本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一株鴨疫里默氏桿菌基因缺失弱毒株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的一種主要侵染雛鴨等多種禽類的急性或慢性的接觸性傳染病。該病分布范圍廣，已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)的細(xì)菌性傳染病之一。目前，我國控制該病的主要措施是疫苗預(yù)防和藥物治療。由于鴨疫里默氏桿菌存在多種血清型且各血清學(xué)之間無交叉保護(hù)作用，所以一種疫苗只能針對一種血清型起作用。而藥物的大量使用導(dǎo)致RA的耐藥性不斷增強(qiáng)，同時也給食品造成了安全隱患。所以研制預(yù)防RA病的新型疫苗是未來的發(fā)展方向。

鐵元素是絕大多數(shù)生物體生長所必需的營養(yǎng)元素，包括細(xì)菌。然而，宿主通過“營養(yǎng)免疫”機(jī)制極大地限制了鐵的可利用度。因此病原菌必須擁有鐵轉(zhuǎn)運機(jī)制才能成功感染宿主。相反，如果病原菌鐵離子利用系統(tǒng)遭到損傷，則感染宿主的能力減弱。利用此原理可以產(chǎn)生鴨疫里默氏桿菌弱毒株并用于免疫預(yù)防。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明針對上述的問題，提供了一株鴨疫里默氏桿菌基因缺失弱毒株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一株鴨疫里默氏桿菌基因缺失弱毒株，該菌株是鴨疫里默氏桿菌CH-1ΔB739_1343，命名為Riemerella anatipestifer CH-1ΔB739_1343，于2016年8月30日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO:M2016438，該菌株缺失了血紅素轉(zhuǎn)運系統(tǒng)B739_1343基因的2352bp，所缺失的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還公開了一種鴨疫里默氏桿菌基因缺失弱毒株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)PCR擴(kuò)增RA-CH-1B739_1343基因左右同源臂及Spec抗性基因；

2)將擴(kuò)增好的RA-CH-1B739_1343基因左右同源臂及Spec抗性基因進(jìn)行酶切并連接過夜，構(gòu)建B739_1343-LSR片段；

3)構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒pEX18GMΔB739_1343-LSR；

4)構(gòu)建RA-CH-1B739_1343基因缺失株，RA-CH-1B739_1343基因缺失株即為鴨疫里默氏桿菌基因缺失弱毒株。

進(jìn)一步地，步驟1)中PCR擴(kuò)增RA-CH-1B739_1343基因左右同源臂及Spec抗性基因具體為：

1.1)根據(jù)B739_1343基因左右同源臂設(shè)計兩對引物B739_1343-L F/R和B739_1343-R F/R，并在引物5’-端添加限制性內(nèi)切酶酶切位點；利用RA-CH-1基因組作為模板，分別以B739_1343-L F/R和B739_1343-R F/R為引物擴(kuò)增B739_1343基因左右同源臂片段B739_1343-L和B739_1343-R；PCR條件為：98℃變性30s，經(jīng)98℃10s，55℃30s，72℃30s循環(huán)擴(kuò)增30次，72℃延伸7min；

其中，B739_1343-L F/R包括B739_1343-L F和B739_1343-L R，B739_1343-L F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，并在引物5’-端添加限制性內(nèi)切酶酶切位點為BamHI；B739_1343-L R的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，并在引物5’-端添加限制性內(nèi)切酶酶切位點為NheI；

B739_1343-R F/R包括B739_1343-R F和B739_1343-R R，B739_1343-R F的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，并在引物5’-端添加限制性內(nèi)切酶酶切位點為EcoRI；B739_1343-R R的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，并在引物5’-端添加限制性內(nèi)切酶酶切位點為KpnI；

1.2)根據(jù)質(zhì)粒pAM238中的Spec抗性基因片段設(shè)計引物Spec F/R，并在引物5’-端加入NheI、EcoRI酶切位點；利用質(zhì)粒pAM238作為模板，以Spec F/R為引物PCR擴(kuò)增Spec序列；PCR條件為：98℃變性30s，經(jīng)98℃10s，55℃30s，72℃50s循環(huán)擴(kuò)增30次，72℃延伸7min；

其中，Spec F/R包括Spec F和Spec R，Spec F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，并在引物5’-端加入NheI酶切位點；Spec R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，并在引物5’-端加入EcoRI酶切位點。

