專利名稱：一株針對鴨疫里默氏桿菌的單抗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及抗體工程技術(shù)，具體為識別不同血清型鴨疫里默氏桿菌的單克隆抗體及其以此為基礎(chǔ)建立的一種雙抗體夾心ELISA方法來檢測鴨疫里默氏桿菌。
背景技術(shù)：
鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer，RA)是引起鴨傳染性漿膜炎的病原菌，它主要侵害以水禽為主的多種家禽而引起急性或慢性傳染病。發(fā)病病鴨常表現(xiàn)出嗜睡、 歪頸、跛行、排黃綠稀糞，眼鼻有漿液性分泌物，隨后出現(xiàn)痙攣、角弓反張等神經(jīng)癥狀。以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、干酪性輸卵管炎和腦膜炎為其病變特征。目前在我國已先后報道了血清1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、13、14型和4個未定名型，其中以血清1型和血清2 型為主要流行型。世界各養(yǎng)鴨地區(qū)幾乎都有該病流行，已成為危害養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，該病病死率高，又可引起鴨生產(chǎn)性能降低，且治療費(fèi)用較高，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大。因此如何準(zhǔn)確、快速的診斷成為防治該病的關(guān)鍵。針對RA的檢測方法目前主要有細(xì)菌分離鑒定、凝集試驗、瓊擴(kuò)試驗、間接ELISA 試驗、PCR檢測和免疫膠體金試紙條等，其中以ELISA、免疫膠體金試紙條和PCR方法較為快速準(zhǔn)確。間接ELISA方法具有檢測成本低，靈敏性高、特異性強(qiáng)，適于批量樣品測定等優(yōu)點(diǎn)， 目前已建立了一些ELISA檢測方法，如辜新貴等應(yīng)用假定保守蛋白P25包被反應(yīng)板，以此檢測血清中有無RA抗體。張鶴曉等用裂解的1型RA菌體作為包被抗原，建立間接ELISA方法，檢測鴨血清中抗RA抗體。胡清海等脂多糖(LPQ作為包被抗原，建立了間接ELISA方法來檢測血清中抗體，人工感染RA的鴨在感染72 h即可檢出抗體；但由于RA的血清型十分復(fù)雜，此法只適用于對同一血清型的不同菌株的抗體進(jìn)行檢測，所以在應(yīng)用中也具有一定的局限性。目前建立的ELISA方法主要是檢測針對RA抗體，而針對RA抗原檢測的ELISA 方法還沒有。所以有必要開展相關(guān)研究，以滿足現(xiàn)場和生產(chǎn)實踐中的需求。本實驗建立的雙抗體夾心ELISA用于RA病原直接檢測，對該病的診斷可提供快速有效的工具。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了 1株針對鴨疫里默氏桿菌的單抗，以及該單抗的應(yīng)用，有效地解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的問題。本發(fā)明所述的鴨疫里默氏桿菌單克隆抗體細(xì)胞株，命名為5G7，其保藏編號為 CGMCC No. 5165。該單抗具有良好的特異性，與鴨源巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌無交叉反應(yīng)，與已知血清型1、2、3、11型RA菌株反應(yīng)。Western - blot結(jié)果顯示單抗5G7可結(jié)合45KD 左右蛋白條帶；另以血清1型RA菌株免疫兔制備RA的多抗血清；以純化的多抗IgG作為捕獲抗體，純化的單抗作為檢測抗體，建立雙抗體ELISA法來檢測鴨疫里默氏桿菌。應(yīng)用本發(fā)明的單抗建立雙抗體ELISA法，不但可以直接檢測病原，而且可同時檢測血清型1、2、3、11型RA菌株，包含了其主要流行血清型菌株，具有較為廣泛的應(yīng)用價值。為鴨傳染性漿膜炎的診斷提供了快速、特異、敏感的檢測方法。


圖 1 是 RA 全菌 SDS-PAGE 電泳圖。M: marker 圖2是單抗5G7ffestern-blot分析。圖3是純化多抗SDS-PAGE電泳結(jié)果。圖4純化單抗SDS-PAGE電泳結(jié)果，Mmarker;單抗5G7。
具體實施例方式本發(fā)明中生物材料可通過以下途徑獲得
1、2、3、11四個血清型的RA 參考文獻(xiàn)1、3型言天久.百色市鴨疫里默氏桿菌病流行病學(xué)調(diào)查與防治的研究[D].廣西大學(xué)，2007。2型與11型楊勇.江蘇部分地區(qū)鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定及致病性研究[D]，揚(yáng)州大學(xué)，專業(yè)碩士論文，2008;云水麗，楊勇，王小波等.11型鴨疫里默氏桿菌分離鑒定及致病性研究[J].預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2009，8:605-609。巴氏桿菌(國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒菌株C48-1，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。沙門氏菌(雞腸炎沙門氏菌參考株C500041，購自美國ATCC)。大腸桿菌(DH5 α，購自Promega公司)。1、單抗的制備 1. 1抗原的制備
