢子液的容器，使分生孢子充分懸浮和分散；開蓋后用移液器定量吸取孢子液，移植到相關(guān)的工作環(huán)節(jié)或?qū)嶒?yàn)程序中；吸液移植操作完畢后回蓋密封，將剩余的常備孢子液轉(zhuǎn)回步驟4的存放處存放。
本發(fā)明的特色與優(yōu)點(diǎn)是：
1)常備形態(tài)的分生孢子在純水中能暫停生長，但轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基，能馬上恢復(fù)正常生長。
2)可在相關(guān)工作中隨時應(yīng)用，能為需要分生孢子的試驗(yàn)環(huán)節(jié)直接提供菌體材料，可省去使用菌絲體作為常備材料時，需要反復(fù)制備培養(yǎng)孢子的工作程序，工作方便快捷。
3)用三角瓶作培養(yǎng)器具，容易獲得無污染的純凈孢子液，制備獲得的常備形態(tài)質(zhì)量較高。
4)能標(biāo)定常備孢子液的孢子含量，應(yīng)用時可以準(zhǔn)確定量取用，利于技術(shù)方法標(biāo)準(zhǔn)化。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
在香蕉枯萎病的有關(guān)研究中，通常采用香蕉枯萎病菌的菌絲體材料作常備形態(tài)，每次需要分生孢子材料時，均要移植常備菌絲體到新的培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)和制備培養(yǎng)孢子。當(dāng)前還未見有應(yīng)用分生孢子作常備移植體的技術(shù)思想和技術(shù)應(yīng)用。發(fā)明人在研究工作中發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病菌的分生孢子在純水中能暫停生長發(fā)育，但轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基上能馬上恢復(fù)正常生長發(fā)育；利用此有利的的生物學(xué)特性，本發(fā)明設(shè)計香蕉枯萎病菌實(shí)驗(yàn)室材料的另一種常備形態(tài)，就是以香蕉枯萎病菌的分生孢子材料作常備形態(tài)，以及該常備形態(tài)的制備與應(yīng)用技術(shù)。
用液體振蕩培養(yǎng)方法通常能制備獲得香蕉枯萎病菌大量的分生孢子成品，但該方法需要振蕩培養(yǎng)設(shè)備，而且獲得的分生孢子成品含有較多的培養(yǎng)基成分、菌體代謝產(chǎn)物、及菌絲體，因而一般實(shí)驗(yàn)室也常用固體平板培養(yǎng)法制備香蕉枯萎病菌孢子。
當(dāng)前實(shí)驗(yàn)室所用的固體平板培養(yǎng)法是利用培養(yǎng)皿作培養(yǎng)器具，但由于培養(yǎng)皿的結(jié)構(gòu)缺陷決定了培養(yǎng)皿內(nèi)外的空氣交流順暢，容易導(dǎo)致培養(yǎng)皿內(nèi)的生物材料污染。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在相對封閉的三角瓶內(nèi)，香蕉枯萎病菌也能正常產(chǎn)孢，而三角瓶阻止污染的效果非常好，因而采用三角瓶作培養(yǎng)器具進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)。
香蕉枯萎病菌可在許多培養(yǎng)基上生長并形成分生孢子，本發(fā)明采用實(shí)驗(yàn)室常用的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，其配比為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL。香蕉枯萎病菌在三角瓶裝盛的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上，在溫度為28℃的條件下培養(yǎng)5～7天，可在培養(yǎng)基面上形成和布滿大量產(chǎn)孢的菌落。
產(chǎn)孢菌落上的分生孢子可用無菌水洗滌收集，用玻棒或小毛刷等工具輕輕抹洗菌落就能將孢子洗滌釋放到無菌水中。
收集孢子的洗滌操作會導(dǎo)致培養(yǎng)基組分和菌落菌絲體的外泌代謝物溶解在孢子液中，這些物質(zhì)可能容易導(dǎo)致孢子的生長或失活，因而需要去除；可采用離心沉淀孢子方式去除這些物質(zhì)。
作為香蕉枯萎病菌材料常備形態(tài)的孢子液，孢子濃度可高可低，考慮到過高濃度可能會影響孢子的活性，以及與后續(xù)應(yīng)用的需要匹配，將常備孢子液的孢子濃度調(diào)整在106孢子/mL較為適宜，孢子的數(shù)量用血球計數(shù)板測定。
裝存香蕉枯萎病菌材料常備孢子液的容器應(yīng)采用可滅菌及可蓋封密閉的器具，如普通冷凍管或離心管等，用5mL冷凍管裝存較為實(shí)用方便；需要裝存量較多的，可用三角瓶或大冷凍管(或大離心管)。
存放環(huán)境以室溫為宜，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在溫度為25℃的暗環(huán)境存放效果好。