進(jìn)一步地，步驟2)中的構(gòu)建B739_1343-LSR片段具體為：將擴(kuò)增的左側(cè)同源臂B739_1343-L用BamHI、NheI進(jìn)行雙酶切，將擴(kuò)增的右側(cè)同源臂B739_1343-R用EcoRI、KpnI進(jìn)行雙酶切，將擴(kuò)增的Spec序列用NheI、EcoRI進(jìn)行雙酶切；將回收的三個片段B739_1343-L、Spec、B739_1343-R連接過夜；然后以連接產(chǎn)物為模，用引物B739_1343-L F、B739_1343-R R擴(kuò)增B739_1343-LSR片段。

進(jìn)一步地，步驟3)中的構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒pEX18GMΔB739_1343-LSR具體為：將擴(kuò)增的B739_1343-LSR片段和質(zhì)粒pEX18GM用BamHI和KpnI進(jìn)行雙酶切，將回收的片段和質(zhì)粒用T4連接酶連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)中，涂布于含慶大霉素的LB平板進(jìn)行篩選；將得到的單克隆進(jìn)行PCR鑒定，篩選出含有質(zhì)粒pEX18GMΔB739_1343-LSR的陽性克??；利用質(zhì)粒小抽試劑盒抽提重組質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定；將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到S17-1大腸桿菌中。

進(jìn)一步地，步驟4)中的構(gòu)建RA-CH-1B739_1343基因缺失株具體為：將大腸桿菌S17-1pEX18GMΔB739_1343-LSR接種于10mL的LB液體培養(yǎng)基中，RA-CH-1劃線于含5％脫脂羊血的LB固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期；刮取RA-CH-1于1mL濃度為10mmol/mL的MgSO₄溶液中，再用MgSO₄溶液洗2次；計算供體菌S17-1pEX18GMΔB739_1343-LSR達(dá)2.5×10⁸個菌數(shù)，受體菌CH-1達(dá)10⁹個菌數(shù)所需要的體積；根據(jù)計算的體積混勻供體菌、受體菌，然后注入濾器中過濾；取下濾膜平鋪于血平板上，30℃5％CO₂培養(yǎng)8h；將濾膜上的細(xì)菌用MgSO₄溶液洗脫下來，涂布于濃度為50μg/mL的含卡那霉素和濃度為80μg/mL的壯觀霉素的血平板上進(jìn)行培養(yǎng)；挑取生長的單克隆進(jìn)行PCR鑒定，構(gòu)建得到鴨疫里默氏桿菌基因缺失弱毒株。

進(jìn)一步地，PCR鑒定方法如下：

a)利用RA-CH-1保守序列引物16s rRNA F/R，PCR擴(kuò)增RA-CH-1的16s rRNA片段，根據(jù)電泳結(jié)果判定候選突變株是否為RA-CH-1；若電泳得到的條帶與以野生株CH-1為模板擴(kuò)增出的條帶大小一致，據(jù)此判定該候選突變株為RA-CH-1，其中，16s rRNA F的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；16s rRNA R的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

b)利用Spec抗性基因的引物Spec P1/P2，擴(kuò)增Spec抗性基因片段，根據(jù)電泳結(jié)果判斷是否發(fā)生基因的替換；若電泳得到的條帶與陽性對照大小一致，且以野生株RA-CH-1為模板未能擴(kuò)增出條帶，據(jù)此判斷Spec基因已經(jīng)替換到候選突變株基因組上；Spec F的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；Spec R的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

c)利用引物B739_1343F/R，擴(kuò)增目的基因，根據(jù)電泳結(jié)果檢測B739_1343基因是否被缺失；若以候選突變株RA-CH-1ΔB739_1343為模板未能擴(kuò)增出條帶，以野生株RA-CH-1為模板擴(kuò)增得到的條帶，且與目的條帶預(yù)期大小一致，據(jù)此判定候選突變株的基因B739_1343已被缺失；其中，B739_1343F的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；B739_1343R的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

d)利用引物SacB F/R，進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)電泳結(jié)果檢測自殺載體是否被甩出基因組；若以質(zhì)粒pEX18GM為模板擴(kuò)增得到的條帶，與SacB基因預(yù)期大小一致，而以RA-CH-1、候選突變株RA-CH-1ΔB739_1343為模板未能擴(kuò)增出條帶，據(jù)此判定自殺載體被甩出基因組；其中，SacB F的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；SacB R的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

本發(fā)明還公開了一種鴨疫里默氏桿菌基因缺失弱毒株在制備鴨疫里氏桿菌弱毒疫苗中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，該弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343對劑量>100×LD₅₀的野生強(qiáng)毒株RA-CH-1的攻毒保護(hù)率達(dá)83.33％，能夠作為RA基因缺失疫苗的候選菌株。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以獲得包括以下技術(shù)效果：