復(fù)蘇血清1型和2型鴨疫里默氏桿菌，經(jīng)傳代后全板劃線，擴(kuò)大培養(yǎng)。收獲并進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)，0. 1%甲醛滅活后最終將細(xì)菌稀釋至109CFU/mL。1.2動物免疫
分別取血清1型和2型適量的菌液(100 μ L左右)與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化， 皮下分點(diǎn)注射8周齡BALB/c小鼠200 μ L/只；2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐劑乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同劑量抗原腹腔注射，不加佐劑；3天后融合。1.3 融合
取加強(qiáng)免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血作為陽性血清；頸脫白將小鼠致死，無菌取脾臟，分離脾細(xì)胞，經(jīng)臺盼藍(lán)計數(shù)，按5:1的比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞(2X IO7)混合，在 PEG4000作用下進(jìn)行細(xì)胞融合；融合細(xì)胞經(jīng)洗滌后，用HAT選擇培養(yǎng)基重懸，置37°C 5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；5d后半量換液；IOd后改用HT培養(yǎng)基；觀察雜交瘤細(xì)胞的生長情況，待其細(xì)胞培養(yǎng)上清變黃或克隆分布至孔底面積的1/10以上時，吸取100 μ 1細(xì)胞上清進(jìn)行抗體檢測。1.4雜交瘤細(xì)胞的篩選
分別以血清1型和血清2型全菌為檢測抗原，采用間接ELISA方法來篩選陽性克隆。將全菌用PBS稀釋，108CFU/mL, 100 μ L/孔包被酶標(biāo)板，50°C烘箱過夜烘干；每孔加入冷甲醇固定，100 μ L/孔，15min ；用PBST洗滌3遍，每次5min,在吸水紙上拍干；加封閉液200 μ L/ 孔，4°C反應(yīng)過夜，同上洗滌3遍；加入待檢細(xì)胞上清IOOyL/孔，37°C孵育lh，同上洗滌3 遍；加入工作濃度(1 :8000稀釋)的羊抗鼠HRP-IgG 50 μ Li/孔，37°C孵育lh，同上洗滌3遍；加入TMB顯色液50 μ L/孔，37°C反應(yīng)10_15min ；加入2M H2SO4 50 μ 1/孔終止反應(yīng)。測定孔內(nèi)的0D45(i。免疫小鼠血清作為篩選時的陽性對照，非免疫的ICR小鼠血清作為陰性對照，同時設(shè)立空白調(diào)零孔。1.5雜交瘤細(xì)胞的亞克隆
采用有限稀釋法對ELISA檢測為陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆。將陽性孔中的雜交瘤細(xì)胞吹下，經(jīng)計數(shù)后用HT培養(yǎng)基稀釋，按1個細(xì)胞/孔、3個細(xì)胞/孔、10個細(xì)胞/孔加入到裝有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中；37°C 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7-10天，對出現(xiàn)單個細(xì)胞克隆孔的上清再用間接ELISA方法進(jìn)行檢測；連續(xù)進(jìn)行3-4次亞克隆，至每個細(xì)胞孔上清均為陽性時定株，擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存細(xì)胞。1.6腹水的制備
取10周齡的BALB/c小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，0. 5mL/只；1周后腹腔注射用PBS 稀釋的處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞，IX IO6CFU/只；待小鼠腹部明顯隆起時，用16號針頭從腹腔采集腹水，2500rpm離心lOmin，去除脂肪組織，將上清取出，_70°C保存?zhèn)溆谩?. 7單抗特性的鑒定 1. 7. 1單抗特異性鑒定
取巴氏桿菌C48-1、沙門氏菌C500041、大腸桿菌DH5a包被96孔酶標(biāo)板，分別對單抗進(jìn)行間接ELISA試驗，步驟同1. 4。 采用間接ELISA方法，各種細(xì)菌包被濃度108CFU/mL,每孔100 μ L，單抗腹水 1:1000稀釋，結(jié)果顯示以血清2型RA免疫小鼠融合后獲得的1株單抗5G7與1、2、3、11四個血清型的RA產(chǎn)生交叉反應(yīng)(表1)。 表1單抗特異性鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一株鴨疫里默氏桿菌單克隆抗體細(xì)胞株5G7，它的保藏編號是CGMCC No. 5165。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株針對鴨疫里默氏桿菌的單抗。所說的單抗5G7，其保藏編號為CGMCC No.5165。用該單抗在制備成檢測鴨疫里默氏桿菌的免疫膠體金試紙，不但可以直接檢測病原，而且可同時檢測血清型1、2、3、11型RA菌株，具有較為廣泛的應(yīng)用價值。
文檔編號G01N33/577GK102304493SQ20111027103
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者劉秀梵, 孫化露, 張敬友, 彭大新, 陳冰, 陳素娟, 高以明 申請人:揚(yáng)州大學(xué)