專利名稱：一種制備紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白雙向電泳樣品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白的方法，特別涉及一種制備紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白雙向電泳樣品方法。
背景技術(shù)：
黃酒是世界三大釀造酒之一，“以麥制曲，用曲釀酒”是中國黃酒的特色，也是我國黃酒釀造工藝中一項傳統(tǒng)的操作工藝。目前黃酒生產(chǎn)用曲主要是生麥曲和熟麥曲。生麥曲采用的是傳統(tǒng)制曲工藝，利用生小麥，以自然培養(yǎng)為主，網(wǎng)羅自然界中的微生物在小麥表面生長繁殖并代謝產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，形成其獨特的風格。在黃酒釀造應用中，所釀的酒香氣較濃，口味醇厚，但存在進入主酵時間遲，發(fā)酵緩慢，殘?zhí)歉?，壓榨困難，原料利用率低等缺點。熟麥曲是對生麥曲生產(chǎn)工藝的繼承和發(fā)展，其生產(chǎn)工藝的不同之處是將小麥加熱蒸熟， 殺死小麥中的微生物，然后接種米曲霉進行純種培養(yǎng)。在實際生產(chǎn)應用中，能夠加快黃酒發(fā)酵，提高原料利用率，但存在口感較淡，雜味較重，與傳統(tǒng)的黃酒特有風味有一定差別。目前造成這些優(yōu)缺點的原因至今尚未闡明。有研究表明，生麥曲與熟麥曲由于制曲工藝的不同導致微生物來源的胞外分泌蛋白種類存在很大的差異。目前國內(nèi)針對黃酒麥曲微生物胞外分泌蛋白研究較少，且主要是利用色譜技術(shù)對麥曲中單一酶類進行純化并開展酶學性質(zhì)的研究，而通過類似方法無法全面獲得麥曲中微生物胞外蛋白的組成信息。宏蛋白質(zhì)組學是最近幾年被提出的新概念，其定義是指對某一特定中環(huán)境中微生物群落的所有蛋白質(zhì)進行大規(guī)模的分析和鑒定。宏蛋白質(zhì)組學的研究策略與經(jīng)典的蛋白質(zhì)組學研究策略相似，主要包括環(huán)境總蛋白的提取制備、 蛋白質(zhì)分離以及質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫搜索3個步驟。應用宏蛋白質(zhì)組學理論，利用雙向電泳技術(shù)對從紹興黃酒熟麥曲中浸提出的所有可溶性蛋白(即米曲霉分泌的胞外蛋白)進行高分辨率分離，將為后續(xù)利用質(zhì)譜分析手段大規(guī)模鑒定麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白，并進一步在酶學水平弄清生麥曲與熟麥曲差異性奠定基礎。選擇合適的樣品制備方法是雙向電泳成功的關(guān)鍵因素之一，制備方法選擇不當， 會造成大量鹽離子和其他干擾物質(zhì)殘留，嚴重影響等電聚焦，從而影響雙向電泳的結(jié)果。熟麥曲中米曲霉胞外的分泌蛋白必須盡可能從固態(tài)麥曲中利用緩沖體系全部浸提出來，同時還要除去多糖、脂類、核酸等干擾雙向電泳的雜質(zhì)，并需盡量避免目標蛋白樣品的降解。迄今為止，還沒有制備熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白雙向電泳樣品的有效方法和技術(shù)，從而導致利用蛋白組學技術(shù)進行黃酒熟麥曲微生物胞外酶的相關(guān)研究一直停滯不前。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種制備較高質(zhì)量的紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白雙向電泳樣品的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括以下步驟
1)稱取一定質(zhì)量的紹興黃酒熟麥曲，加入適當體積濃度為0. lmol/L, pH4. 2的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，同時加入一片蛋白酶抑制劑混合片，在4°C條件下浸提4-12h;然后使用4層紗布過濾，所得濾液利用高速冷凍離心機以12000r/min轉(zhuǎn)速離心30min，收集上清液；2)將步驟1)中得到的上清液經(jīng)過微孔濾膜過濾兩次，使用超濾管進行濃縮去鹽。3)吸取步驟2)中制得的樣品提取液100 μ L加到1. 5mL離心管中，使用clean up kit試劑盒按照產(chǎn)品說明書進行樣品處理，最終獲得樣品沉淀。4)向步驟3)中制得的蛋白沉淀加入適量的樣品裂解液(8mol/L尿素、0.02g/mL 的CHAPS、體積百分含量為0. 5%的IPG緩沖液、0. 002g/mL的溴酚藍，50mmol/L DTT)，室溫下充分溶解，離心取上清液，上清液即為紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白雙向電泳樣品；所述步驟1)中紹興黃酒熟麥曲用量5-15g/20mL，優(yōu)選為10g/20mL。所述步驟1)中在4°C條件下浸提麥曲12h。所述步驟2)中微孔濾膜的直徑為0. 45 μ m。所述步驟2)中超濾管的截留分子量為lOKDa，以7000r/min轉(zhuǎn)速離心60min來濃