1)本發(fā)明構(gòu)建的弱毒株Riemerella anatipestifer CH-1ΔB739_1343對野生型強(qiáng)毒株的攻毒保護(hù)率達(dá)83.33％，可作為RA基因缺失疫苗的候選。

2)本發(fā)明從病原菌的營養(yǎng)代謝機(jī)制著手，構(gòu)建了一株基因缺失弱毒株，為后續(xù)開發(fā)新型的疫苗提供了新研究方法和技術(shù)保障。

當(dāng)然，實施本發(fā)明的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達(dá)到以上所述的所有技術(shù)效果。

附圖說明

此處所說明的附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，構(gòu)成本發(fā)明的一部分，本發(fā)明的示意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1是本發(fā)明PCR擴(kuò)增B739_1343基因左右同源臂和Spec抗性基因擴(kuò)增結(jié)果；其中，M：mark，1：擴(kuò)增的左側(cè)同源臂B739_1343-L，2：擴(kuò)增的右側(cè)同源臂B739_1343-R，3：擴(kuò)增的Spec抗性基因序列；

圖2是本發(fā)明重組自殺性質(zhì)粒pEX18GMΔB739_1343-LSR構(gòu)建示意圖；

圖3是本發(fā)明RA-CH-1ΔB739_1343缺失株構(gòu)建鑒定；其中，M：mark；1，2代表擴(kuò)增的RA-CH-1、RA-CH-1ΔB739_1343的保守序列；3代表擴(kuò)增的Spec序列，為陽性對照；4，5代表擴(kuò)增的RA-CH-1、RA-CH-1ΔB739_1343的Spec序列；6，7代表擴(kuò)增的RA-CH-1、RA-CH-1ΔB739_1343的B739_1343序列；8代表擴(kuò)增的SacB序列，為陽性對照；9，10代表擴(kuò)增的RA-CH-1、RA-CH-1ΔB739_1343的SacB序列；

圖4是本發(fā)明中RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株攻毒保護(hù)實驗中雛鴨存活率統(tǒng)計結(jié)果。

具體實施方式

以下將配合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明的實施方式，藉此對本發(fā)明如何應(yīng)用技術(shù)手段來解決技術(shù)問題并達(dá)成技術(shù)功效的實現(xiàn)過程能充分理解并據(jù)以實施。

實施例1Riemerella anatipestifer CH-1ΔB739_1343基因缺失弱毒株的構(gòu)建方法

1)RA-CH-1B739_1343基因左右同源臂及Spec抗性基因的PCR擴(kuò)增：

B739_1343基因左側(cè)同源臂B739_1343-L的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，B739_1343基因右側(cè)同源臂B739_1343-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，Spec抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

根據(jù)B739_1343基因左右同源臂設(shè)計兩對引物(B739_1343-L F/R，B739_1343-R F/R),并在引物5’-端添加限制性內(nèi)切酶酶切位點。

B739_1343-L F:CGGGATCCCGGTACCACCTTGGTTAATAATATTC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，在引物5’-端添加限制性內(nèi)切酶酶切位點為BamHI；

B739_1343-L R:CTAGCTAGCTAGTCCAATCCAGATTGATTTC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，在引物5’-端添加限制性內(nèi)切酶酶切位點為NheI；

B739_1343-R F:CGGAATTCCGCTATTAACATTTTTAATTAAAAC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，在引物5’-端添加限制性內(nèi)切酶酶切位點為EcoRI；

B739_1343-R R:GGGGTACCCCTACTTAGAGAGCGTACAGCTCC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，在引物5’-端添加限制性內(nèi)切酶酶切位點為KpnI；

利用RA-CH-1基因組作為模板，分別以B739_1343-L F/R和B739_1343-R F/R為引物擴(kuò)增B739_1343基因左右同源臂片段B739_1343-L和B739_1343-R。PCR條件為：98℃變性30s，經(jīng)98℃10s，55℃30s，72℃30s循環(huán)擴(kuò)增30次，72℃延伸7min。電泳結(jié)果表明擴(kuò)增得到兩條約800bp的條帶(見圖1)，與預(yù)期B739_1343-L和B739_1343-R的大小一致。

根據(jù)質(zhì)粒pAM238中的Spec抗性基因片段設(shè)計引物Spec F/R，并在引物5’-端加入NheI、EcoRI酶切位點。

Spec F：CTAGCTAGCTAGCTCGACTTCGCTGCTGCCC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，并在引物5’-端加入NheI酶切位點；

Spec R：CGGAATTCCGCGAATTGTTAGACATTATTTG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，并在引物5’-端加入EcoRI酶切位點；

