專利名稱：一種氧化納米細菌纖維素的制備方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料及醫(yī)療器械相關(guān)領域，特別涉及同一氧化體系兩種制備氧化細菌纖維素的方法及用途。
背景技術(shù)：
細菌纖維素(BC)，又稱微生物纖維素，是ー種天然的生物高聚物，由3 -D-葡萄糖通過￠-1,4-糖苷鍵連接而成的一種無分支的大分子直鏈聚合物。BC具有生物活性、生物可降解性、生物適應性，具有高結(jié)晶度、高純度、高持水性、超細納米纖維網(wǎng)絡、高透氣性、高透水性、高濕強度、高抗張強度和彈性模量等許多獨特的物理、化學和機械性能。細菌纖維素這些的優(yōu)異性能，使得它在生物醫(yī)用材料領域有著非常廣泛的應用前景。自1987年以來有近10個皮膚傷病醫(yī)療單位已報道400多例應用BC膜治療燒傷、燙傷、褥瘡、皮膚移植、創(chuàng)傷和慢性皮膚潰瘍等取得成功的實例，現(xiàn)已有用其制成的人工皮膚、紗布、繃帶和“創(chuàng)可貼” 等傷科敷料商品。2006年有人研究了細菌纖維素作為潛在的組織工程血管支架的機械性能，結(jié)果表明細菌纖維的應變能力與動脈血管相似，平滑肌細胞早細菌纖維素上的吸附、增殖、向內(nèi)生長的情況良好，培養(yǎng)兩個星期后可向內(nèi)生長40 u m。在生物支架材料方面，細菌纖維素有著與骨頭纖維在形態(tài)學上一致的結(jié)構(gòu)和組成，研究證明BC可作為ー種合適的基質(zhì)用于生物陶瓷沉積和晶核的形成，該材料還可以作為骨頭再生的治療性植入物用于治療骨頭損傷。但是，人體內(nèi)沒有細菌纖維素酶，使得細菌纖維素作為支架材料在體內(nèi)的降解受到了阻礙，從而限制了其在體內(nèi)的應用。而氧化是改變其體內(nèi)降解性能的簡單有效的方法之一。細菌纖維素C6位的氧化體系目前有N02/N204氧化體系、硝酸鹽類氧化體系、以 85%磷酸為溶劑的均相氧化體系、TEMPO共氧化劑體系等。其中次氯酸鹽，亞硝酸鈉、硝酸鈉的磷酸溶液兩個氧化體系屬于非完全選擇性氧化，氧化C6羥基的同時還會造成C2、C3 位羥基的氧化，且氧化產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要經(jīng)過還原處理才能穩(wěn)定存在，因此應用的較少；氯酸鈉、溴酸鈉、亞氯酸鈉氧化體系選擇氧化能力雖高，但會造成C2、C3位環(huán)的裂解以及大分子得解聚，該氧化體系也不是理想的選擇。目前，細菌纖維素的氧化體系研究主要集中 TEMPO-NaClO-NaBr氧化體系。但是此體系的氧化劑價格昂貴，存在毒性，不易徹底清除，且隨著氧化劑濃度的増大，氧化同時伴隨的降解也越來越劇烈。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有氧化方法中存在的副反應較強(降解嚴重)、氧化劑的選擇氧化性不高、氧化劑不易去除的等問題。本發(fā)明的目的通過以下方式實現(xiàn)氧化細菌纖維素的制備，方法及步驟如下
步驟一、納米細菌纖維素膜的預處理取納米細菌纖維素膜用清水多次沖洗，除去納米
細菌纖維素膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)；再將納米細菌纖維素膜浸泡于0. lmol/L的NaOH溶液， 80-100°C下煮沸90min，洗出納米細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基；再將納米細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，80-100°C下煮沸60min，然后用蒸餾水多次沖洗； 步驟ニ、納米細菌纖維素膜的純化將上述預處理的納米細菌纖維素膜通過紫外線消毒，達到エ藝滅菌要求，且之后的エ藝要求無菌操作；將上述消毒之后的納米細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡3-5次，用pH試紙輕壓膜測pH值，最終控制納米細菌纖維素膜PH值為7. 2， 得到純化后的納米細菌纖維素膜。將預處理及純化后的納米細菌纖維素膜剪切成直徑為 10-30mm的圓片，或不同規(guī)格的方形膜片待氧化；
步驟三、納米細菌纖維素膜的氧化采用氣態(tài)氧化法或溶液氧化法，利用銅粉與濃硝酸反應產(chǎn)生的N02/N204氣體氧化剪切好的納米細菌纖維素膜。氧化時間為I小時-15天，氧化后用去離子水反復清洗，得到氧化納米細菌纖維素。步驟三中的氧化方法具體步驟如下