縮樣品提取液。所述步驟幻中clean up kit試劑盒處理樣品程序如下加入300 μ L沉淀試劑I 于離心管中，混合振蕩，冰上靜置15min ；加入300yL沉淀試劑II于離心管中，混合振蕩； 以12500r/min轉(zhuǎn)速離心5min來沉淀蛋白質(zhì)，離心結(jié)束后，傾倒上清液；加入40 μ L洗液I 于離心管底，混合振蕩；以12500r/min轉(zhuǎn)速離心5min來沉淀蛋白質(zhì)，離心結(jié)束后，傾倒上清液；加入25 μ L超純水于離心管底，混合振蕩IOs ；加入ImL的洗液II禾Π 5 μ L的洗液II 添加劑于離心管中，振蕩Imin ；將離心管在-20°C下放置30min，放置過程中每IOmin振蕩 30s ；冷凍結(jié)束后，以13000r/min轉(zhuǎn)速離心5min，傾倒上清液，蛋白沉淀在室溫條件下，空氣干燥3min。所述步驟4)中制得蛋白沉淀與樣品裂解液的質(zhì)量體積比為 150 μ g/200 μ L-250 μ g/200 μ L,優(yōu)選為 200 μ g/200 μ Lo發(fā)明人通過長時間的科學研究，發(fā)現(xiàn)具有較低離子強度的弱酸性緩沖液提取紹興黃酒熟麥曲中米曲霉的胞外分泌蛋白，能最大限度地提取出含有目標蛋白的樣品。采用 clean up kit試劑盒法來沉淀蛋白質(zhì)，可以有效地去除鹽離子、多糖、脂類、核酸等干擾電泳效果的物質(zhì)。使用的樣品裂解液中，尿素作為變性劑能破壞蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，打斷非共價連接。CHAPS是一種兼性去污劑，能打斷蛋白質(zhì)分子或亞基間的疏水作用，增加蛋白質(zhì)的溶解性。加入二硫蘇糖醇是為了打斷二硫鍵，并使所有蛋白質(zhì)處于還原狀態(tài)。IPG緩沖液能通過電荷與電荷之間的反應減少蛋白質(zhì)結(jié)合，從而增加蛋白質(zhì)的可溶性。本發(fā)明制備紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白雙向電泳樣品的方法快速可靠、簡單易行，可獲得較高質(zhì)量且重復性較好的雙向電泳圖譜，便于后續(xù)的生物質(zhì)譜分析鑒定蛋白，具有較大的實際應用價值。


圖1為紹興黃酒熟麥曲米曲霉分泌胞外蛋白的雙向電泳圖譜
具體實施例方式在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。在以下的實施例中，未詳細描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法實施例11、樣品制備1)稱取IOg浙江紹興某黃酒廠生產(chǎn)的的熟麥曲，加入20mL濃度為0. lmol/L， PH4.2的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，同時加入一片蛋白酶抑制劑混合片，在4°C條件下浸提12h ；然后使用4層紗布過濾，所得濾液利用高速冷凍離心機以12000r/min轉(zhuǎn)速離心 30min，收集上清液，此上清液為粗酶提取液。2)將步驟1)中得到的上清液經(jīng)過0. 45 μ m微孔濾膜過濾兩次，使用截留分子量為 IOKDa超濾管以7000r/min轉(zhuǎn)速離心60min，進行濃縮去鹽。3)吸取步驟2)制得樣品提取液100 μ L加到1. 5mL離心管中，使用clean up kit 試劑盒按照產(chǎn)品說明書進行樣品處理，最終獲得樣品沉淀。4)向步驟3)中制得的蛋白沉淀加入適量的樣品裂解液(8mol/L尿素、0.02g/mL 的CHAPS、體積百分含量為0. 5%的IPG緩沖液、0. 002g/mL的溴酚藍，50mmol/L DTT)，室溫下充分溶解，然后12000r/min離心IOmin取上清液，上清液即為紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白雙向電泳樣品。2、電泳檢測1)水化上樣吸取125 μ L含有蛋白樣品水化液，加入到IPG膠條再泡漲盤中，將 PH3-10NL, 7cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除去膠面與樣品液之間的氣泡，加入2mL礦物油覆蓋膠條，水化12h?