利用質(zhì)粒pAM238作為模板，以Spec F/R為引物PCR擴(kuò)增Spec序列。PCR條件為：98℃變性30s，經(jīng)98℃10s，55℃30s，72℃50s循環(huán)擴(kuò)增30次，72℃延伸7min。電泳結(jié)果表明擴(kuò)增得到一條約1200bp的條帶(見圖1)，與Spec抗性基因片段預(yù)期大小一致。

2)B739_1343-LSR片段的構(gòu)建

將擴(kuò)增的左側(cè)同源臂B739_1343-L用BamHI、NheI進(jìn)行雙酶切，將擴(kuò)增的右側(cè)同源臂B739_1343-R用EcoRI、KpnI進(jìn)行雙酶切，將擴(kuò)增的Spec序列用NheI、EcoRI進(jìn)行雙酶切。

將回收的三個片段B739_1343-L、Spec、B739_1343-R連接過夜。然后以連接產(chǎn)物為模，用引物B739_1343-L F、B739_1343-R R擴(kuò)增B739_1343-LSR片段。

3)構(gòu)建重組自殺性質(zhì)粒pEX18GMΔB739_1343-LSR

將擴(kuò)增的B739_1343-LSR片段和質(zhì)粒pEX18GM用BamHI和KpnI進(jìn)行雙酶切，將回收的片段和質(zhì)粒用T4連接酶連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)中，涂布于含慶大霉素的LB平板進(jìn)行篩選。

將得到的單克隆進(jìn)行PCR鑒定，篩選出含有質(zhì)粒pEX18GMΔB739_1343-LSR的陽性克隆。利用質(zhì)粒小抽試劑盒抽提重組質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到S17-1大腸桿菌中。重組自殺性質(zhì)粒pEX18GMΔB739_1343-LSR構(gòu)建示意圖見圖2。

4)RA-CH-1 B739_1343基因缺失株的構(gòu)建

本發(fā)明采用細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移方法，以大腸桿菌S17-1 pEX18GMΔB739_1343-LSR為供體菌，RA-CH-1為受體菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，具體步驟如下：

將大腸桿菌S17-1 pEX18GMΔB739_1343-LSR接種于10mL的LB液體培養(yǎng)基中，RA-CH-1劃線于含5％脫脂羊血的LB固體培養(yǎng)基(血平板)中，37℃培養(yǎng)至對數(shù)生長期；刮取RA-CH-1于1mL濃度為10mmol/mL的MgSO₄溶液中，再用MgSO₄溶液洗2次；計算供體菌S17-1pEX18GMΔB739_1343-LSR達(dá)2.5×10⁸個菌數(shù)，受體菌RA-CH-1達(dá)10⁹個菌數(shù)所需要的體積；根據(jù)計算的體積混勻供體菌、受體菌，然后注入濾器中過濾；取下濾膜平鋪于血平板上，30℃5％CO₂培養(yǎng)8h；將濾膜上的細(xì)菌用MgSO₄溶液洗脫下來，涂布于含卡那霉素(50μg/mL)和壯觀霉素(80μg/mL)的血平板上進(jìn)行培養(yǎng)；挑取生長的單克隆進(jìn)行PCR鑒定。

PCR鑒定的步驟為：

a)利用RA-CH-1保守序列引物16s rRNA F/R，PCR擴(kuò)增RA-CH-1的16s rRNA片段(960bp)，判定候選突變株是否為RA-CH-1。電泳結(jié)果表明以候選突變株(RA-CH-1ΔB739_1343)為模板擴(kuò)增得到一條約1000bp的條帶(見圖3)，與以野生株CH-1為模板擴(kuò)增出的條帶大小一致，據(jù)此判定該候選突變株為RA-CH-1；

其中，16s rRNA F/R包括16s rRNA F和16s rRNA R，16s rRNA F：CTTCGGATACTTGAGAGCG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；16s rRNA R：GCAGCACCTTGAAAATTGT，其核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

b)利用Spec抗性基因的引物Spec P1/P2，擴(kuò)增Spec抗性基因片段(1140bp)，判斷是否發(fā)生基因的替換。電泳結(jié)果表明以候選突變株(RA-CH-1ΔB739_1343)為模板擴(kuò)增得到一條約1000bp的條帶(見圖3)，與陽性對照大小一致，且以野生株RA-CH-1為模板未能擴(kuò)增出條帶，據(jù)此判斷Spec基因已經(jīng)替換到候選突變株基因組上；

