專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與計(jì)數(shù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與計(jì)數(shù)方 法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
熒光顯微鏡觀察與計(jì)數(shù)是細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable but Non-culturable， VBNC)研究所用的最基本的技術(shù)手段。目前，國(guó)內(nèi)外用 于VBNC細(xì)菌熒光觀察與計(jì)數(shù)的現(xiàn)有技術(shù)主要源自于Hobbie等人于1977 年在《應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)》上發(fā)表的一篇題為"利用核孔濾膜進(jìn)行細(xì) 菌熒光計(jì)數(shù)"的文章。該技術(shù)的一大亮點(diǎn)就是利用聚碳酸酯核孔濾膜替 代纖維素微孔濾膜，用于細(xì)菌總菌數(shù)的測(cè)定。同時(shí)還利用吖啶橙和萘啶 酮酸對(duì)細(xì)菌核染，用以區(qū)分細(xì)菌的"死"與"活"。除此之外，該項(xiàng)技術(shù) 所涉及的材料還包括伊拉克黑、甲醛、可換膜針頭式濾器等。其具體技 術(shù)措施如下。首先，在適當(dāng)濃度的稀釋液中加入終濃度為0.001%的萘啶 酮酸和0.025%酵母膏，37'C培養(yǎng)16h — 24h，隨后加入2%甲醛固定(終濃 度)，而后再加入O. ly。的吖啶橙溶液染色3min。將稀釋液中的細(xì)菌過(guò)濾 到直徑25mm孔徑0.2um的核孔濾膜上。為消除濾膜本身的熒光，濾膜先 用0. 2%伊拉克黑的2%醋酸溶液染色24h。最后將濾膜放在載玻片上滴一 滴無(wú)自發(fā)熒光的香柏油，在油上蓋一張蓋玻片，在蓋玻片上再滴加一滴 無(wú)自發(fā)熒光的香柏油，于落射熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。通過(guò)上述方
法，細(xì)菌總數(shù)能被客觀地計(jì)數(shù)出來(lái)，并且活菌與死菌也能被明顯地區(qū)分
開(kāi)來(lái)。因此，該技術(shù)在VBNC細(xì)菌研究領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用。但是隨著VBNC 研究范圍的不斷擴(kuò)大，具有VBNC性質(zhì)的細(xì)菌種類(lèi)也越來(lái)越多，已不局限 于當(dāng)初發(fā)現(xiàn)的16個(gè)種屬的30多種細(xì)菌。不但革蘭氏陰性病原菌存在VBNC 狀態(tài)，革蘭氏陽(yáng)性益生菌也存在；不但水中細(xì)菌存在，土壤、空氣、動(dòng) 植物體內(nèi)細(xì)菌也存在。那么此項(xiàng)技術(shù)在該領(lǐng)域研究中也顯現(xiàn)出了儲(chǔ)多不 利方面，存在著一定的局限性。歸納其技術(shù)缺點(diǎn)如下(l)操作繁瑣，耗 費(fèi)時(shí)間，不利于VBNC細(xì)菌的快速檢測(cè)。 一般地，在觀察VBNC細(xì)菌時(shí)， 需用萘啶酮酸抑制細(xì)菌生長(zhǎng)16h — 24h。 (2)適用范圍窄，僅對(duì)革蘭氏陰 性菌適用，而對(duì)革蘭氏陽(yáng)性則不適用。(3)不能真實(shí)反映活菌數(shù)量。經(jīng)吖 啶橙染色，呈現(xiàn)橙黃或橙紅色熒光的菌體難于有效確定是活菌還是死菌。 (4)所用材料種類(lèi)多，且取材不便。例如，伊拉克黑是在印染工業(yè)中所使 用的一種黑色染料，但在國(guó)內(nèi)各大生化及生物公司卻很少銷(xiāo)售此類(lèi)物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察