I)氣態(tài)氧化法將剪切好的納米細菌纖維素膜置于潔凈的廣ロ瓶中，銅粉置于氣體發(fā)生裝置中的錐形瓶內(nèi)，向漏斗中倒入適量濃硝酸，緩慢打開閥門使銅粉與濃硝酸發(fā)生反應， 控制閥門開ロ大小使反應產(chǎn)生的no2/n2o4氣體均勻并由導管通入到該廣ロ瓶中，另ー導管導出的廢氣由氫氧化鈉溶液吸收。當瓶內(nèi)顔色變?yōu)樽睾稚珪r用塞子密封廣ロ瓶，于干燥陰涼處靜置氧化。2)溶液氧化法配置10%_60%不同濃度的硝酸溶液，將剪切好的納米細菌纖維素膜和上述一定濃度的硝酸溶液同時置于潔凈的廣ロ瓶中，銅粉置于氣體發(fā)生裝置中的錐形瓶內(nèi)，向漏斗中倒入適量濃硝酸，緩慢打開閥門使銅粉與濃硝酸發(fā)生反應，控制閥門開ロ大小使反應產(chǎn)生的no2/n2o4氣體均勻并由導管通入到該廣ロ瓶中，另ー導管導出的廢氣由氫氧化鈉溶液吸收。no2/n2o4氣體的供應保持持續(xù)、均勻，根據(jù)需要添加銅粉和濃硝酸。由上述的制備氧化納米細菌纖維素的方法制備出的C6位羧基氧化納米細菌纖維素產(chǎn)物均一，伴隨的副反應小，氧化率達5%-60%，在PBS溶液中的降解性能得到明顯改善。 根據(jù)上述制備氧化納米細菌纖維素的方法制備出的氧化納米細菌纖維素氧化率和降解率可控，透水透氣性能良好，且獲得了微觀上較大的纖維束直徑和孔隙，便于營養(yǎng)物質(zhì)的運輸及細胞的長入，并保持著原有的力學性能和生物相容性，擴大了其作為植入材料的應用領域及前景。此外，由上述的制備氧化細菌纖維素的方法制備出的氧化納米細菌纖維素具有良好的止血性能，表明其作為止血材料具有潛在的可能。圖I為氧化過程反應式；圖2為納米細菌纖維素的紅外光譜圖，顯示了其典型的吸收峰；圖3為在氣體環(huán)境中氧化12天的氧化納米細菌纖維素紅外光譜圖，在1735CHT1處可見與C=O相應的收縮振動峰處存在，證明納米細菌纖維素已被氧化；圖4為40%硝酸溶液環(huán)境中氧化IOh的微觀形貌及紅外光譜圖，結(jié)果與圖3 —致。所述納米細菌纖維素膜是由醋桿菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、無色桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、氣桿菌屬、固氮菌屬、土壌桿菌屬等九屬細菌中的某幾種經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生，所產(chǎn)納米細菌纖維素具有三維多孔網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。本發(fā)明涉及氧化細菌纖維素的制備原理是N02/N204氧化體系能將纖維素C6位上的羥基選擇氧化成羧基，以此氧化細菌纖維素，能得到C6位的羧基氧化細菌纖維素，且在硝酸溶液中實施氧化，氧化速度更快，氧化率更高，同時不影響其力學性能和生物相容性。本發(fā)明采用no2/n2o4作為氧化劑，分別在氣體環(huán)境和液體環(huán)境(硝酸溶液)中對納米細菌纖維素進行氧化，并對比氣體和液體環(huán)境中的氧化效果，以期得到降解性能更好的羧酸納米細菌纖維素。本發(fā)明提出細菌纖維素同一氧化體系兩種不同的環(huán)境的氧化方法， 在不同環(huán)境下由此氧化劑氧化的到的氧化細菌纖維素保持了原始細菌纖維素的三維納米網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)和足夠的機械強度，在PBS溶液中有著良好的降解性能，同時還具有較好的止血性能，在擴大了其作為植入材料在體內(nèi)的應用的同時，還可作為止血敷料在創(chuàng)面愈合過程起到促進作用。與以往的細菌纖維素氧化方法相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果
I、本發(fā)明所獲得氧化納米細菌纖維素膜，有優(yōu)異的生物相容性和細胞親和性，分別對細胞的増殖、分化及吞噬功能有促進作用，可作為植入材料在體內(nèi)得到應用，同時具有止血功能，可促進創(chuàng)面止血及愈合，可作為止血敷料在體表得到應用。2、本發(fā)明利用納米細菌纖維素具有的獨特結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，制備出氧化納米細菌纖維素膜，使納米細菌纖維素獲得了優(yōu)異的降解性能，并且氧化速率高、氧化產(chǎn)物均一，氧化率、 降解性可控；