其中，Spec P1/P2包括Spec P1和Spec P2，Spec P1：CTCGACTTC GCTGCTGCCC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；Spec P2：CGAAT TGTTAGACATTATTTG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

c)利用引物B739_1343F/R，擴(kuò)增目的基因以檢測B739_1343基因是否被缺失。電泳結(jié)果表明以候選突變株(RA-CH-1ΔB739_1343)為模板未能擴(kuò)增出條帶，以野生株RA-CH-1為模板擴(kuò)增得到一條約2000bp的條帶(見圖3)，與目的條帶預(yù)期大小一致，據(jù)此判定候選突變株的基因B739_1343已被缺失。

其中，B739_1343F：CATGCCATGGATGATGCTGTTTTTCAGCACCG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；B739_1343R：CTAGTCTAGATTAA AAATTAAATTGACAAGTG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

d)利用引物SacB F/R，進(jìn)行擴(kuò)增以檢測自殺載體是否被甩出基因組；電泳結(jié)果表明以質(zhì)粒pEX18GM為模板擴(kuò)增得到一條約為1000bp的條帶，與SacB基因預(yù)期大小一致，而以RA-CH-1、候選突變株(RA-CH-1ΔB739_1343)為模板未能擴(kuò)增出條帶(見圖3)，據(jù)此判定自殺載體被甩出基因組。

其中，SacB F:CATGCCATGGATGAACATCAAAAAGTTTGC，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；SacB R:CTAGTCTAGACTAGTTATTTGTT AACTGTTAATTGTCCTTGTTCAAGG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

實施例2檢測基因缺失株RA-CH-1ΔB739_1343對雛鴨的毒力是否減弱

測定RA-CH-1ΔB739_1343缺失株的LD₅₀值。具體步驟如下：

將RA-CH-1，RA-CH-1ΔB739_1343缺失株分別接種于TSB中，37℃180rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。常溫下收集菌體，用PBS洗3遍，測定菌液OD₆₀₀值。然后準(zhǔn)備菌液到以下4個濃度梯度：5×10¹⁰CFU/mL、5×10⁹CFU/mL、5×10⁸CFU/mL、5×10⁷CFU/mL。

將3日齡北京鴨分成4組，每組10只，每只經(jīng)肌肉注射途徑接種0.2mL菌液，攻毒劑量分別為10¹⁰CFU、10⁹CFU、10⁸CFU、10⁷CFU。觀察記錄攻毒后一周內(nèi)鴨子存活情況。通過Reed-Muench法計算半數(shù)致死量。

結(jié)果：RA-CH-1ΔB739_1343缺失株的LD₅₀值大于10¹⁰CFU,RA-CH-1的LD₅₀值約為10⁸CFU(見表1)；RA-CH-1ΔB739_1343缺失株對雛鴨的致病力下降了至少100倍。

表1RA-CH-1ΔB739_1343缺失株LD₅₀的測定結(jié)果

實施例3提供弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343作為基因缺失候選疫苗的應(yīng)用

1)基因缺失候選疫苗的制備：

弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集菌體后稀釋至含菌量約為5×10⁸CFU/mL。

2)免疫接種途徑及劑量：

3日齡雛鴨經(jīng)腿部肌肉注射免疫，0.2ml/只，免疫劑量約為10⁸CFU。

3)提供該基因缺失弱毒株的安全性檢驗結(jié)果：

以免疫后雛鴨的臨床表現(xiàn)以及體重變化作為評估指標(biāo)，免疫弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343組與未免疫對照組基本上無差異。

4)提供該基因缺失弱毒株的免疫保護(hù)效果：

該弱毒株對高劑量(>100×LD₅₀)野生強(qiáng)毒株RA-CH-1的攻毒保護(hù)率達(dá)83.33％，而且免疫RA-CH-1ΔB739_1343組的存活的鴨子與滅活疫苗組均能正常采食、飲水、精神良好，體重增值基本無差異。

實施例4RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株作為基因缺失候選疫苗的評價

RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株免疫雛鴨后的安全性檢驗和攻毒保護(hù)力測定。

選擇北京鴨為動物模型，低劑量經(jīng)肌肉注射免疫RA-CH-1ΔB739_1343，再用野生株RA-CH-1攻毒，測定免疫弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343后的攻毒保護(hù)力。具體步驟如下：

1)將弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343接種于TSB中，37℃180rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

2)常溫下，6500rmp離心收集菌體，用PBS洗3遍，稀釋后測定菌液OD₆₀₀值。

3)根據(jù)測定的OD₆₀₀值，稀釋RA-CH-1ΔB739_1343到濃度約為5×10⁸CFU/mL。

4)將3日齡北京鴨分成4組，每組20只。第一組I經(jīng)腿部肌肉注射0.2mL滅菌PBS，作為陰性對照；第二組II經(jīng)腿部肌肉注射0.2mL濃度約為5×10⁸CFU/mL的RA-CH-1ΔB739_1343，免疫劑量約為10⁸CFU；第三組III經(jīng)頸部皮下注射0.25mL商品滅活疫苗(成都天邦生物制品有限公司，漿利佳)，作為陽性對照；第四組IV不免疫不攻毒，作為空白對照。監(jiān)測免疫后鴨子的臨床表現(xiàn)，同時稱量各組鴨子的體重，評估弱毒株RA-CH-1ΔB739_1343的安全性。