使用香蕉枯萎病菌常備孢子液前，需要將常備孢子液振蕩，使已沉淀的孢子重新懸浮和分散均勻。在無菌條件下用移液器取出常備孢子液，可直接用于相關(guān)的試驗(yàn)工作環(huán)節(jié)，如香蕉枯萎病菌的平板培養(yǎng)、液體培養(yǎng)、或香蕉枯萎病的人工接種等。常備孢子液中的孢子分散性好，菌體液的均勻一致性高，加上液體容易準(zhǔn)確定量吸取，因而，本發(fā)明的常備孢子液特別有利于需要定量移植菌體的培養(yǎng)工作，如測定香蕉枯萎病菌生長發(fā)育的影響因素，測定藥物的抑制作用等。
為降低實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)致常備形態(tài)孢子液污染的機(jī)率，應(yīng)盡量減少從裝存常備孢子液的容器內(nèi)反復(fù)吸取液體的頻率，實(shí)際工作可按試驗(yàn)設(shè)計的需要，一次性全部吸取夠整次試驗(yàn)用的孢子液量，置于另外的滅菌容器內(nèi)，再從該容器內(nèi)逐一定量吸取孢子液，移植到各個培養(yǎng)平板、三角瓶培養(yǎng)基、或各個寄主接種部位、等相關(guān)的工作環(huán)節(jié)或?qū)嶒?yàn)程序中。
實(shí)施例1
應(yīng)用本發(fā)明香蕉枯萎病菌實(shí)驗(yàn)室材料的常備形態(tài)及其制備與應(yīng)用方法，培養(yǎng)制備獲得香蕉枯萎病菌菌株Fo-1以分生孢子為菌體的實(shí)驗(yàn)室常備形態(tài)材料；制備與應(yīng)用菌株Fo-1材料的常備形態(tài)按如下步驟實(shí)施操作：
1.分生孢子的制備培養(yǎng)
用三角瓶作培養(yǎng)器具，裝盛馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基作產(chǎn)孢培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基的組分配比為：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL；將香蕉枯萎病菌菌株Fo-1的菌絲體移植入三角瓶內(nèi)的產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，在28℃溫度下培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)基面上的菌落形成大量的分生孢子。
2.香蕉枯萎病菌材料常備形態(tài)的制備
取無菌水注入步驟1培養(yǎng)獲得的產(chǎn)孢菌落上，輕輕洗脫菌落上的孢子，獲得含有菌絲碎段的孢子液；用滅菌紗布過濾去除該孢子液中的菌絲碎段；將該孢子液進(jìn)行離心沉淀，倒掉上清液，除去孢子液中混雜的菌體代謝產(chǎn)物和培養(yǎng)基組分；剩下的沉淀為純凈的分生孢子；以該純凈分生孢子作為香蕉枯萎病菌材料的常備形態(tài)；用無菌水將沉淀孢子懸浮，攪動使孢子充分分散，獲得香蕉枯萎病菌菌株Fo-1的常備孢子液。
3.香蕉枯萎病菌材料常備形態(tài)的孢子含量標(biāo)定
用無菌水將步驟2獲得的常備孢子液的孢子濃度，調(diào)配為106孢子/mL。
4.香蕉枯萎病菌材料常備形態(tài)的日常存放
在無菌條件下，將步驟3標(biāo)定的常備孢子液分裝到5mL冷凍管內(nèi)，并轉(zhuǎn)移到25℃的暗環(huán)境中存放備用。
5.香蕉枯萎病菌材料常備形態(tài)的應(yīng)用
將步驟4存放的香蕉枯萎病菌材料常備孢子液轉(zhuǎn)到超凈工作臺，振蕩裝存常備孢子液的容器，使分生孢子充分懸浮和分散；開蓋后用移液器吸取孢子液使用；吸液操作完畢后回蓋密封，將剩余的常備孢子液轉(zhuǎn)回步驟4的存放處存放。
用移液器定量吸取該常備孢子液5μL，移植到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)平板中部，28℃培養(yǎng)2天后，能生長成一個典型的小菌落。
吸取10μL已標(biāo)定的常備孢子孢子液，移植到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液，28℃溫度下振蕩培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)液內(nèi)形成大量新一代分生孢子。
實(shí)施例2
應(yīng)用本發(fā)明香蕉枯萎病菌實(shí)驗(yàn)室材料的常備形態(tài)及其制備與應(yīng)用方法，培養(yǎng)制備獲得香蕉枯萎病菌菌株Fo-2以分生孢子為菌體的實(shí)驗(yàn)室常備形態(tài)材料；制備與應(yīng)用菌株Fo-2材料的常備形態(tài)按實(shí)施例1的步驟1至步驟5實(shí)施操作，不同的只是步驟1所用的菌株是Fo-2，步驟2獲得香蕉枯萎病菌菌株Fo-2的常備孢子液。
用移液器定量吸取已標(biāo)定的常備孢子液5μL，移植到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)平板中部，28℃培養(yǎng)2天后，能生長成一個典型的小菌落。
吸取10μL已標(biāo)定的常備孢子孢子液，移植到馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液，28℃溫度下振蕩培養(yǎng)5天后，培養(yǎng)液內(nèi)形成大量新一代分生孢子。