一種納米細(xì)菌的培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種納米細(xì)菌的培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)國(guó)際前列腺炎合作網(wǎng)1998年提出的前列腺炎分類方法，前列腺炎共分為四 型。I型：急性細(xì)菌性前列腺炎，指前列腺急性細(xì)菌感染；II型：慢性細(xì)菌性前列腺炎，指前 列腺慢性復(fù)發(fā)性細(xì)菌感染；III型：慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合癥（CP/CPPS)，其定義 為病史在3個(gè)月以上，骨盆區(qū)疼痛或不適，不同程度的排尿或性交時(shí)不適，此型根據(jù)前列腺 按摩液、精液中白細(xì)胞計(jì)數(shù)又分為炎癥性和非炎癥性兩種亞型；IV型無(wú)臨床炎癥性前列腺 炎，沒(méi)有癥狀，只是在病理檢查或檢查其他癥狀時(shí)發(fā)現(xiàn)前列腺按摩液中存在白細(xì)胞才偶然 被診斷。其中I型、II型患者數(shù)量少，IV型前列腺炎因無(wú)任何癥狀，勿須處理，亦無(wú)重要臨床 意義。只有III型前列腺炎患者因常規(guī)檢查及培養(yǎng)未能發(fā)現(xiàn)明確的病原體，病因不明，發(fā)病機(jī) 制不清，不能進(jìn)行針對(duì)性治療，臨床療效差，而且患者數(shù)量占臨床慢性前列腺炎患者的60% 以上。
[0003] 研宄發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌能分泌鈣化脂多糖生物膜，具有較強(qiáng)的毒性。人體內(nèi)感染的納 米細(xì)菌，主要經(jīng)泌尿系統(tǒng)排出體外。排尿時(shí)尿道高壓可引起尿液返流進(jìn)入前列腺導(dǎo)管和腺 胞內(nèi)，在此過(guò)程中，尿液中的納米細(xì)菌容易被伴隨轉(zhuǎn)移，進(jìn)入到前列腺內(nèi)，這可能在納米細(xì) 菌感染前列腺過(guò)程中發(fā)揮主要和積極的作用。此外，前列腺導(dǎo)管細(xì)長(zhǎng)、彎曲、開口處口徑小， 與尿道成直角或斜行向上進(jìn)入尿道，也有利于尿道病原體進(jìn)入腺體，不利于腺體炎性滲出 物排除和引流，病原體可長(zhǎng)期寄生在其中。以上諸多因素為納米細(xì)菌在前列腺內(nèi)感染和致 病提供了條件和可能。
[0004] 關(guān)于納米細(xì)菌與III型前列腺炎和前列腺結(jié)石可能存在的病因?qū)W關(guān)系，目前國(guó)內(nèi)外 只有少數(shù)學(xué)者在臨床方面進(jìn)行了探索。Jones等最初研宄結(jié)果顯示，前列腺炎患者血清中 納米細(xì)菌抗原經(jīng)過(guò)ELISA分析檢出率顯著高于正常男性及前列腺增生患者。Shoke等通過(guò) 對(duì)頑固性III型前列腺炎伴結(jié)石患者用四環(huán)素抗納米細(xì)菌治療后，發(fā)現(xiàn)患者臨床癥狀顯著改 善，結(jié)石變小或消失；還有人分別從III型前列腺炎患者的EPS及前列腺結(jié)石中分離、培養(yǎng)出 納米細(xì)菌細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)其中納米細(xì)菌具有較高感染率，分別達(dá)62. 5%、65%。在針對(duì)性治療 后，EPS中納米細(xì)菌陽(yáng)性率明顯下降。因此推斷納米細(xì)菌與III型前列腺炎和前列腺結(jié)石之 間存在著較密切關(guān)系，考慮為其重要病因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于提供一種納米細(xì)菌的培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)鑒定方法，旨在為研 宄納米細(xì)菌與III型前列腺炎和前列腺結(jié)石之間可能存在的病因關(guān)系收集收集病原菌，更好 地用于指導(dǎo)臨床工作，減輕病患的身心痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，節(jié)約更多的醫(yī)療資源。
[0006] 本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種納米細(xì)菌的培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)鑒定方法包括：