5)首免后12d對第一組I、第二組II、第三組III用RA-CH-1菌液經(jīng)腿部注射攻毒，參照之前測定的LD₅₀值，每只攻毒劑量約為2.28×10¹⁰(>100×LD₅₀)。監(jiān)測攻毒后10天內(nèi)鴨子健康情況及體重變化。

結(jié)果：

RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株免疫雛鴨后的安全性檢驗：在攻毒之前，免疫RA-CH-1ΔB739_1343組與其它三組鴨子平均體重?zé)o明顯差異，而且鴨子采食、飲水、精神狀況等臨床特征均表現(xiàn)正常(見表2)，表明該弱毒株并不影響鴨子的生長性能，應(yīng)用上安全可靠。

表2觀察期間鴨子體重情況及臨床表現(xiàn)

其中，組別I代表免疫PBS組，組別II代表免疫RA-CH-1ΔB739_1343組，組別III代表免疫商品滅活疫苗組，組別IV代表空白對照組。

RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株免疫雛鴨后的攻毒保護(hù)力測定結(jié)果：RA-CH-1攻毒之后，商品滅活苗組和空白對照組鴨子存活率為100％；RA-CH-1ΔB739_1343免疫組存活率為85％；PBS組存活率為25％(見圖3)。PBS組存活的鴨子表現(xiàn)消瘦、嗜睡、神經(jīng)癥狀等，而免疫RA-CH-1ΔB739_1343組的存活的鴨子與滅活疫苗組、空白對照組均能正常采食、飲水、精神良好，且體重增值基本無差異(見表2)。RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株攻毒保護(hù)結(jié)果表明弱毒株對高劑量(>100×LD₅₀)野生型強(qiáng)毒株RA-CH-1的攻毒保護(hù)率達(dá)83.33％(見表3)。

表3本發(fā)明中RA-CH-1ΔB739_1343弱毒株攻毒保護(hù)力測定結(jié)果

其中，組別II中RA-CH-1ΔB739_1343的免疫劑量約為10⁸CFU。

以上結(jié)果表明該弱毒株在應(yīng)用上安全可靠，具有較高的攻毒保護(hù)效果，可作為研發(fā)新型的基因缺失疫苗的候選菌株。

上述說明示出并描述了發(fā)明的若干優(yōu)選實施例，但如前所述，應(yīng)當(dāng)理解發(fā)明并非局限于本文所披露的形式，不應(yīng)看作是對其他實施例的排除，而可用于各種其他組合、修改和環(huán)境，并能夠在本文所述發(fā)明構(gòu)想范圍內(nèi)，通過上述教導(dǎo)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)或知識進(jìn)行改動。而本領(lǐng)域人員所進(jìn)行的改動和變化不脫離發(fā)明的精神和范圍，則都應(yīng)在發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一株鴨疫里默氏桿菌基因缺失弱毒株及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