3、本發(fā)明采用獨特的方法氧化納米細菌纖維素，克服了現(xiàn)有氧化方法中存在的副反應較強(降解嚴重)、氧化劑的選擇氧化性不高、氧化劑不易去除的等問題。4、本發(fā)明的制備過程簡單，エ藝成熟，適合于氧化納米細菌纖維素的エ業(yè)生產(chǎn)。


圖I氧化過程反應式；
圖2為納米細菌纖維紅外光譜圖，顯示了其典型的化學結(jié)構(gòu)及相應的吸收峰；
圖3為在氣體環(huán)境中氧化12天的氧化納米細菌纖維素紅外光譜圖，在1735cm-l處可見羧基收縮振動峰的存在，證明納米細菌纖維素已被氧化；
圖4為40%硝酸溶液環(huán)境中氧化IOh的紅外光譜圖，結(jié)果與圖3 —致。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖，通過具體實例對本發(fā)明的一種氣體環(huán)境下氧化細菌纖維素和液體環(huán)境下氧化細菌纖維素制備方法做進ー步說明。實施例一
步驟I、納米細菌纖維素膜的預處理。取納米細菌纖維素用清水多次沖洗，除去納米細菌纖維素膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)； 再將納米細菌纖維素膜浸泡于0. lmol/L的NaOH溶液，85°C下煮沸90min，洗出納米細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基；再將納米細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液， 85°C下煮沸60min，然后用蒸餾水多次沖洗；
步驟2、納米細菌纖維素膜的純化。將上述預處理的納米細菌纖維素膜通過紫外線消毒，達到エ藝滅菌要求，且之后的エ藝要求無菌操作；將上述消毒之后的納米細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡3-5次，用pH試紙輕壓膜測PH值，最終控制納米細菌纖維素膜PH值為7. 2，得到純化后的納米細菌纖維素膜。用自制鉆頭將預處理及純化后的納米細菌纖維素膜剪切成直徑為15_的圓片待氧化;
步驟3、納米細菌纖維素膜的氧化。將剪切好的納米細菌纖維素膜置于潔凈的廣ロ瓶中，銅粉置于氣體發(fā)生裝置中的錐形瓶內(nèi)，向漏斗中倒入適量濃硝酸，緩慢打開閥門使銅粉與濃硝酸發(fā)生反應，控制閥門開 ロ大小使反應產(chǎn)生的no2/n2o4氣體均勻并由導管通入到該廣ロ瓶中，另ー導管導出的廢氣由氫氧化鈉溶液吸收。當瓶內(nèi)顔色變?yōu)樽睾稚珪r用塞子密封廣ロ瓶，于干燥陰涼處靜置氧化6天后取出，用去離子水反復清洗，得到氧化納米細菌纖維素。所述氧化納米細菌纖維素的制備方法所使用的蒸餾水為雙重蒸餾。實施例ニ
步驟I、納米細菌纖維素膜的預處理。取納米細菌纖維素用清水多次沖洗，除去納米細菌纖維素膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)； 再將納米細菌纖維素膜浸泡于0. lmol/L的NaOH溶液，90°C下煮沸90min，洗出納米細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基；再將納米細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液， 90°C下煮沸60min，然后用蒸餾水多次沖洗；
步驟2、納米細菌纖維素膜的純化。將上述預處理的納米細菌纖維素膜通過紫外線消毒，達到エ藝滅菌要求，且之后的エ藝要求無菌操作；將上述消毒之后的納米細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡3-5次，用pH試紙輕壓膜測PH值，最終控制納米細菌纖維素膜PH值為7. 2，得到純化后的納米細菌纖維素膜。用自制鉆頭將預處理及純化后的納米細菌纖維素膜剪切成直徑為25mm的圓片待氧化;
步驟3、納米細菌纖維素膜的氧化。配置20%的硝酸溶液，將剪切好的納米細菌纖維素膜和上硝酸溶液同時置于潔凈的廣ロ瓶中，銅粉置于氣體發(fā)生裝置中的錐形瓶內(nèi)，向漏斗中倒入適量濃硝酸，緩慢打開閥門使銅粉與濃硝酸發(fā)生反應，控制閥門開ロ大小使反應產(chǎn)生的no2/n2o4氣體均勻并由導管通入到該廣ロ瓶中，另ー導管導出的廢氣由氫氧化鈉溶液吸收。no2/n2o4氣體的供應保持持續(xù)、均勻，根據(jù)需要添加銅粉和濃硝酸。氧化15小時后取出樣品，用去離子水反復清洗，得到氧化納米細菌纖維素。所述氧化納米細菌纖維素的制備方法所使用的蒸餾水為雙重蒸餾。實施例三