與計(jì)數(shù)方法，其以SYT0-9和PI替代吖啶橙和萘啶酮酸，以市售的黑色 鋼筆墨水替代伊拉克黑，自行建立了一套VBNC細(xì)菌熒光顯微鏡觀察與計(jì) 數(shù)方法，簡(jiǎn)化了操作流程，克服了現(xiàn)有技術(shù)的適用范圍狹窄、取材困難、 觀察結(jié)果不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)，解決了細(xì)菌VBNC研究領(lǐng)域中的技術(shù)難題，提高 同業(yè)者的實(shí)踐操作水平。
本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微 鏡觀察與計(jì)數(shù)方法，其特征在于具體步驟是1、 VBNC細(xì)菌觀察樣本的前處理 VBNC細(xì)菌誘導(dǎo)前的菌液濃度為10s — 106個(gè)/mL，取可培養(yǎng)菌數(shù)為1 X
10，/mL的VBNC細(xì)菌液lmL至無(wú)菌離心管中，8000 r/min離心2min， 棄上清；然后用滅菌生理鹽水充分洗滌菌體沉淀2次，每次均8000 r/min， 離心2min，棄上清；洗滌菌體時(shí)，應(yīng)盡可能地除盡細(xì)菌培養(yǎng)液，以免培 養(yǎng)液產(chǎn)生自發(fā)光而干擾觀察結(jié)果；最后需將洗滌完畢的沉淀置于室溫， 用于立即觀察；或者將菌體保存于4t;，在2天內(nèi)備用；
2、 微孔濾膜疏水性檢查與處理
首先將直徑25mm孔徑0. 2um的微孔濾膜完全浸入滅菌生理鹽水中2 rnin，再將微孔濾膜取出置于平皿中，光面朝上，仔細(xì)觀察微孔濾膜表面， 若微孔濾膜表面有部分面積沒(méi)有水痕，則表示此濾膜疏水，應(yīng)重新更換； 或者將疏水濾膜浸入0.5%的吐溫-80中，浸泡lmin，而后將微孔濾膜 轉(zhuǎn)入可換膜針頭式濾器內(nèi)，在針管內(nèi)注入滅菌生理鹽水2mL， 一并將吐 溫-80和鹽水濾出；驗(yàn)證后的和吐溫-80處理后的濾膜均光面朝上平鋪于 平皿內(nèi)，37'C烘干，室溫存放備用，微孔濾膜最好直接使用親水性濾膜;
3、 微孔濾膜染色
將上述處理完畢的微孔濾膜光面朝上平鋪于平皿中，膜與膜之間不 能重疊；而后用吸管吸取適量"英雄牌"黑色鋼筆墨水，在濾膜圓心處 滴一滴，要讓墨水從膜中心向四周自行浸染擴(kuò)散，待墨水已全部浸透膜 后，將平皿移至干熱箱內(nèi)，6(TC烤膜20min，其間需用鑷子輕輕夾起濾 膜翻動(dòng)2次，而后冷卻，室溫存放備用；4、 VBNC細(xì)菌樣本熒光染色
將SYTO-9和PI染料配制成工作濃度，一20'C存放備用；將步聚1 中的VBNC菌體沉淀溶于50 til滅菌生理鹽水中，貼壁加入工作濃度的 SYTO-9和PI各25u 1至離心管中，瞬間離心，吹吸混勻，室溫避光染 色15minj
5、 VBNC細(xì)菌熒光標(biāo)本的制備
將經(jīng)墨水染黑的微孔濾膜置于無(wú)自發(fā)熒光的載玻片中心處，吸取 10y 1染色完畢的VBNC菌液，滴在微孔濾膜圓心上，待菌液剛好被濾膜 吸干時(shí)，在其上蓋上蓋玻片，并用手用力壓片，除盡空氣夾層；最后在 蓋玻片上滴一滴無(wú)自發(fā)熒光的油，用OLYMPUS BX-51落射熒光顯微鏡于 暗室中觀察并計(jì)數(shù)；熒光顯微鏡的激發(fā)光波長(zhǎng)480nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為 610nm;待檢標(biāo)片可置于溫盒內(nèi)，在4'C低溫存放ld;