；玫入娋劢顾Y(jié)束后將膠條轉(zhuǎn)移至Ettan H^hor膠條槽中，進行等電聚焦。等電聚焦程序設置為St 印，50VX0. 5h ；Gradient, 250VX Ih ；Gradient, 500VX Ih ； Gradient, 1000VX 0. 5h ；Gradient, 5000VX 2h ；Step, 5000V, IOOOOVh ；St印，500VX 3h。3)膠條平衡將聚焦好后的IPG膠條進行平衡。采用兩步平衡法，每次平衡15min， 平衡緩沖液配制如下膠條平衡緩沖液母液6mol/L尿素，質(zhì)量體積比2%十二烷基磺酸鈉SDS，50mmol/ L ρΗ8· 8的Tris-Hcl，體積比30%甘油，體積比0. 002%溴酚藍，溶劑為水。膠條平衡緩沖液I 每IOmL膠條平衡緩沖液母液加入IOOmg DTT。膠條平衡緩沖液II 每IOmL膠條平衡緩沖液母液加入250mg IAA。4) SDS-PAGE電泳分離膠濃度為12. 5% (10cmX8cmX 1mm)，將平衡結(jié)束后的IPG 膠條轉(zhuǎn)移至已聚合的聚丙烯酰胺凝膠膠面頂端，用質(zhì)量體積比0. 5%低熔點瓊脂糖封住頂部，以恒流方式進行電泳先IOmA電泳lOmin，然后電流調(diào)至20mA。當溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部時，關(guān)閉電源，結(jié)束電泳。5)凝膠染色、脫色剝離凝膠，置于固定液(50%乙醇，10%乙酸)固定Ih后，換到考馬斯亮藍染色液(0. 025%考馬斯亮藍R-250，25%乙醇，10%乙酸)中染色4h，換脫色液 (10%甲醇，10%乙酸)中脫色，直至背景為無色透明，蛋白點清晰為止。
6)使用GE公司的hagescarmerIII掃描儀對脫色后的雙向電泳凝膠進行掃描、拍照。雙向電泳結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明該紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白樣品的制備和分離效果較好，最終獲得了分辨率較高，重復性較好的雙向電泳圖譜(圖1)。實施例21、樣品制備1)稱取5g浙江紹興某黃酒廠生產(chǎn)的的熟麥曲，加入20mL濃度為0. lmol/L, pH42 的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，同時加入一片蛋白酶抑制劑混合片，在4°C條件下浸提4h ；然后使用4層紗布過濾，所得濾液利用高速冷凍離心機以12000r/min轉(zhuǎn)速離心30min，收集上清液，此上清液為粗酶提取液。2)將步驟1)中得到的上清液經(jīng)過0. 45 μ m微孔濾膜過濾兩次，使用截留分子量為 IOKDa超濾管以7000r/min轉(zhuǎn)速離心60min，進行濃縮去鹽。3)吸取步驟2)中制得樣品提取液100 μ L加到1. 5mL離心管中，使用clean up kit試劑盒按照產(chǎn)品說明書進行樣品處理，最終獲得樣品沉淀。4)按照150 μ g/200 μ L比例向步驟3)中制得的蛋白沉淀加入樣品裂解液(8mol/ L尿素、0. 02g/mL的CHAPS、體積百分含量為0. 5 %的IPG緩沖液、0. 002g/mL的溴酚藍， 50mmol/L DTT)，室溫下充分溶解，然后12000r/min離心IOmin取上清液，上清液即為紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白雙向電泳樣品。2、電泳檢測1)水化上樣吸取125 μ L含有蛋白樣品水化液，加入到IPG膠條再泡漲盤中，將 PH3-10NL, 7cm的IPG膠條膠面向下放入盤中，除去膠面與樣品液之間的氣泡，加入2mL礦物油覆蓋膠條，水化12h?；玫入娋劢顾Y(jié)束后將膠條轉(zhuǎn)移至Ettan H^hor膠條槽中，進行等電聚焦。等電聚焦程序設置為St 印，50VX0. 5h ；Gradient, 250VX Ih ；Gradient, 500VX Ih ； Gradient, 1000VX 0. 5h ；Gradient, 5000VX 2h ；Step, 5000V, IOOOOVh ；St印，500VX 3h。3)膠條平衡將聚焦好后的IPG膠條進行平衡。采用兩步平衡法，每次平衡15min， 平衡緩沖液配制如下膠條平衡緩沖液母液6mol/L尿素，質(zhì)量體積比2%十二烷基磺酸鈉SDS，50mmol/ L ρΗ8· 8的Tris-Hcl，體積比30%甘油，體積比0. 002%溴酚藍，溶劑為水。膠條平衡緩沖液I 每IOmL膠條平衡緩沖液母液加入IOOmg DTT。膠條平衡緩沖液II 每IOmL膠條平衡緩沖液母液加入250mg IAA。