<130> 2016

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2352

<212> DNA

<213> 血紅素轉(zhuǎn)運系統(tǒng)B739_1343基因

<400> 1

atgatgctgt ttttcagcac cgttctaaat gcacagcttt accttataga aggtcaggta 60

agagatttgc acgacaatac acctttagct aatgctaaaa taagtattaa cggaaaactc 120

attaccactt ctgatactca aggaaatttt aatttttctt acaaaaaagg cactcatcat 180

cttttgataa cccacttaga ttgtgaacct tttactaaaa agataatact tgatagaaat 240

attaaaatca acattttcct tgagcatcat actaatgaaa tagaaaccgt agtagtacat 300

ggcattcata aaaagtcagg gacggcggtt atcaaaacat tagaacagtc ttttttagag 360

caaaaaacta ccgaaaatct aggcaacata ttgtctgaaa tttctggagt aaatagtatt 420

aaaacaggga ataacatttc taaacctgtt atacaaggac tttacggcag tagagtgttg 480

gtaatgaaca acggcatcaa aatggcagaa caagaatggg gcatagaaca cgctcctagc 540

gtggatccca acgcttttga ccatatagat gttgtaaagg gagcatctgc actaaagtac 600

ggtggagatg ccataggtgg cgttatacta ttagaaagtc ctaaataccc taaaaaagac 660

acccttatgg gtaaagtagc tttatcaggc atcagcaatg gtaaaggctt ggctctgaat 720

acggacatta caaagacttg gcaaaacggt tgggctttgc ggacgcaagg ttctgccaaa 780

aagctaggag atttggaaac acccaattat agtttacaaa atacgggtgc agatgaaaac 840

gcctcccact tttccctaca aaaaagggaa tacgaatacg gaatcacggc taaatattct 900

ttcatcaacc aaaattttgg aatttataaa ggggctcata tcagtaatgc aagaaacttt 960

gccgatgcca tcaataacgg acaatcctac tttacaggta attttggtta taaaatagag 1020

aatcctaaac aagaagttag ccatcacatt gctaaattgg aggcttacaa aagattagga 1080

aggctaggaa aatttacttt agaatatgcc tttcagcaaa atcatagatt tgaatacgat 1140

attcgtagag gagcgtacaa tgataaacct gctaccgacc tactactaac cacccaaagt 1200

ttggctcttt atcatctatt agaaagaccc aactggcagt gggaaacagg tctatcagga 1260

aattatcaag ttaattttcc cgacccaaaa acggagcgtt ctcgtttaat accagattac 1320

cataggtatg atgctggtgc tttttctatt ttcaaatatc aaaaaaatct ttggaaatgg 1380

gaagcagctt tgcggtacga tatgaatttc tacgatgtgt ataaatatta ccttaataaa 1440

gattgggcag cttacagcca agcgtttcat caatttgtaa ttgaaagtaa aggagtgaaa 1500

acattggtgc gtccaaaact ttattaccat aatatatcag catcgttggg tatggaatat 1560

cagcccactc gctttcttac taccaaattt aatttgataa gaaatagccg aagtcctaat 1620

gttgcagaat tattcgctga tgggctacac cacgctgctg ccattattga aaagggagat 1680

atgactatca aaaacgagga aacctaccaa gcccacctaa gcattggtat aaaagcctcc 1740

gttcttaatg gttttaaact taatcttaat ccgtattatt tcacttccga tagttttatt 1800

aaccaaacac ctaacggagt ggaaagtacc attcgtggga atttccctgt atggcaatat 1860

caacagatta aagccaaaat gtatgggata gacatagatt cagaacttaa catcactcca 1920

aaattacaat ggaatggagc gatgagctat gtgtacggac aagacttaac ccataatgaa 1980

cccttgatac ttatgcctcc aatgcagatt aaaaacgccc taagatatga taacaaaggt 2040

aaaaaaccgt ggcatataca aatagaaaac ctagtggtat ttaagcagaa aagatttcct 2100

atgaggcttt tatcctacga tgtatatgag aacaatacaa taaccaaaga gtggctagac 2160

attagtacac cacccgcagg ttatcaaatt tggaacctca atgctggagc aaagctcact 2220

agaaacattc agcttaattt gagtgttaat aatatattca atacaactta tagagaatat 2280

cttaaccgtt tgagattttt ctctgatgct ttgggacgaa atattatttt cacttgtcaa 2340

tttaattttt aa 2352

<210> 2

<211> 796

<212> DNA

<213> B739_1343基因左側(cè)同源臂序列

<400> 2

gtaccacctt ggttaataat attcttaaca gacctaggtc ccattttaat catgttccct 60

tctataagcc cattgtaccc ttctctaatc cccatacatt ctataccata ataatgagct 120

gttcttacca ctgcccttat cgccgcattc atacctggag aatcccctcc agaagtaaga 180

actcctatcc ttttcaactt tgattctgac ataattaaat actttttagc ctagcaaata 240

taagaaattt taactacatt attttaagat ttatatcata ttattactcc tacatctatt 300

cattacatgt tcatttgtat cttagtaaat aaaagttttt ttacctttgc aaaatgtttt 360

cagggaaact tcttttcaga aaagttacaa gtataagcct tgcatgggtt tatgcattag 420

ctttactgat ggctagtgta ttccactcgc atcaagagac ttttaatagt aattataatt 480

cttcccaaaa acagaatcac aaaataatca gtttaaaggg agatgattgt tctatctgtc 540

attttttcat ttcagggcat tctctgcttc ccgaaaaggt aaactttgaa gttttagtat 600

cagtagctac tacacttata ataggctaca agacactgga catccttcag aatcaaattg 660

tttatttctt acttagagga ccgccttcta ttttatagaa ataatatcat tttcactagg 720