6、 VBNC細(xì)菌熒光顯微鏡計(jì)數(shù)
計(jì)數(shù)時(shí)至少隨機(jī)選擇10個(gè)不同視野，而每個(gè)視野中的細(xì)菌數(shù)不低于 30 — 50個(gè)，而后取平均值；觀察計(jì)數(shù)時(shí)，每個(gè)視野在lmin之內(nèi)完成； 當(dāng)看到呈現(xiàn)綠色熒光的即為活菌，而呈現(xiàn)紅色熒光的即為死菌；VBNC細(xì) 菌數(shù)的具體計(jì)數(shù)可參考以下公式
其中E為樣品中細(xì)菌總數(shù)(個(gè)/mL); X為各計(jì)數(shù)視野細(xì)菌總數(shù)的平均 值(個(gè))；S,為濾膜面積(鵬)；S2為顯微鏡油鏡的視野面積(mm); V為待 檢VBNC細(xì)菌液的體積(mL)。
本發(fā)明的積極效果是選用的SYT0-9和PI兩種核酸熒光染料是VBNC
細(xì)菌熒光觀察的關(guān)鍵材料，其中，SYT0-9是一種能滲入具有完整細(xì)胞膜 細(xì)胞內(nèi)的小分子，呈綠色熒光，PI則是一種僅能滲到細(xì)胞膜破損的菌體 內(nèi)且呈紅色熒光的大分子，并且與SYT0-9競(jìng)爭(zhēng)核酸著染位點(diǎn)；經(jīng)此試劑 染色后，發(fā)出綠色熒光的即為活菌，而發(fā)出紅色熒光的為死菌。這兩種 染料還對(duì)革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性菌都適用，都利于活細(xì)胞與死細(xì)胞的 區(qū)分；因而，SYT0-9和PI不但能縮短VBNC細(xì)胞觀察期，而且還應(yīng)用廣
泛。采用黑色鋼筆墨水不僅取材方便而且便宜；采用由上海英雄金筆廠 有限公司生產(chǎn)的英雄牌黑色鋼筆墨水不但不產(chǎn)生自發(fā)光，而且還能去除 濾膜的光亮；不但能加深視野背景深度，而且還能加強(qiáng)膜對(duì)玻片的吸附 力，因而該牌墨水對(duì)VBNC細(xì)菌的熒光觀察效果最好。采用物理固定方式， 即利用濕潤(rùn)的濾膜對(duì)載玻片和蓋玻片的吸附作用以及手動(dòng)壓力作用，這 種固定方式并不影響細(xì)菌的存活狀態(tài)，因而在測(cè)定總菌數(shù)的同時(shí)，也能 一并將活菌數(shù)測(cè)定出來(lái)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
1、 首先對(duì)VBNC細(xì)菌觀察樣本進(jìn)行前處理，VBNC細(xì)菌誘導(dǎo)前的菌液 濃度為106個(gè)/mL，取可培養(yǎng)菌數(shù)1Xl(f個(gè)/mL的VBNC細(xì)菌液lmL至無(wú) 菌離心管中，以8000 r/min離心處理2min，棄上清；然后用滅菌生理 鹽水充分洗滌菌體并沉淀2次，每次均8000 r/min，離心2min，棄上清； 洗滌菌體時(shí)，應(yīng)除盡細(xì)菌培養(yǎng)液，以免培養(yǎng)液產(chǎn)生自發(fā)光而干擾觀察結(jié) 果；最后需將洗滌完畢的沉淀置于室溫，用于立即觀察；
2、 接下來(lái)進(jìn)行微孔濾膜疏水性檢査與處理，首先將直徑25mm孔徑0. 2um的微孔濾膜完全浸入滅菌生理鹽水中2 min，再將微孔濾膜取出置 于平皿中，光面朝上，仔細(xì)觀察微孔濾膜表面，若微孔濾膜表面有部分 面積沒(méi)有水痕，則表示此濾膜疏水，應(yīng)重新更換；或者將疏水濾膜浸入 0.5%的吐溫_80中，浸泡1 min，而后將微孔濾膜轉(zhuǎn)入可換膜針頭式濾 器內(nèi)，在針管內(nèi)注入滅菌生理鹽水2mL， 一并將吐溫-80和鹽水濾出；驗(yàn) 證后的和吐溫-80處理后的濾膜均光面朝上平鋪于平皿內(nèi)，37'C烘干， 室溫存放備用，微孔濾膜最好直接使用親水性濾膜；
