本發(fā)明涉及生物技術領域，尤其涉及一種分離番茄果實原生質體的方法。

背景技術：

果實作為鮮活的農產品為人類健康提供了豐富的營養(yǎng)，是人們膳食結構中不可缺少的組分。番茄作為研究果實成熟和抗病機理的模式生物，是世界范圍內廣泛種植的第一大蔬菜作物,具有重要的經濟和科研價值。近年來，番茄基因組序列的解讀和群體遺傳學的發(fā)展讓人們能夠能從基因組的角度加深對番茄的了解。隨著功能基因組學、分子生物學研究的不斷深入，果實發(fā)育進程相關的功能基因在細胞中表達的時空特異性及其調控模式得到了廣泛關注，而對基因表達產物的亞細胞定位分析依賴于樣品制備方法的不斷優(yōu)化。與其它模式生物細胞相比，果實細胞具有其特殊性:細胞含水量高，不同成熟度的果實細胞體積和結構具有顯著差異，細胞間隙富含果膠等多糖類物質，而且細胞中富含有機酸、糖類、色素和芳香類物質。因此，以往對果實細胞的顯微觀察并不多見，而且試驗中往往需要對果實進行切片或者刺傷操作，極大地影響了對果實細胞結構和功能的原位無損解析。

技術實現要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種分離番茄果實原生質體的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：

1)用酶液酶解番茄果實，收集酶解后果實組織；

所述酶液包括纖維素酶、果膠酶、離析酶；

2)將所述酶解后果實組織在PME溶液中孵育，即得到番茄果實原生質體，實現番茄果實原生質體的分離；

所述PME溶液包括甘露醇、PIPES、MgCl₂和EDTA。

上述方法中，

所述甘露醇、所述PIPES、所述MgCl₂和所述EDTA的摩爾的量比為30-50：4-6：1-3：1-3；

或所述甘露醇、所述PIPES、所述MgCl₂和所述EDTA的摩爾的量比為40：5：2：1；

或所述甘露醇、所述PIPES、所述MgCl₂和所述EDTA的摩爾的量比為40：4：1：1；

或，所述纖維素酶、所述果膠酶、所述離析酶的質量比為5-10：3-5：3-5；

或，所述纖維素酶、所述果膠酶、所述離析酶的質量比為2：1：1。

上述方法中，

所述PME溶液由300-500mM甘露醇、40-60mM PIPES、10-30mM MgCl₂、10-30mM EDTA和水組成；

或，所述PME溶液由400mM甘露醇、50mM PIPES、20mM MgCl₂、10mM EDTA和水組成；

或，所述PME溶液由400mM甘露醇、40mM PIPES、10mM MgCl₂、10mM EDTA和水組成；

或，所述PME溶液的pH為6-8。

上述方法中，

所述酶液為由纖維素酶、果膠酶、離析酶和GKMMB溶液組成，

所述纖維素酶在所述酶液中的質量百分比為0.5-1％，所述果膠酶在所述酶液中的質量百分比為0.3-0.5％、所述離析酶在所述酶液中的質量百分比為0.3-0.5％；

或所述纖維素酶在所述酶液中的質量百分比為1％，所述果膠酶在所述酶液中的質量百分比為0.4％、所述離析酶在所述酶液中的質量百分比為0.5％；

或，所述纖維素酶在所述酶液中的質量百分比為1％，所述果膠酶在所述酶液中的質量百分比為0.5％、所述離析酶在所述酶液中的質量百分比為0.4％；

或，所述GKMMB溶液由終濃度為300-500mM甘露醇、10-30mM KCl、40-60mM MgSO₄7H₂O、1-3mM MgCl₂、50-150mM MES、質量百分含量為1-3％BSA和水組成；

或，所述GKMMB溶液由終濃度為400mM甘露醇、20mM KCl、60mM MgSO₄ 7H₂O、2mM MgCl₂、50mM MES、質量百分含量為1％BSA和水組成；

或，所述GKMMB溶液由終濃度為400mM甘露醇、20mM KCl、50mM MgSO₄ 7H₂O、2mM MgCl₂、50mM MES、質量百分含量為1％BSA和水組成。