[0007] 步驟一、EPS標(biāo)本的采集：
[0008] 消毒尿道外口，無(wú)菌操作取5ml初段尿記為VBl ;排出約50?IOOml尿液后再取 5ml中段尿記為VB2 ;行經(jīng)直腸前列腺按摩，無(wú)菌操作取1?2ml EPS，最后殘留于尿道外口 的1滴EPS涂于玻片上，行常規(guī)鏡檢；重新消毒尿道外口，取5ml按摩后初段尿記為VB3 ;
[0009] 步驟二、EPS標(biāo)本的處理：
[0010] 分別取VB1、VB2、VB3、EPSlml，用生理鹽水稀釋5倍，經(jīng)0. 45 μπι濾器過(guò)濾，4°C 離心40min (20, OOOXg)，棄上清，留取管底Iml充分混勾，再用無(wú)菌生理鹽水稀釋5倍，經(jīng) 0. 22 μ m濾器過(guò)濾，4°C離心40min (20,000 Xg)，棄上清，留取管底Iml充分混勻；
[0011] 步驟三、結(jié)石標(biāo)本的處理：
[0012] 手術(shù)中無(wú)菌采取患者的結(jié)石標(biāo)本，在IN HCl中浸泡30min，以去除礦物質(zhì)，加入 IM Tris進(jìn)行中和，碾碎結(jié)石，用生理鹽水配成5 %濃度，用0. 22 μ m濾膜過(guò)濾，4°C離心 40min (20000 Xg)；
[0013] 步驟四、標(biāo)本的培養(yǎng)：
[0014] 在步驟三所得述濾液中加入3?4ml含10% γ -FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，在37°C、 pH7. 4、5% 0)2和95%空氣條件下培養(yǎng)，每周觀察并記錄納米細(xì)菌的生長(zhǎng)情況；
[0015] 步驟五、間接免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察：
[0016] 步驟三所得培養(yǎng)液4°C離心30min(20,000Xg)，棄上清，留取底部0. 5ml充分混 勻，取1滴到玻片上，自然晾干，4 %多聚甲醛固定15min，水洗后在70°C烤IOmin，滴加一抗， 37°C孵育 60min，PH7. 4 的 PBS 沖洗 2minX3 次，滴加二抗，37°C 孵育 40min，PH7. 4 的 PBS 沖洗2minX 3次，80%甘油封片，置于熒光顯微鏡下觀察，用PBS替代8D10抗體作為陰性對(duì) 昭.
[0017] 步驟六、透射電鏡掃描（負(fù)染法）：
[0018] 步驟三所得培養(yǎng)液4°C (20,000 Xg)，離心30分鐘后棄上清，沉淀用2. 5 %的戊二 醛固定，細(xì)菌稀釋液滴在有膜的銅網(wǎng)上，靜置數(shù)分鐘后，用濾紙尖吸掉，用3%磷鎢酸染色 1?2min，置于PHILPS TECNAI10透射電鏡下觀察照相，工作電壓80kV ;
[0019] 步驟七、超薄切片觀察：
[0020] 步驟三所得培養(yǎng)液4°C (20,000Xg)，離心30分鐘后棄上清，沉淀用2. 5%戊二醛 固定1小時(shí)，0.1111〇1/1磷酸鈉緩沖液（?85)10分鐘，1%四氧化鋨1小時(shí)，0.1111〇1/1?8510分 鐘，梯度乙醇脫水，環(huán)氧樹脂包埋，用鉆石刀進(jìn)行超薄切片，切片置于200目有膜銅網(wǎng)上，將 銅網(wǎng)浮于10%經(jīng)培養(yǎng)證實(shí)不含納米細(xì)菌γ -FBS滴上，雙蒸水洗3分鐘X 3次，5%醋酸鈾染 色5分鐘，雙蒸水洗3分鐘X 3次，構(gòu)椽酸鉛染色5分鐘，雙蒸水充分洗滌，干燥后在PHILPS TECNAI10透射電鏡下觀察照相，工作電壓80kV ;
[0021] 步驟八、掃描電鏡觀察：
[0022] 步驟三所得培養(yǎng)液4°C (20, 000 X g)，離心30分鐘后棄上清，沉淀物PBS洗2遍， 每次3分鐘，沉淀物入六孔培養(yǎng)板，將無(wú)菌蓋玻片置入培養(yǎng)72小時(shí)，PBS洗2遍，每次3分 鐘，2. 5 %戊二醛固定1小時(shí)，梯度乙醇脫水，冷凍干燥，金屬鍍膜，置于KYKY-EM3200掃描電 鏡下觀察，工作電壓30kV ;
[0023] 步驟九、Dahl McGec-Russel氏茜素紅染色：
[0024] 取培養(yǎng)標(biāo)本涂片固定，蒸餾水沖洗3遍，每遍2min ;2%茜素紅2S染液染2?5min， 蒸餾水速洗；0. 2%淡綠水溶液復(fù)染20?30s，0. 5%醋酸水溶液速洗；95%乙醇和100%乙 醇脫水，烘干后用二甲苯透明中性樹膠封固，油鏡觀察；