3、 將處理完畢的微孔濾膜光面朝上平鋪于平皿中，膜與膜之間不能 重疊；而后用吸管吸取適量"英雄牌"黑色鋼筆墨水，在濾膜圓心處滴 一滴，要讓墨水從膜中心向四周自行浸染擴(kuò)散，待墨水已全部浸透膜后， 將平皿移至干熱箱內(nèi)，6(TC烤膜20min，其間需用鑷子輕輕夾起濾膜翻 動(dòng)2次，而后冷卻，室溫存放備用；
4、 對(duì)VBNC細(xì)菌樣本進(jìn)行熒光染色，將SYT0-9和PI染料配制成工 作濃度，并在一20'C存放備用；將步聚l中的VBNC菌體沉淀溶于50ul 滅菌生理鹽水中，貼壁加入工作濃度的SYT0-9和PI各25u 1至離心管 中，瞬間離心，吹吸混勻，室溫避光染色15min;
5、 VBNC細(xì)菌熒光標(biāo)本的制備，將經(jīng)墨水染黑的微孔濾膜置于無(wú)自 發(fā)熒光的載玻片中心處，吸取10 ul染色完畢的VBNC菌液，滴在微孔濾 膜圓心上，待菌液剛好被濾膜吸干時(shí)，在其上蓋上蓋玻片，并用手用力 壓片，除盡空氣夾層;最后在蓋玻片上滴一滴無(wú)自發(fā)熒光的油，用OLYMPUS BX-51落射熒光顯微鏡于暗室中觀察并計(jì)數(shù)；熒光顯微鏡的激發(fā)光波長(zhǎng) 480nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為610nm;待檢標(biāo)片可置于溫盒內(nèi)，在4XM氐溫存放 Id;
6、 VBNC細(xì)菌熒光顯微鏡計(jì)數(shù)，隨機(jī)選擇10個(gè)不同視野，而每個(gè)視 野中的細(xì)菌數(shù)為30個(gè)，而后取平均值；觀察計(jì)數(shù)時(shí)，每個(gè)視野在lmin 之內(nèi)完成；當(dāng)看到呈現(xiàn)綠色熒光的即為活菌，而呈現(xiàn)紅色熒光的即為死 菌；VBNC細(xì)菌數(shù)的具體計(jì)數(shù)可參考以下公式
其中E為樣品中細(xì)菌總數(shù)(個(gè)/mU ; X為各計(jì)數(shù)視野細(xì)菌總數(shù)的平均 值(個(gè))；S,為濾膜面積(mm); S2為顯微鏡油鏡的視野面積(mm); V為待 檢VBNC細(xì)菌液的體積(mL)。
實(shí)施例2:
1、 首先對(duì)VBNC細(xì)菌觀察樣本進(jìn)行前處理，VBNC細(xì)菌誘導(dǎo)前的菌液 濃度為K)5個(gè)/mL，取可培養(yǎng)菌數(shù)1X105個(gè)/mL的VBNC細(xì)菌液lmL至無(wú) 菌離心管中，以8000 r/min離心處理2min，棄上清；然后用滅菌生理 鹽水充分洗滌菌體并沉淀2次，每次均8000r/min，離心2min，棄上清； 將菌體保存于4'C，在2天內(nèi)備用；
2、 接下來(lái)進(jìn)行微孔濾膜疏水性檢查與處理，首先將直徑25mm孔徑 0. 2um的微孔濾膜完全浸入滅菌生理鹽水中2 min，再將微孔濾膜取出置 于平皿中，光面朝上，仔細(xì)觀察微孔濾膜表面，若微孔濾膜表面有部分 面積沒(méi)有水痕，則表示此濾膜疏水，應(yīng)重新更換；或者將疏水濾膜浸入 0.5%的吐溫-80中，浸泡1 min，而后將微孔濾膜轉(zhuǎn)入可換膜針頭式濾 器內(nèi)，在針管內(nèi)注入滅菌生理鹽水2mL， 一并將吐溫-80和鹽水濾出；驗(yàn) 證后的和吐溫-80處理后的濾膜均光面朝上平鋪于平皿內(nèi)，37r烘干，室溫存放備用，微孔濾膜最好直接使用親水性濾膜；
3、 將處理完畢的微孔濾膜光面朝上平鋪于平皿中，膜與膜之間不能 重疊；而后用吸管吸取適量"英雄牌"黑色鋼筆墨水，在濾膜圓心處滴 一滴，要讓墨水從膜中心向四周自行浸染擴(kuò)散，待墨水已全部浸透膜后， 將平皿移至干熱箱內(nèi)，6(TC烤膜20min，其間需用鑷子輕輕夾起濾膜翻 動(dòng)2次，而后冷卻，室溫存放備用；