上述方法中，

所述孵育的方式為22-30℃、60rpm震蕩2-5小時。

上述方法中，

所述酶解的溫度為22-30℃，所述酶解的方式為先0.07-0.08MPa保持5分鐘，再在黑暗常壓狀態(tài)下于60rpm震蕩3小時55分，再在黑暗常壓狀態(tài)下于80rpm震蕩5分鐘。

上述方法中，

在所述孵育后，還包括如下步驟:先將孵育后的體系中的果實組織去除，得到細胞孵育液；再將所述細胞孵育液過濾，收集過濾液；再將所述過濾液離心，收集沉淀，得到果實原生質體。

上述方法中，

所述過濾采用的孔徑為100-300μm的細胞篩；

所述離心的條件為22-25℃，150-180g，3-5min。

上述方法中，

所述番茄果實為0.1-1mm厚番茄果實切片。

本發(fā)明另一個目的是提供一種分離番茄果實原生質體的試劑盒。

本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述PME溶液；

或所述試劑盒還包括上述酶液。

本發(fā)明提供的分離番茄果實原生質體的方法，其具有以下優(yōu)點：1)操作簡單、快速：縮短了酶解等前期處理的時間；2)酶解處理后使用PME溶液進行孵育，終止酶解反應并提高原生質體的游離效率，節(jié)省了成本；3)分離效果好，不同大小的果實細胞都能夠得到高效的分離。

實驗證明，采用本發(fā)明提供的方法對番茄果實原生質體進行分離，原生質體得率顯著提高；纖維素酶等的用量減少，達到節(jié)省成本的目的；為深入研究果實發(fā)育相關基因表達模式提供了重要工具。由此可見，酶解處理結合溫和消化技術對番茄果實原生質體進行分離的方法為果實發(fā)育相關蛋白的亞細胞定位以及基因表達模式的深入研究奠定了基礎，實際應用價值高。

附圖說明

圖1為普通光學顯微鏡觀察到的紅熟期番茄果實原生質體。

圖2為普通光學顯微鏡觀察到的綠熟期番茄果實原生質體。

圖3為對比例普通光學顯微鏡觀察到的紅熟期番茄果實原生質體。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所述百分含量如無特別說明均為質量百分含量。

實施例1、紅熟期番茄果實原生質體分離

一、分離所需試劑

纖維素酶的酶活為10u/mg(β-1,4-D-葡聚糖葡糖苷底物下的酶活為10u/mg)，為Yakult Japan公司的產品；

果膠酶的酶活為5u/mg(果膠甲氧酯底物下的酶活為5u/mg)，為Yakult Japan公司的產品；

離析酶的酶活為3u/mg(β-1,4-D-葡聚糖葡糖苷底物下的酶活為5u/mg)，為Yakult Japan公司的產品。

酶液由纖維素酶、果膠酶、離析酶和GKMMB溶液組成，纖維素酶的終濃度為1％(質量百分比)、果膠酶的終濃度為0.5％(質量百分比)、離析酶的終濃度為0.4％(質量百分比)。

上述GKMMB溶液由終濃度為400mM甘露醇、20mMKCl、50mM MgSO₄ 7H₂O、2mM MgCl₂、50mM MES、質量百分含量為1％BSA和水組成。

酶液使用前用0.45μm的微孔濾膜過濾，收集過濾后酶液。

PME溶液由400mM甘露醇、50mM PIPES、20mM MgCl₂、10mM EDTA和水組成，pH為6.9。

二、紅熟期番茄果實原生質體分離

1)將紅熟期番茄果實(Alsa Craig品種)以自來水洗凈后，以雙面刀片切成0.1-1mm厚的薄片；

2)將步驟1)獲得的果實組織浸沒酶液中進行酶解，得到酶解體系，收集酶解體系中的酶解后果實組織。

上述酶解的溫度為25℃，上述酶解過程如下：先抽真空至0.07-0.08MPa保持5分鐘，再在黑暗常壓狀態(tài)下于搖床上60rpm(旋轉半徑5cm)酶解3小時55分，再在黑暗常壓狀態(tài)下?lián)u床上80rpm繼續(xù)震蕩5分鐘。