4) SDS-PAGE電泳分離膠濃度為12. 5% (10cmX8cmX 1mm)，將平衡結(jié)束后的IPG 膠條轉(zhuǎn)移至已聚合的聚丙烯酰胺凝膠膠面頂端，用質(zhì)量體積比0. 5%的低熔點瓊脂糖封住頂部，以恒流方式進行電泳先IOmA電泳lOmin，然后電流調(diào)至20mA。當溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部時，關(guān)閉電源，結(jié)束電泳。5)凝膠染色、脫色剝離凝膠，置于固定液(50%乙醇，10%乙酸)固定Ih后，換到考馬斯亮藍染色液(0. 025%考馬斯亮藍R-250，25%乙醇，10%乙酸)中染色4h，換脫色液 (10%甲醇，10%乙酸)中脫色，直至背景為無色透明，蛋白點清晰為止。6)使用GE公司的hagescarmerIII掃描儀對脫色后的雙向電泳凝膠進行掃描、拍照。結(jié)果表明該紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白樣品的制備和分離效果較好， 雙向電泳圖譜與圖1高度相似。雖然本發(fā)明已以較佳實例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)力要求書所界定的為準。
權(quán)利要求
1.一種制備紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白雙向電泳樣品的方法，包括以下步驟1)稱取一定質(zhì)量的紹興黃酒熟麥曲，加入適當體積濃度為0.lmol/L，pH4.2的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，同時加入一片蛋白酶抑制劑混合片，在4°C條件下浸提4-1 后使用4層紗布過濾，所得濾液利用高速冷凍離心機以12000r/min轉(zhuǎn)速離心30min，收集上清液；2)將步驟1)得到的上清液經(jīng)過微孔濾膜過濾兩次，使用超濾管進行濃縮去鹽；3)吸取步驟2)制備的樣品提取液100μ L加到1. 5mL離心管中，使用美國Bio-Rad公司生產(chǎn)的clean up kit試劑盒，按照產(chǎn)品說明書進行樣品處理，最終獲得樣品沉淀；4)向步驟幻中制得的蛋白沉淀加入適量的樣品裂解液，室溫下充分溶解，離心取上清液，上清液即為紹興黃酒熟麥曲中米曲霉分泌的胞外蛋白雙向電泳樣品。
2.根據(jù)權(quán)力要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中紹興黃酒熟麥曲用量 10g/20mLo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中在4°C條件下浸提麥曲12h。
4.根據(jù)權(quán)力要求1所述的方法，其特征在于所述步驟幻中微孔濾膜的直徑為 0. 45 μ m.。
5.根據(jù)權(quán)力要求1所述的方法，其特征在于所述步驟幻中超濾管截留分子量為 IOKDa,以7000r/min轉(zhuǎn)速離心60min來濃縮樣品提取液。
6.根據(jù)權(quán)力要求1所述的方法，其特征在于所述步驟4)中制得蛋白沉淀與樣品裂解液的質(zhì)量體積比為 150 μ g/200 μ L-250 μ g/200 μ L。
7.根據(jù)權(quán)力要求1所述的方法，其特征在于所述蛋白沉淀與樣品裂解液的質(zhì)量體積比為優(yōu)選為200 μ g/200 μ L。
8.根據(jù)權(quán)力要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述樣品裂解液含有8mol/L尿素、 0. 02g/mLCHAPS、體積百分含量為 0. 5%的 IPG 緩沖液、0. 002g/mL 溴酚藍、50mmol/L DTT0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白雙向電泳樣品的方法。該方法選取乙酸-乙酸鈉緩沖溶液低溫浸提麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白，通過clean up kit試劑盒來處理樣品提取液，獲得純凈的樣品蛋白沉淀，最后加入樣品裂解液制備出適合雙向電泳的高質(zhì)量樣品。本發(fā)明制備出紹興黃酒熟麥曲中米曲霉胞外分泌蛋白雙向電泳樣品的方法快速可靠、簡單易行，可獲得較高質(zhì)量且重復性較好的雙向電泳圖譜，便于后續(xù)的生物質(zhì)譜分析鑒定蛋白，具有較大的實際應用價值。
文檔編號G01N1/28GK102359900SQ20111027098
公開日2012年2月22日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者張波, 管政兵, 陸健 申請人:江南大學