4、 對(duì)VBNC細(xì)菌樣本進(jìn)行熒光染色，將SYT0-9和PI染料配制成工 作濃度，并在一20'C存放備用；將步聚1中的VBNC菌體沉淀溶于50" 1 滅菌生理鹽水中，貼壁加入工作濃度的SYT0-9和PI各25u 1至離心管 中，瞬間離心，吹吸混勻，室溫避光染色15min;
5、 VBNC細(xì)菌熒光標(biāo)本的制備，將經(jīng)墨水染黑的微孔濾膜置于無(wú)自 發(fā)熒光的載玻片中心處，吸取10ul染色完畢的VBNC菌液，滴在微孔濾 膜圓心上，待菌液剛好被濾膜吸干時(shí)，在其上蓋上蓋玻片，并用手用力 壓片，除盡空氣夾層；最后在蓋玻片上滴一滴無(wú)自發(fā)熒光的油，用OLYMPUS BX-51落射熒光顯微鏡于暗室中觀察并計(jì)數(shù)；熒光顯微鏡的激發(fā)光波長(zhǎng) 480nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為610nm;待檢標(biāo)片可置于溫盒內(nèi)，在4'C低溫存放 ld;
6、 VBNC細(xì)菌熒光顯微鏡計(jì)數(shù)，隨機(jī)選擇10個(gè)不同視野，而每個(gè)視 野中的細(xì)菌數(shù)為50個(gè)，而后取平均值；觀察計(jì)數(shù)時(shí)，每個(gè)視野在lrain 之內(nèi)完成；當(dāng)看到呈現(xiàn)綠色熒光的即為活菌，而呈現(xiàn)紅色熒光的即為死 菌；VBNC細(xì)菌數(shù)的具體計(jì)數(shù)可參考以下公式
<formula>complex formula see original document page 12</formula>
其中E為樣品中細(xì)菌總數(shù)(個(gè)/mL); X為各計(jì)數(shù)視野細(xì)菌總數(shù)的平均 值(個(gè))；S,為濾膜面積(mm); S2為顯微鏡油鏡的視野面積(mm); V為待 檢VBNC細(xì)菌液的體積(mL)。
權(quán)利要求
1、細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與計(jì)數(shù)方法，其特征在于具體步驟是(1)、VBNC細(xì)菌觀察樣本的前處理VBNC細(xì)菌誘導(dǎo)前的菌液濃度為105-106個(gè)/mL，取可培養(yǎng)菌數(shù)為1×106個(gè)/mL的VBNC細(xì)菌液1mL至無(wú)菌離心管中，8000r/min離心2min，棄上清；然后用滅菌生理鹽水充分洗滌菌體沉淀2次，每次均8000r/min，離心2min，棄上清；洗滌菌體時(shí)，應(yīng)盡可能地除盡細(xì)菌培養(yǎng)液，以免培養(yǎng)液產(chǎn)生自發(fā)光而干擾觀察結(jié)果；最后需將洗滌完畢的沉淀置于室溫，用于立即觀察；或者將菌體保存于4℃，在2天內(nèi)備用；(2)、微孔濾膜疏水性檢查與處理首先將直徑25mm孔徑0.2um的微孔濾膜完全浸入滅菌生理鹽水中2min，再將微孔濾膜取出置于平皿中，光面朝上，仔細(xì)觀察微孔濾膜表面，若微孔濾膜表面有部分面積沒(méi)有水痕，則表示此濾膜疏水，應(yīng)重新更換；或者將疏水濾膜浸入0.5％的吐溫-80中，浸泡1min，而后將微孔濾膜轉(zhuǎn)入可換膜針頭式濾器內(nèi)，在針管內(nèi)注入滅菌生理鹽水2mL，一并將吐溫-80和鹽水濾出；驗(yàn)證后的和吐溫-80處理后的濾膜均光面朝上平鋪于平皿內(nèi)，37℃烘干，室溫存放備用；(3)、微孔濾膜染色將上述處理完畢的微孔濾膜光面朝上平鋪于平皿中，膜與膜之間不能重疊；而后用吸管吸取黑色鋼筆墨水，在濾膜圓心處滴一滴，要讓墨水從膜中心向四周自行浸染擴(kuò)散，待墨水已全部浸透膜后，將平皿移至干熱箱內(nèi)，60℃烤膜20min，其間需用鑷子輕輕夾起濾膜翻