3)將上述酶解后果實組織浸沒在PME溶液中溫度為25℃、60rpm孵育2小時,得到孵育后體系(由果實組織和細胞孵育液組成)，去除孵育后體系中的果實組織，保留細胞孵育液；

4)將細胞孵育液過孔徑為200μm的細胞篩，收集過濾液；將過濾液離心，收集沉淀，得到果實原生質體。

上述離心條件為25℃，150g，3min。

三、果實原生質體的檢測

W5溶液由154mMNaCl，125mM CaCl₂，5mMKCl，5mM葡萄糖，1.5mM MES和水組成，W5溶液的pH為5.6。

將上述二得到的果實原生質體加入等體積的W5溶液，混勻后于普通光學顯微鏡下檢查原生質體狀態(tài)。

結果如圖1所示，從圖1中可以觀察到大小不等的番茄果實原生質體，可以看出原生質體中細胞結構清晰，胞質流動活躍，可見較多質體和淀粉粒。

對比例：現有實驗方法不包括酶解處理后使用PME溶液進行孵育的步驟，此步驟可以終止酶解反應，并通過溫和消化進一步提高原生質體的游離效率。對比例原生質體分離效果如圖3所示。

實施例2、綠熟期番茄果實原生質體分離

一、分離所需試劑

纖維素酶的酶活為10u/mg(β-1,4-D-葡聚糖葡糖苷底物下的酶活為10u/mg)，為Yakult Japan公司的產品；

果膠酶的酶活為5u/mg(果膠甲氧酯底物下的酶活為5u/mg)，為Yakult Japan公司的產品；

離析酶的酶活為3u/mg(β-1,4-D-葡聚糖葡糖苷底物下的酶活為5u/mg)，為Yakult Japan公司的產品。

酶液為將纖維素酶、果膠酶、離析酶添加到GKMMB溶液中得到的溶液，纖維素酶的終濃度為1％(質量百分比)、果膠酶的終濃度為0.4％(質量百分比)、離析酶的終濃度為0.5％(質量百分比)。

上述GKMMB溶液由終濃度為400mM甘露醇、20mMKCl、60mM MgSO₄ 7H₂O、2mM MgCl₂、50mM MES、質量百分含量為1％BSA和水組成。

酶液使用前用0.45μm的微孔濾膜過濾，收集過濾后酶液。

PME溶液由400mM甘露醇、40mM PIPES、10mM MgCl₂、10mM EDTA和水組成，pH為6.9。

二、綠熟期番茄果實原生質體分離

1)將綠熟期番茄果實(Alsa Craig品種)以自來水洗凈后，以雙面刀片切成0.1-1mm厚的薄片；

2)將步驟1)獲得的果實組織浸沒酶液中進行酶解，得到酶解體系，收集酶解體系中的酶解后果實組織。

上述酶解的溫度為25℃，上述酶解過程如下：先抽真空至0.07-0.08MPa保持5分鐘，再在黑暗常壓狀態(tài)下于搖床上60rpm(旋轉半徑5cm)酶解3小時55分，再在黑暗常壓狀態(tài)下?lián)u床上80rpm繼續(xù)震蕩5分鐘。

3)將上述酶解后果實組織浸沒在PME溶液中溫度為25℃、60rpm孵育2小時,得到孵育后體系(由果實組織和細胞孵育液組成)，去除孵育后體系中的果實組織，保留細胞孵育液；

4)將細胞孵育液過孔徑為150μm的細胞篩，收集過濾液；將過濾液離心，收集沉淀，得到果實原生質體。

5)上述離心條件為25℃，180g，3min。

三、果實原生質體的檢測

W5溶液由150mM NaCl，130mM CaCl₂，4mM KCl，6mM葡萄糖，2mM MES和水組成，W5溶液的pH為5.6。

將上述二得到的果實原生質體加入等體積的W5溶液，混勻后于普通光學顯微鏡下檢查原生質體狀態(tài)。

結果如圖2所示，從圖2中可以觀察到較小的番茄果實原生質體，可以看出原生質體體積較小，細胞結構清晰，胞質流動活躍，可見較多淀粉粒。