tgttctaccg ttttgttagg acacggtttt aaccttttaa ttttcatatc tttaaatgaa 780

atcaatctgg attgga 796

<210> 3

<211> 803

<212> DNA

<213> B739_1343基因右側(cè)同源臂序列

<400> 3

ctattaacat ttttaattaa aacaatttta aaacattatg aaacattcat ttttaaaaac 60

cgcagtatta tccgcagtaa gtattttagc cctcaactct tgtagagata atgatgaagc 120

acctgccgat gtacacaacc acgacgaagt acaatacctt accgttacac ttaccaatac 180

tgctgataac agcacccaaa ccgctacatt cagtgcagaa ggagctgata aagagttagt 240

tttaaaagaa aacaacactt atgatgttca gttatcatta gtagctcctc atgacgacca 300

tacccacgat gttactgatg aaatcataga actaaaagag gaacattttt tcacttataa 360

tttctctaat gtagatgtta aagttactag aaaagatgaa gctgaaagca ctagaaaaga 420

tgggtctaaa ataggtctaa aaacacagtg gcaagtaaca tctgcaccaa aaacaggagc 480

taaagctaac attagacttt accaccttcc tacctctgtg aaaatgagcg gtgctaatgg 540

agacgaagca ggaactgtaa caggtggtga agaggatatt gatgctactt ttaatgttaa 600

ataatgaaat atatctatgt agacacagat attgatactt taatatgatg tttaactcaa 660

aaaatcaaac aaaatgaaaa aagtattttt actaggagca ttagctctgt acagtgctac 720

aaatgcacaa cttaaatttg gtggaaaagc aggatacgcc ttatccgaag tcggagatac 780

aggagctgta cgctctctaa gta 803

<210> 4

<211> 1140

<212> DNA

<213> Spec抗性基因

<400> 4

ctcgacttcg ctgctgccca aggttgccgg gtgacgcaca ccgtggaaac ggatgaaggc 60

acgaacccag tggacataag cctgttcggt tcgtaagctg taatgcaagt agcgtatgcg 120

ctcacgcaac tggtccagaa ccttgaccga acgcagcggt ggtaacggcg cagtggcggt 180

tttcatggct tgttatgact gtttttttgg ggtacagtct atgcctcggg catccaagca 240

gcaagcgcgt tacgccgtgg gtcgatgttt gatgttatgg agcagcaacg atgttacgca 300

gcagggcagt cgccctaaaa caaagttaaa catcatgagg gaagcggtga tcgccgaagt 360

atcgactcaa ctatcagagg tagttggcgt catcgagcgc catctcgaac cgacgttgct 420

ggccgtacat ttgtacggct ccgcagtgga tggcggcctg aagccacaca gtgatattga 480

tttgctggtt acggtgaccg taaggcttga tgaaacaacg cggcgagctt tgatcaacga 540

ccttttggaa acttcggctt cccctggaga gagcgagatt ctccgcgctg tagaagtcac 600

cattgttgtg cacgacgaca tcattccgtg gcgttatcca gctaagcgcg aactgcaatt 660

tggagaatgg cagcgcaatg acattcttgc aggtatcttc gagccagcca cgatcgacat 720

tgatctggct atcttgctga caaaagcaag agaacatagc gttgccttgg taggtccagc 780

ggcggaggaa ctctttgatc cggttcctga acaggatcta tttgaggcgc taaatgaaac 840

cttaacgcta tggaactcgc cgcccgactg ggctggcgat gagcgaaatg tagtgcttac 900

gttgtcccgc atttggtaca gcgcagtaac cggcaaaatc gcgccgaagg aggtcgctgc 960

cgactgggca atggagcgcc tgccggccca gtatcagccc gtcatacgtg aagctagaca 1020

ggcttatctt ggacaagaag aagatcgctt ggcctcgcgc gcagatcagt tggaagaatt 1080

tgtccactac gtgaaaggcg agatcaccaa ggtagtcggc aaataatgtc taacaattcg 1140

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgggatcccg gtaccacctt ggttaataat attc 34

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctagctagct agtccaatcc agattgattt c 31

<210> 7

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cggaattccg ctattaacat ttttaattaa aac 33

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggggtacccc tacttagaga gcgtacagct cc 32

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ctagctagct agctcgactt cgctgctgcc c 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cggaattccg cgaattgtta gacattattt g 31

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cttcggatac ttgagagcg 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcagcacctt gaaaattgt 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ctcgacttcg ctgctgccc 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgaattgtta gacattattt g 21

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

catgccatgg atgatgctgt ttttcagcac cg 32

<210> 16

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctagtctaga ttaaaaatta aattgacaag tg 32

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

catgccatgg atgaacatca aaaagtttgc 30

<210> 18

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctagtctaga ctagttattt gttaactgtt aattgtcctt gttcaagg 48