動(dòng)2次，而后冷卻，室溫存放備用；(4)、VBNC細(xì)菌樣本熒光染色將SYTO-9和PI染料配制成工作濃度，-20℃存放備用；將步聚1中的VBNC菌體沉淀溶于50μ1滅菌生理鹽水中，貼壁加入工作濃度的SYTO-9和PI各25μ1至離心管中，瞬間離心，吹吸混勻，室溫避光染色15min；(5)、VBNC細(xì)菌熒光標(biāo)本的制備將經(jīng)墨水染黑的微孔濾膜置于無(wú)自發(fā)熒光的載玻片中心處，吸取10μl染色完畢的VBNC菌液，滴在微孔濾膜圓心上，待菌液剛好被濾膜吸干時(shí)，在其上蓋上蓋玻片，并用手用力壓片，除盡空氣夾層；最后在蓋玻片上滴一滴無(wú)自發(fā)熒光的油，用OLYMPUS BX-51落射熒光顯微鏡于暗室中觀察并計(jì)數(shù)；熒光顯微鏡的激發(fā)光波長(zhǎng)480nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為610nm；待檢標(biāo)片可置于溫盒內(nèi)，在4℃低溫存放1d；(6)、VBNC細(xì)菌熒光顯微鏡計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)時(shí)至少隨機(jī)選擇10個(gè)不同視野，而每個(gè)視野中的細(xì)菌數(shù)不低于30-50個(gè)，而后取平均值；觀察計(jì)數(shù)時(shí)，每個(gè)視野在1min之內(nèi)完成；當(dāng)看到呈現(xiàn)綠色熒光的即為活菌，而呈現(xiàn)紅色熒光的即為死菌；VBNC細(xì)菌數(shù)的具體計(jì)數(shù)可參考以下公式 其中E為樣品中細(xì)菌總數(shù)(個(gè)/mL)；X為各計(jì)數(shù)視野細(xì)菌總數(shù)的平均值(個(gè))；S1為濾膜面積(mm)；S2為顯微鏡油鏡的視野面積(mm)；V為待檢VBNC細(xì)菌液的體積(mL)。
2、 權(quán)利要求1所述的細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與 計(jì)數(shù)方法，其特征在于所述的熒光顯微鏡標(biāo)本制片的固定方式為物理 固定方式，即利用濕潤(rùn)的濾膜對(duì)載玻片和蓋玻片的吸附作用以及手動(dòng) 壓力作用。
3、 權(quán)利要求1所述的細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與 計(jì)數(shù)方法，其特征在于所述的黑色鋼筆墨水為"英雄牌"黑色鋼筆墨 水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種細(xì)菌活的非可培養(yǎng)狀態(tài)熒光顯微鏡觀察與計(jì)數(shù)方法，其特征在于具體步驟是(1)VBNC細(xì)菌觀察樣本的前處理；(2)微孔濾膜疏水性檢查與處理；(3)微孔濾膜染色；(4)VBNC細(xì)菌樣本熒光染色；(5)VBNC細(xì)菌熒光標(biāo)本的制備；(6)VBNC細(xì)菌熒光顯微鏡計(jì)數(shù)。其簡(jiǎn)化了操作流程，克服了現(xiàn)有技術(shù)的適用范圍狹窄、取材困難、觀察結(jié)果不準(zhǔn)確等缺點(diǎn)，解決了細(xì)菌VBNC研究領(lǐng)域中的技術(shù)難題，提高從業(yè)者的實(shí)踐操作水平。
文檔編號(hào)G01N1/30GK101344476SQ20081005110
公開(kāi)日2009年1月14日 申請(qǐng)日期2008年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月20日
發(fā)明者鳳 候, 孫曉媛, 影 李, 銳 段, 王偉利, 錢(qián)愛(ài)東 申請(qǐng)人:影 李