步驟I、納米細菌纖維素膜的預處理。取納米細菌纖維素膜用清水多次沖洗，除去納米細菌纖維素膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)；再將納米細菌纖維素膜浸泡于0. lmol/L的NaOH溶液，95°C下煮沸90min，洗出納米細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基；再將納米細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，95°C下煮沸60min，然后用蒸餾水多次沖洗；
步驟2、納米細菌纖維素膜的純化。將上述預處理的納米細菌纖維素膜通過紫外線消毒，達到エ藝滅菌要求，且之后的エ藝要求無菌操作；將上述消毒之后的納米細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡3-5次，用pH試紙輕壓膜測PH值，最終控制納米細菌纖維素膜PH值為7. 2，得到純化后的納米細菌纖維素膜。將預處理及純化后的納米細菌纖維素膜剪切成規(guī)格為20X40mm的方膜片待氧化；
步驟3、納米細菌纖維素膜的氧化。將剪切好的納米細菌纖維素膜置于潔凈的廣ロ瓶中，銅粉置于氣體發(fā)生裝置中的錐形瓶內(nèi)，向漏斗中倒入適量濃硝酸，緩慢打開閥門使銅粉與濃硝酸發(fā)生反應，控制閥門開 ロ大小使反應產(chǎn)生的no2/n2o4氣體均勻并由導管通入到該廣ロ瓶中，另ー導管導出的廢氣由氫氧化鈉溶液吸收。當瓶內(nèi)顔色變?yōu)樽睾稚珪r用塞子密封廣ロ瓶，于干燥陰涼處靜置氧化12天后取出，用去離子水反復清洗，得到氧化納米細菌纖維素。所述氧化納米細菌纖維素的制備方法所使用的蒸餾水為雙重蒸餾。實施例四
步驟I、納米細菌纖維素膜的預處理。取納米細菌纖維素膜用清水多次沖洗，除去納米細菌纖維素膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)；再將納米細菌纖維素膜浸泡于0. lmol/L的NaOH溶液，100°C下煮沸90min，洗出納米細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基；再將納米細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，100°C下煮沸60min，然后用蒸餾水多次沖洗；
步驟2、納米細菌纖維素膜的純化。將上述預處理的納米細菌纖維素膜通過紫外線消毒，達到エ藝滅菌要求，且之后的エ藝要求無菌操作；將上述消毒之后的納米細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡3-5次，用pH試紙輕壓膜測PH值，最終控制納米細菌纖維素膜PH值為7. 2，得到純化后的納米細菌纖維素膜。將預處理及純化后的納米細菌纖維素膜剪切成規(guī)格為30X50 mm的方膜片待氧化；
步驟3、納米細菌纖維素膜的氧化。配置40%的硝酸溶液，將剪切好的納米細菌纖維素膜和上述硝酸溶液同時置于潔凈的廣ロ瓶中，銅粉置于氣體發(fā)生裝置中的錐形瓶內(nèi)，向漏斗中倒入適量濃硝酸，緩慢打開閥門使銅粉與濃硝酸發(fā)生反應，控制閥門開ロ大小使反應產(chǎn)生的no2/n2o4氣體均勻并由導管通入到該廣ロ瓶中，另ー導管導出的廢氣由氫氧化鈉溶液吸收。N02/N204氣體的供應保持持續(xù)、均勻，根據(jù)需要添加銅粉和濃硝酸。氧化10小時后取出樣品，用去離子水反復清洗， 得到氧化納米細菌纖維素。所述氧化納米細菌纖維素的制備方法所使用的蒸餾水為雙重蒸餾。以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例， 不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進等， 均應仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種氧化納米細菌纖維素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一、納米細菌纖維素膜的預處理取納米細菌纖維素膜用清水多次沖洗，除去納米細菌纖維素膜表面培養(yǎng)基及雜質(zhì)；再將納米細菌纖維素膜浸泡于0. lmol/L的NaOH溶液中， 80-100°C下煮沸90min，洗出納米細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基；再將納米細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液中，80_100°C下煮沸60min，然后用蒸餾水多次沖洗；步驟ニ、納米細菌纖維素膜的純化將上述預處理的納米細菌纖維素膜通過紫外線消毒，達到エ藝滅菌要求，且之后的エ藝要求無菌操作；將上述消毒之后的納米細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡3-5次，用pH試紙輕壓膜測pH值，最終控制納米細菌纖維素膜PH值為7. 