[0025] 步驟十、結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：
[0026] 通過(guò)電鏡觀察可見納米細(xì)菌呈球狀或球桿狀，大小約100?500nm，菌體周圍有一 層黑色的物質(zhì)包繞；單克隆抗體間接免疫熒光染色可見陽(yáng)性標(biāo)本在高倍視野中呈綠色的桿 狀或球狀顆粒分布，鈣染色納米細(xì)菌絕大多數(shù)聚集成簇，呈革蘭陰性。
[0027] 進(jìn)一步，步驟三所述的標(biāo)本的培養(yǎng)，分別用不加標(biāo)本的RPMI 1640、不加標(biāo)本的含 10% γ-FBS的RPMI 1640、生理鹽水加 RPMI 1640進(jìn)行陰性對(duì)照培養(yǎng)。
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的納米細(xì)菌的培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)鑒定方法流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0030] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。
[0031] 本發(fā)明實(shí)施例的對(duì)象選擇：
[0032] 1.選擇2008年9月-2009年1月在第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院門診就診的III型前列 腺炎患者，根據(jù)病史、前列腺按摩前后尿液常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)、EPS常規(guī)鏡檢的結(jié)果篩選出55例 作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象（參照美國(guó)NIH1998年前列腺炎分類標(biāo)準(zhǔn)）。年齡26?48歲，平均36歲。 病程6?48個(gè)月。健康成年男性40例作為正常對(duì)照。年齡21?43歲，平均年齡30歲。 無(wú)前列腺炎或尿路感染史，前列腺按摩前后尿液細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)均為陰性，EPS中WBC < 10個(gè)/ HP，卵磷脂小體彡+++/HP。
[0033] 2.選擇2008年9月?2009年1月在第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院泌尿外科住院的前列 腺增生伴前列腺結(jié)石患者，根據(jù)病史、X線、B超檢查結(jié)果篩選出30例，年齡40?62歲，平 均51歲。手術(shù)中無(wú)菌采集前列腺結(jié)石患者的結(jié)石標(biāo)本。
[0034] 如圖1所示，一種納米細(xì)菌的培養(yǎng)與形態(tài)學(xué)鑒定方法包括：
[0035] SlOl :無(wú)菌操作取初段尿記為VB1、中段尿記為VB2、EPS、按摩后初段尿記為VB3 ;
[0036] S102 :EPS標(biāo)本的處理；
[0037] S103 :結(jié)石標(biāo)本的處理；
[0038] S104 :標(biāo)本的培養(yǎng)；
[0039] S105 :間接免疫熒光染色，熒光顯微鏡觀察；
[0040] S106 :透射電鏡掃描；
[0041] S107:超薄切片觀察；
[0042] S108:掃描電鏡觀察；
[0043] S109 :Dahl McGec-Russel 氏茜素紅染色；
[0044] S110:結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。
[0045] 具體步驟如下：
[0046] 步驟一、EPS標(biāo)本的采集：
[0047] 用新潔爾滅消毒尿道外口，無(wú)菌操作取5ml初段尿記為VBl ;排出約50?IOOml尿 液后再取5ml中段尿記為VB2 ;行經(jīng)直腸前列腺按摩，無(wú)菌操作取1?2ml EPS，最后殘留于 尿道外口的1滴EPS涂于玻片上，行常規(guī)鏡檢；重新用新潔爾滅消毒尿道外口，取5ml按摩 后初段尿記為VB3 ;
[0048] 步驟二、EPS標(biāo)本的處理：
[0049] 分別取VB1、VB2、VB3、EPSlml，用生