2， 得到純化后的納米細菌纖維素膜；納米細菌纖維素膜的剪切將預處理及純化后的納米細菌纖維素膜剪切成直徑為10_30mm的圓片，或不同規(guī)格的方形膜片待氧化；步驟三、納米細菌纖維素膜的氧化采用氣態(tài)氧化法或溶液氧化法，利用銅粉與濃硝酸反應產(chǎn)生的N02/N204氣體氧化剪切好的納米細菌纖維素膜；氧化時間為I小時-15天，氧化后用去離子水反復清洗，得到氧化納米細菌纖維素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化納米細菌纖維素的制備方法，其特征在于步驟三中氣態(tài)氧化法氧化納米細菌纖維素膜的方法具體步驟為將剪切好的納米細菌纖維素膜置于潔凈的廣ロ瓶中，銅粉置于氣體發(fā)生裝置中的錐形瓶內(nèi)，向漏斗中倒入適量濃硝酸，緩慢打開閥門使銅粉與濃硝酸發(fā)生反應，控制閥門開ロ大小使反應產(chǎn)生的N02/N204氣體均勻并由導管通入到該廣ロ瓶中，另ー導管導出的廢氣由氫氧化鈉溶液吸收；當瓶內(nèi)顔色變?yōu)樽睾稚珪r用塞子密封廣ロ瓶，于干燥陰涼處靜置氧化。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化納米細菌纖維素的制備方法，其特征在于步驟三中溶液氧化法氧化納米細菌纖維素膜的方法具體步驟為配置10%-60%不同濃度的硝酸溶液，將剪切好的納米細菌纖維素膜和上述一定濃度的硝酸溶液同時置于潔凈的廣ロ瓶中，銅粉置于氣體發(fā)生裝置中的錐形瓶內(nèi)，向漏斗中倒入適量濃硝酸，緩慢打開閥門使銅粉與濃硝酸發(fā)生反應，控制閥門開ロ大小使反應產(chǎn)生的N02/N204氣體均勻并由導管通入到該廣ロ瓶中，另ー導管導出的廢氣由氫氧化鈉溶液吸收；no2/n2o4氣體的供應保持持續(xù)、均勻，根據(jù)需要添加銅粉和濃硝酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化納米細菌纖維素的制備方法，其特征在于所述蒸餾水為雙重蒸懼。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化納米細菌纖維素的制備方法，其特征在于所述納米細菌纖維素膜是由醋桿菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、無色桿菌屬、產(chǎn)堿菌屬、氣桿菌屬、固氮菌屬、土壌桿菌屬九屬細菌中的某幾種經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生，所產(chǎn)納米細菌纖維素具有三維多孔網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的氧化納米細菌纖維素的制備方法其特征在于氣態(tài)環(huán)境中的氧化保證的no2/n2o4供應充足，溶液環(huán)境中的氧化保證no2/n2o4的供應均勻、持續(xù)。
全文摘要
一種氧化納米細菌纖維素的制備方法，屬于生物醫(yī)用材料及醫(yī)療器械相關(guān)領域。本發(fā)明方法包括以下步驟取納米細菌纖維素膜進行預處理和純化處理得到純化后的納米細菌纖維素，剪切成不同規(guī)格的圓片或方片。將剪切好的納米細菌纖維素置于潔凈的或盛有特定濃度硝酸溶液的廣口瓶內(nèi)，將銅粉與濃硝酸反應產(chǎn)生的NO2/N2O4氣體通入到廣口瓶中氧化納米細菌纖維素。氧化特定時間后取出樣品用去離子水反復清洗，得到C6位為羧基的氧化納米細菌纖維素。由此制備出的氧化納米細菌纖維素具有優(yōu)良降解性能、生物相容性、細胞親和性及良好的止血性能和力學性能、優(yōu)異的透水、透氣和引流、吸濕效果，在作為植入材料和創(chuàng)傷止血材料方面均有較高的應用價值。
文檔編號C08L1/02GK102604142SQ20121008850
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月29日
發(fā)明者吳健, 崔秋艷, 彭帥, 欒家斌, 鄭裕東 申請人:北京科技大學